多参数流式细胞术分选人骨骼肌源性血管内皮细胞和血管外膜细胞的方法

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0900

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (21): 3357-3364.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0900

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

多参数流式细胞术分选人骨骼肌源性血管内皮细胞和血管外膜细胞的方法

古晶晶¹，杨继辉¹，杨婷婷²，杨小萍¹，郑波³

¹宁夏医科大学，宁夏回族自治区银川市 750004；²宁夏医科大学总医院人类干细胞研究所，宁夏回族自治区银川市 750004；³宁夏医科大学总医院血液科，宁夏回族自治区银川市 750004)

修回日期:2018-06-05 出版日期:2018-07-28 发布日期:2018-07-28
通讯作者: 郑波，博士后，主任医师，教授，硕士生导师，宁夏医科大学总医院血液科，宁夏回族自治区银川市 750004
作者简介:古晶晶，女，1992年生，河南省焦作市人，汉族，宁夏医科大学在读硕士，主要从事造血干细胞与造血微环境方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81560023)；2015年度宁夏留学人员科技活动项目

Sorting human skeletal muscle-derived myoendothelial cells and perivascular stem cells by multiparameter fluorescence-activated cell sorting

Gu Jing-jing¹, Yang Ji-hui¹, Yang Ting-ting², Yang Xiao-ping¹, Zheng Bo³

¹Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; ²Human Stem Cell Institute, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; ³Department of Hematology, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China

Revised:2018-06-05 Online:2018-07-28 Published:2018-07-28
Contact: Zheng Bo, M.D., Chief physician, Professor, Master’s supervisor, Department of Hematology, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
About author:Gu Jing-jing, Master candidate, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81560023; the Overseas Students Science and Technology Project in Ningxia Hui Autonomous Region in 2015

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
肌血管内皮细胞：位于血管壁，共表达肌肉干细胞和血管内皮细胞的标记(CD56⁺CD34⁺CD144⁺CD45^-)，这种血管源性肌肉干细胞被命名为肌血管内皮细胞。近年来越来越多的研究显示，肌血管内皮细胞与间充质干细胞存在相似性，同样具有多能性，有向多个细胞系分化的能力，如成骨细胞系、成软骨细胞系、成脂肪细胞系以及成肌细胞系。
肌血管外膜细胞：位于大、中、小以及毛细血管外壁周围，是血管周微环境重要核心组成成分，可以为其他细胞的生长繁殖提供支持作用，这种细胞可以通过细胞表面标记物(CD146⁺CD45^-CD34^-CD144^-CD56^-)被多参数流式细胞仪分选出来。近年来越来越多的研究显示，间充质干细胞来源于血管外膜细胞，肌血管外膜细胞是一类具有良好前景的间充质干细胞前体源性细胞。
多参数流式细胞分选术：运用不同荧光标记的多种抗体组合对细胞表面或胞内抗原的表达情况进行测量，同时运用流式细胞分选仪，以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒，测量其产生的散射光和发射荧光的强度，从而进行分选的一门技术。

摘要
背景：目前分离骨骼肌源性干细胞广泛应用的方法是差速贴壁培养法，而运用多参数流式细胞术分选人骨骼肌源性干细胞的研究较为少见。
目的：探索利用多参数流式细胞分选术从人体骨骼肌组织中分选高纯度肌源性血管内皮细胞和血管外膜细胞的方法。
方法：收集人体骨骼肌组织，用胶原酶(Ⅰ型和Ⅳ型)及分散酶消化、获得单个核细胞，通过多参数流式细胞分选术分选表型为CD56⁺CD34⁺CD144⁺CD45^-的肌血管内皮细胞和表型为CD146⁺CD45^-CD34^-CD144^-CD56^-的肌血管外膜细胞。
结果与结论：①利用多参数流式细胞分选术分选肌血管内皮细胞和肌血管外膜细胞各14例，肌血管内皮细胞在人骨骼肌单个核细胞中占(0.04±0.01)%，肌血管外膜细胞在人骨骼肌单个核细胞中占(0.30±0.07)%；②将新分选的细胞经过流式细胞仪回测后，肌血管内皮细胞纯度达到(96.8±1.16)%，肌血管外膜细胞纯度达到(92.50±0.50)%，锥虫蓝染色检测肌血管内皮细胞存活率达到(95.58±1.10)%，肌血管外膜细胞存活率达到(95.15±0.67)%；③肌血管内皮细胞和肌血管外膜细胞均能在体外诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞，表明二者具有良好的多向分化能力；④实验建立了利用多参数流式细胞分选术分选肌血管内皮细胞和肌血管外膜细胞的有效方法，经过分选所得的肌血管内皮细胞和肌血管外膜细胞纯度高、活性良好。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID:0000-0002-6768-5273(郑波)

关键词: 人骨骼肌, 肌血管内皮细胞, 肌血管外膜细胞, 多参数流式细胞分选术, 干细胞, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: At present, the preplate method is widely used for the separation of skeletal muscle-derived stem/progenitor cells. However, little is reported on the sorting of human skeletal muscle-derived stem/progenitor cells using multiparameter fluorescence-activated cell sorting (MP-FACS).
OBJECTIVE: To explore the method of sorting high-purity myoendothelial cells and perivascular stem cells from human skeletal muscle tissues by MP-FACS.
METHODS: Human skeletal muscle tissue was collected and digested with collagenase (type I and type IV) and dispase, to collect mononuclear cells. Myoendothelial cells with phenotype (CD56⁺CD34⁺CD144⁺CD45^-) and perivascular stem cells with phenotype (CD146⁺CD45^-CD34^-CD144^-CD56^-) were sorted by MP-FACS.
RESULTS AND CONCLUSION: Fourteen samples of MECs and PSCs were sorted by MP-FACS. Myoendothelial cells and perivascular stem cells accounted for (0.04±0.01)% and (0.30±0.07)% in human skeletal muscle mononuclear cells, respectively. After the freshly sorted cells were re-analyzed by flow cytometry, the purity of myoendothelial cells and perivascular stem cells was up to (96.80±1.16)% and (92.50±0.50)%, respectively, and the survival rate of myoendothelial cells and perivascular stem cells reached (95.58±1.10)% and (95.15±0.67)%, respectively. After primary culture, myoendothelial cells and perivascular stem cells grew well, and furthermore, they could be successfully induced to differentiate into osteoblasts and adipocytes in vitro, respectively, indicating that myoendothelial cells and perivascular stem cells have good multi-differentiation ability. To conclude, the myoendothelial cells and perivascular stem cells obtained by MP-FACS have high purity and good activity.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Muscle, Skeletal, Endothelial Cells, Flow Cytometry, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

古晶晶，杨继辉，杨婷婷，杨小萍，郑波 . 多参数流式细胞术分选人骨骼肌源性血管内皮细胞和血管外膜细胞的方法[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(21): 3357-3364.

Gu Jing-jing, Yang Ji-hui, Yang Ting-ting, Yang Xiao-ping, Zheng Bo. Sorting human skeletal muscle-derived myoendothelial cells and perivascular stem cells by multiparameter fluorescence-activated cell sorting[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(21): 3357-3364.

图/表（结果） 3

2.1 人骨骼肌单个核细胞分离 共分离人骨骼肌肉组织14例，男8例，女6例，年龄(46.36±18.61)岁(20-77岁)；分离肌肉质量为(4.67±1.06) g；每克肌肉可分离出单个核细胞(2.63±0.34)×10⁶。分离步骤可参照图1。

2.2 多参数流式分选图 将抗体标记好的样本上机，根据空细胞管、同型对照管和单阳管校正FACS参数。首先根据7AAD选出活细胞(图2A)，再根据前向和侧向散射角圈定细胞群(图2B)，通过多色标记，从圈定的细胞群中先选出CD45^-细胞(图2C)，然后从CD45^-细胞选出CD56^-和CD56⁺细胞(图2D)，从CD56⁺细胞群中选出CD34⁺CD144⁺细胞群即CD56⁺CD34⁺CD144⁺CD45^-的MECs(图2G)，从CD56^-细胞群中选出CD34^-CD144^-细胞群(图2E)，再从CD34^-CD144^-细胞群中选出CD146⁺细胞群即CD146⁺CD45^-CD34^-CD144^-CD56^-的PSCs(图2F)。对14例多参数流式细胞分选结果进行统计：MECs阳性率为(0.04± 0.01)%，分选得到细胞数为(1.22±0.34)×10⁴；PSCs阳性率为(0.30±0.07)%，分选得到细胞数为(3.49±0.79)×10⁴(表1)。

2.3 新分选后MECs和PSCs回测纯度 吸取新分选的MECs和PSCs悬液各100 µL，用DPBS稀释成300 µL，上机对分选后的细胞进行纯度回测。MECs回测纯度为98.1%(图3A)，PSCs回测纯度为92.6%(图3B)。对FACS的14例MECs和PSCs均进行纯度回测，统计得MECs纯度为(96.80±1.16)%，PSCs纯度为(92.50±0.50)%(表1)。

2.4 新分选MECs和PSCs存活率 用细胞计数板计数并根据被锥虫蓝染色的细胞为死细胞，未被染色的细胞为活细胞来计算存活率。对FACS的14例MECs和PSCs均进行存活率测定，统计得MECs存活率为(95.58±1.10)%，PSCs存活率为(95.15±0.67)%(表1)。

2.5 分选出的MECs和PSCs的细胞形态 倒置相差显微镜下观察细胞形态，刚分选的细胞呈圆球型、透亮、均匀分布在培养板中(图4A，B)；3 d左右，培养板中贴壁生长的长梭形细胞，细胞两端较长突起，胞体中央膨大，为细胞核；培养至7 d左右，细胞形态逐渐变为均一的长梭形，胞质丰富(图4C，D)；14 d左右细胞融合达70%-80%，可进行传代继续培养。目前已经传代至第8代，细胞状态良好，形态规则。

2.6 MECs和PSCs向成骨细胞和成脂细胞诱导分化鉴定结果 MECs和PSCs分别在成骨细胞和成脂细胞诱导剂下培养，能成功诱导为成骨细胞和成脂细胞。成骨诱导后实验组茜素红染色呈阳性反应，胞质内可见到大量暗红色颗粒状样物质(图5A，E)，证实为钙盐沉积，而对照组(未进行成骨诱导)在镜下并未见到暗红色颗粒状物质(图5B，F)；成脂诱导后实验组油红O染色可见胞浆内有大量红色的脂滴形成(图5C，G)，而对照组(未进行成脂诱导)镜下观察未见有红色脂滴形成(图5D，H)。以上结果证明MEC和PSCs具有良好的多向分化能力。

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引言

流式细胞分选术是利用流式细胞分选仪，以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒，测量其产生的散射光和发射荧光的强度，从而进行分选^[1-5]。流式细胞分选术是现代最先进的细胞定量分析技术之一，其优点是：①测量耗时短；②可进行多参数测量；③既可进行细胞分析，又可进行精确的细胞分选^[6-10]。

肌肉组织是人体中最大的器官，占人体总质量的36%-42%，并且相对容易和安全地获得。在骨骼肌组织里储存有多种干细胞，它们可以修复肌肉损伤及肌肉障碍性疾病^[11-18]。肌源性干细胞包括卫星细胞、肌源性干/祖细胞、肌血管外膜细胞(perivascular stem cells，PSCs)、肌血管内皮细胞(myoendothelial cells，MECs)、多能成年祖细胞和侧群细胞等。肌源性干细胞最早是由Petersen等于2002年发现，通过差速贴壁法将小鼠骨骼肌内一群成肌性强、高扩增能力的肌源性干细胞分离出来^[19]。PSCs位于大、中、小以及毛细血管外壁周围，是血管周微环境重要核心组成成分，参与血流调节、血管生成，可以为其他细胞的生长繁殖提供支持作用，以及调节机体的免疫状态和免疫防御等^[20-24]。近年来越来越多的研究显示，PSCs是一类具有良好前景的间充质干细胞前体源性细胞。人骨骼肌肉源性PSCs在细胞表型、分化能力等方面与间充质干细胞具有相似性，或许是间充质干细胞更原始的前体细胞^[25-26]。此外，有研究发现MECs位于血管内壁，共表达肌肉干细胞和血管内皮细胞的标记^[25^，^27]。研究显示，MECs与间充质干细胞存在相似性，同样具有多能性，能分化形成机体组织细胞，如骨组织细胞、软骨组织细胞和肌肉细胞；MECs培养后表达间充质干细胞的表面标志CD90，CD105，CD29，CD44和CD146^[25]。另外Crisan等^[20]和Zheng等^[25]对人MECs和PSCs这2种多能干细胞亚群进行鉴定，其表现出能向多谱系中胚层发育的潜能。因此，纯化出大量的MECs和PSCs，对未来干细胞实验研究和临床应用奠定了基础。目前有关于肌源性干细胞的研究多在小鼠中进行，而通过流式细胞分选术分选MECs国内尚未有报道，分选PSCs国内有个例报道，且标本种属以及分选参数不同^[10^，^28]。该实验研究通过利用多参数流式术分选的手段，探讨获取人骨骼肌来源MECs和PSCs的方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学体外实验。

1.2 时间及地点 于2017年7月至2018年3月在宁夏医科大学总医院人类干细胞研究所完成。

1.3 材料 标本来源于宁夏医科大学创伤骨科手术中清除的肌肉组织(n=14)。实验方案经医院医学伦理委员会批准且捐献者及家属知情同意。

实验试剂和设备：胶原酶Ⅰ型、胶原酶Ⅳ型、分散酶、青霉素/链霉素(Invitrogen公司)；红细胞裂解液(eBioscience公司)；鼠血清(Sigma公司)；胎牛血清(Biological Industries公司)；马血清、成骨诱导培养基、成脂诱导培养基、高糖型DMEM培养基(Gibco公司)；EGM-2(Lonza公司)；鸡胚提取物(Gemini公司)；小鼠抗人CD45 APC-H7抗体、小鼠抗人CD34 APC标记、小鼠抗人 CD144 PE抗体、小鼠抗人CD56 PE-Cy7抗体、小鼠抗人 CD146 FITC抗体、小鼠APC-H7 IgG1抗体、小鼠APC IgG1抗体、小鼠PE IgG1抗体、小鼠PE-Cy7 IgG1抗体、小鼠FITC IgG1抗体、7-AADViaProbe、流式细胞分析专用鞘液、CS&T Research Beads、Accudrop荧光校准微球、BD FACSAria Ⅲ流式细胞仪(BD Biosciences公司)；茜素红试剂盒、油红O试剂盒(北京索莱宝公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 人骨骼肌单个核细胞分离 ①手术室获取的新鲜肌肉组织浸泡于含有无菌HBSS的50 mL离心管中，快速运输至实验室，运输过程中注意防止污染；②到达实验室后，在提前准备好的超净台内将肌肉放置于100 mm×20 mm培养皿中，用无菌剪刀和镊子去除脂肪、血管、肌腱等结缔组织，留下肌肉并称质量，记录标本的质量；③然后将处理好的标本移入50 mL离心管，加入含有体积分数10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的DMEM培养液，肌肉标本在4 ℃冰箱中可保存5-7 d；④行多参数流式细胞分选当天，将肌肉从4 ℃冰箱中取出，在提前准备好的超净台内将肌肉放置于100 mm×20 mm培养皿中，将保存肌肉的含有体积分数10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的DMEM培养液也移入其中，用无菌剪刀和镊子将肌组织剪碎至约1 mm³大小，能顺利通过10 mL移液管即可；⑤将剪碎的标本用10 mL移液管移至50 mL离心管中，1 500 r/min离心5 min，去上清；⑥用10 mL移液管将每2.0-3.0 g的肌肉标本移至30 mL消化液中(消化液由HBSS和Ⅰ型胶原酶、Ⅳ型胶原酶、分散酶组成，酶的终质量浓度分别为100，100，1.2 mg/L)，然后放至台式恒温振荡器中，37 ℃ 60 r/min消化1.0-2.0 h，每隔20 min取出标本置于超净台中，用移液管吹打10次，并观察消化情况。当观察到块状组织消融，消化如浆液状即可，具体消化时间可根据消化程度进行调整；⑦消化完全后，加入大约10 mL含体积分数10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的DMEM培养液终止消化，1 500 r/min 离心5 min，小心去上清；⑧将组织重悬于大约10 mL含体积分数10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的DMEM培养液中，用移液管吸取离心好的组织通过70 µm滤过膜滤过，滤过过程中用含体积分数10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的DMEM培养液冲洗，并不停的旋转移液管，使滤过充分；⑨将过滤好的组织标本1 500 r/min离心 5 min，小心去上清。将细胞重悬于1 mL红细胞裂解液中，反复吹打混匀，室温放置10 min，然后1500 r/min离心5 min，去上清，最后重悬于1 mL DPBS中，过40 µm滤过膜滤过后计数(也可上机前进行)。

1.4.2 样本抗体标记 ①将上述获得的细胞悬液，加入鼠血清(鼠血清∶细胞悬液体积比为1∶20)，然后冰上孵育20-30 min，用细胞计数板进行计数；②设置样本管：调整细胞浓度为1×10¹⁰ L^-1的单细胞悬液200 µL，将CD34-APC，CD45-APC-Cy7，CD56-PE-Cy7，CD144-PE和CD146-FITC各1 µL加入样本管中；③设置对照管(同型对照1管、单阳5管、单阴5管和空细胞1管)，分别调整细胞浓度为1×10⁸ L^-1的单细胞悬液100 µL，将APC-，APC-Cy7-，PE-Cy7-，PE-和FITC-结合的同种型IgG抗体各1 µL加入同型对照管；④分别将CD34-APC，CD45-APC-H7，CD56-PE-Cy7，CD144-PE，CD146-FITC各1 µL加入各个单阳管中，同时设置单阴管；空细胞管不加任何抗体；另外设置对应的补偿微球管；⑤抗体标记好后，在4 ℃冰上孵育20-30 min，然后1 500 r/min离心5 min洗涤；⑥将样本管细胞重悬在500 µL含体积分数为2%胎牛血清的DPBS中，同型对照管、单阳管细胞重悬于300 µL含体积分数为2%胎牛血清的DPBS中，然后转移至圆底聚苯乙烯流式管中；⑦上机前加入7-AAD ViaProbe(每10⁶-10⁷个细胞加20 µL)并在冰上孵育10 min；⑧准备2管细胞收集管(每个管预先分别加入MECs和PSCs的培养基500 µL)；⑨将标本放在冰上，送至上机。

1.4.3 细胞分选 ①通过CST质控，仪器状态正常，并做无菌管路制备；②主液流设置：安装85 µm的喷嘴，打开主液流断点窗的stream按钮，调节液滴振幅(Ampl)，使液流断点位置位于窗口中上部(1/3处)，第1液滴的值落在220左右，液滴间隔值(Gap)尽量恒定；③侧液流设置：打开侧液流窗电压，激活分选测试窗，点击Test sort按钮，调节主液流窗中的Ampl，使四束偏转液流和废液流5个光斑间距拉开。打开分选窗，点开分选门，调节各路电压条，使偏转的分选液流落入分选对应的收集管中；④手动确定液滴偏转延迟：建立一个新的文件夹，再建立两个子文件夹(Specimen和Tube)，在电脑的通用工作页面建立获取模板，用横轴FFC和纵轴SSC建立一个散点图，并设单个微球的矩形门P1。点击Tube使其变为绿色的采集箭头，打开分选窗口，在Device窗口中将选项设为2 Tube。点击Load按钮上样Accudrop beads，调整流速为2 000-4 000 events/s，打开分选电压，调整Drop delay值，使左框中粗调和细调的光斑值均≥99%；⑤样本分析：建立Experiment名为stem cells，并在通用工作页面(Global sheet)建立获取模版。上样本，调试各参数的电压、补偿后获取数据，圈定需要分选的细胞MECs和PCSs；⑥分选：分选装置设置为4路分选模式，采用其中两路进行分选，并命名为MECs和PCSs。分选采用低速(流速为1-2)分选，使细胞以较低的流速运行；⑦分选后分别用清洗液和无菌水对管路进行彻底冲洗。

1.4.4 分选后MECs和PSCs纯度的测定 吸取分选后的MECs和PSCs悬液各100 µL，用DPBS稀释成300 µL，上机对分选后的细胞进行纯度回测。

1.4.5 分选后MECs和PSCs存活率测定 将分选后的MECs和PSCs悬液进行1 500 r/min离心5 min，去上清，加入1 mL DPBS重悬。各取20 µL细胞悬液与20 µL 0.2%锥虫蓝染液按1∶1体积比混匀，加样至计数板在显微镜下观察，计数及计算存活率。

1.4.6 分选出原代的MECs和PSCs进行体外培养 将FACS分选出的MECs和PSCs收集至5 mL含有体积分数为10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的DMEM培养液的离心管中，1 500 r/min 离心5 min，去上清，分别加入MECs培养基(含体积分数为10%胎牛血清、体积分数为10%马血清、0.5%鸡胚提取物、1%青霉素/链霉素的DMEM培养液)和PSCs培养基(EGM-2)，接种在胶原包被的96孔板中，放置于体积分数为5%CO₂、37 ℃恒温培养箱中进行培养，4-7 d换液。培养两三周，当细胞培养至70%融合时，使用胰蛋白酶消化传代，继续培养在胶原包被的24孔板中，之后每一两周细胞传代1次，分别传到胶原包被的6孔板，胶原包被的T25培养瓶，最后传到无胶原包被的T75培养瓶。MECs一直在MECs培养基中培养，而PSCs在第1代时转换为含体积分数为20%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的高糖DMEM培养基进行培养。

1.4.7 MECs和PSCs体外定向诱导分化(诱导成骨、成脂分化) 取第3-8代MECs和PSCs，以(1.0-3.0)×10⁴/cm²的密度种于24孔板中，实验组和对照组各设置3孔，分别加入MECs培养基(含体积分数为10%胎牛血清、体积分数为10%马血清、0.5%鸡胚提取物、1%青霉素/链霉素的DMEM培养液)和PSCs培养基(含体积分数为20%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的DMEM培养液)，放置于体积分数为5%CO₂、37 ℃饱和湿度培养箱中培养，24-48 h之后，当细胞融合60%-80%时，分别将MECs和PSCs阳性组培养基更换为成骨或成脂诱导培养基，3 d或4 d换1次液，7-14 d后，分别用茜素红和油红O试剂盒染色进行鉴定。

1.5 主要观察指标 ①利用多参数流式细胞术从人骨骼肌肉中分选出MECs和PSCs，统计阳性率、纯度、数量等；②分选后MECs和PSCs的纯度；③MECs和PSCs向成骨细胞和成脂细胞诱导分化能力。

1.6 统计学分析 所有数据采用x(_)±s表示，用SPSS 19.0软件系统处理数据，未使用到统计方法对参数进行对比分析。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

干细胞能不断地自我更新并且具有多向分化的潜能，可表达多种特异性细胞标志，成为研究的热点。肌源性干细胞是一类在肌肉中发现的干细胞群，具有体外增殖快、移植后存活率高等特点，可作为种子细胞应用于组织工程领域中。许多基础研究已经证实了肌源性干细胞可向平滑肌细胞、脂肪细胞、骨骼细胞、软骨细胞、造血细胞和神经细胞等分化^[29-35]。目前实验研究多采用小鼠骨骼肌来源组织分离肌源性干/祖细胞，人骨骼肌组织来源则涉及较少。该研究是探索人骨骼肌源性干/祖细胞的分离和纯化，即将获取的人骨骼肌肉组织，在无菌条件下将其剪碎，并用酶消化法进行消化，使人骨骼肌肉组织消化成单细胞悬液，使用Ⅰ型胶原酶、Ⅳ型胶原酶，可使纤维结缔组织快速、充分消化，肌源性干祖细胞能够充分分离；分散酶是一种较温和的分离酶，对细胞损伤小，同时对肌肉组织进行充分的离散。通过酶消化法，有80%-90%的肌源性干/祖细胞能够被分离，且分离所需时间短，但是通过酶消化法分离获得的细胞并非单纯的肌源性干/祖细胞，常会含有血细胞、血管内皮细胞以及成纤维细胞等其他细胞，因此为保证后续实验顺利实施，对分离的肌源性干/祖细胞进行纯化显得尤为重要。目前应用广泛的是差速贴壁培养法，将未贴壁的肌源性干细胞悬液接种于新的培养瓶中，重复此操作直至肌源性干细胞纯化^[36]，但此法步骤繁琐，细胞污染的概率较大，细胞纯化耗时较长。若预贴壁的时间过长会降低肌源性干细胞的产出率，时间过短易混入非肌源性成分，影响了后续实验的进行以及肌源性干细胞的纯度。最重要的是该方法适合于小鼠肌源性干细胞的纯化，而不能应用于人骨骼肌源性干/祖细胞的纯化，可能与种属不同有关^[25]。

多参数流式细胞术(multiparameter fluorescence- activated cell sorting，MP-FACS)是现代细胞分选领域重要技术之一。流式细胞仪的分选功能主要是由细胞分选器来完成，其原理是由喷嘴喷射出的液流柱在电信号作用下发生振动，断裂形成小液滴，系统根据不同荧光标记的多种抗体组合对细胞表面或胞内抗原的表达情况判断细胞是否被分选，然后电路对选定的细胞液滴充电，带电液滴便携带细胞落入收集管中^[37-40]。相对差速贴壁法，流式细胞仪筛选法分离的肌源性干/祖细胞纯度高，耗时短，细胞污染的概率也小。实验通过酶消化法将人骨骼肌制成单细胞悬液，使肌源性干/祖细胞尽可能的从肌肉中分离出来。然后，对单细胞悬液进行抗体标记，上机进行分选肌源性干/祖细胞。多参数流式细胞术分选出高纯度的MECs和PSCs，可分别达到(96.80±1.16)%，(92.50±0.50)%，存活率也达到(95.58±1.10)%，(95.15±0.67)%。经过培养后，细胞状态良好，能稳定传代，保障了后续实验的细胞质量，且能在体外将其成功诱导为成骨细胞和脂肪细胞，表明MEC和PSCs具有良好的多向分化能力。因此多参数流式细胞术可作为分选MECs和PSCs的有效方法。

实验通过FACS分选MECs的阳性率以及分选后获取的细胞数量比国外研究结果略低，但纯度略高，这些不同可能与实验条件、样本的个体差异等因素有关^[6^，^25]。通过FACS分选PSCs的阳性率与国外研究结果相当，分选后获取的细胞数量比国外研究结果略微偏低，可能与国外研究肌肉标本多来自于器官捐献中心的儿童以及胎儿有关，由此可见MECs和PSCs阳性率以及分选后获取的数量与捐献者的年龄、性别以及肌肉质量密切相关^[20]。为了获得人骨骼肌源性干/祖细胞分选和纯化的最佳结果，当前方案中需要关注一些关键步骤：①人骨骼肌肉组织标本从取材到消化的时间尽量缩短，标本保存的时间尽量不要超过7 d；②若不能马上处理标本，应使用含高浓度血清的培养基保存，并置于4 ℃低温；③肌肉标本处理时，脂肪、韧带、大血管等组织应尽量剔除干净，减少其他组织的干扰；④肌肉标本消化的程度应准确把握，若消化时间不够，会导致肌源性干/祖细胞不能完全消化下来，产出率低，若消化时间过长，会破环表面抗原的保存；⑤上机之前，一定要用70 µm和40 µm滤过膜滤过，以免细胞悬液堵塞细胞分选管；⑥抗体标记结束后应尽快上机，并精确校准流式细胞仪。但是，运用FACS来分选细胞价格较贵，另外若分选时流式细胞仪的压力过高、流速过快会对细胞有轻微损伤，所以分选细胞时控制流式仪的压力与流速非常关键。分选不同种细胞对于流式细胞仪的压力与流速的具体要求将会在后续实验中做进一步探讨。

总之，MP-FACS是一种高效、迅速、稳定分选肌源性干/祖细胞的方法，可以分选出纯度较高、活性良好的MECs和PSCs，并排除了其他细胞对实验结果的干扰，为分选肌源性干/祖细胞提供了有效的方法。

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多参数流式细胞术分选人骨骼肌源性血管内皮细胞和血管外膜细胞的方法

Sorting human skeletal muscle-derived myoendothelial cells and perivascular stem cells by multiparameter fluorescence-activated cell sorting

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