高低转移潜能肝癌在骨髓间充质干细胞干预前后的Gd-RGD成像

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0899

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (21): 3341-3348.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0899

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高低转移潜能肝癌在骨髓间充质干细胞干预前后的Gd-RGD成像

李天然¹，黄晓斌²，杨志杰²，卢光明³，李延军³，禹名卉¹

¹解放军总医院第一附属医院放射科，北京市 100048；²解放军第九五医院放射科，福建省莆田市 351100；³解放军南京总医院医学影像科，江苏省南京市 210000

修回日期:2018-03-21 出版日期:2018-07-28 发布日期:2018-07-28
通讯作者: 李天然，主任医师，解放军总医院第一附属医院放射科，北京市 100048
作者简介:李天然，男，1970 年生，黑龙江省富锦市人，汉族，2009 年解放军医学院毕业，博士，2012 年北京大学医学部博士后，主任医师，主要从事肝癌分子影像学研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81271607)；国家博士后基金(2015M572810)

Hepatocellular carcinoma with high and low metastatic potential before and after bone marrow mesenchymal stem cell transplantation: a MRI imaging study using Gd-RGD probe

Li Tian-ran¹, Huang Xiao-bin², Yang Zhi-jie², Lu Guang-ming³, Li Yan-jun³, Yu Ming-hui¹

¹Department of Radiology, No. 1 Affiliated Hospital of Chinese PLA General Hospital, Beijing 100048, China; ²Department of Radiology, Chinese PLA 95^th Hospital, Putian 351100, Fujian Province, China; ³Department of Radiology, Chinese PLA Nanjing General Hospital, Nanjing 210000, Jiangsu Province, China

Revised:2018-03-21 Online:2018-07-28 Published:2018-07-28
Contact: Li Tian-ran, Department of Radiology, No. 1 Affiliated Hospital of Chinese PLA General Hospital, Beijing 100048, China
About author:Li Tian-ran, M.D., Associate chief physician, Department of Radiology, No. 1 Affiliated Hospital of Chinese PLA General Hospital, Beijing 100048, China
Supported by:
The national Natural Science Foundation of China, No. 81271607; the Post-doctor Foundation of China, No. 2015M572810

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
骨髓间充质干细胞在肝脏疾病治疗中的应用：是骨髓来源的非造血基质细胞，包括3个主要群体，即造血干细胞、内皮祖细胞和间充质干细胞，其在体内外特定微环境中能诱导分化为有功能的肝(样)细胞，对受损肝脏有修复作用，为各种肝脏疾病的治疗提供了新的治疗方法。
精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)：RGD三肽最早在20世纪80年代初期被发现，是一类含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的短肽，在细胞黏附中具有重要作用。RGD序列为纤维连接蛋白与受体的结合位点，具有良好的生物活性和肿瘤靶向性，属于大分子物质，能延长分子旋转相关时间，优化多个对比剂参数，提高弛豫率，在肿瘤诊断与治疗领域具有重要的研究价值。

摘要
背景：随着现代分子影像学的进步，使骨髓间充质干细胞干预肿瘤效能的实时监测成为可能。
目的：构建新型转移相关MRI分子影像探针Gd-RGD，通过MRI成像在体观察骨髓间充质干细胞干预前后肝癌转移和增殖行为的变化。
方法：构建MR转移相关因子分子影像探针整合素α_vβ₃配体cRGD-PEG-DGL-DTPA-Gd(Gd-RGD)，并进行¹H-MRS及ICP-AES分析鉴定。制作高转移潜能MHCC97-H和低转移潜能MHCC97-L肝癌动物模型，尾静脉注射骨髓间充质干细胞悬液干预6周，计算肿瘤质量抑制率。骨髓间充质干细胞干预后分别用Gd-DTPA和Gd-RGD两种示踪剂进行MRI成像实验，以SNR和CNR为半定量指标。将MHCC97-H和MHCC97-L与骨髓间充质干细胞进行Transwell共培养，置于37 ℃，体积分数为5% CO₂培养箱内培养48 h后采用qPCR法检测转化生长因子β1、骨桥蛋白、整合素亚单位α_v和β₃的表达。
结果与结论：①经骨髓间充质干细胞干预后，肝癌肿瘤组织质量明显降低。在第3周时，肿瘤质量抑制率最高；②对于高转移潜能肝癌(MHCC97-H)，骨髓间充质干细胞干预后Gd-RGD成像SNR和CNR低于骨髓间充质干细胞干预前(P < 0.05)。对于低转移潜能肝癌(MHCC97-L)，骨髓间充质干细胞干预前后Gd-RGD成像SNR比较差异无显著性意义(P > 0.05)，骨髓间充质干细胞干预后CNR低于骨髓间充质干细胞干预前(P < 0.05)；③骨髓间充质干细胞干预后Gd-RGD成像SNR在高、低转移潜能肝癌之间差异有显著性意义(P < 0.05)；Gd-DTPA成像SNR和CNR差异不如Gd-RGD成像差异显著；④高转移潜能细胞(MHCC97-H)与骨髓间充质干细胞共培养后，骨桥蛋白、整合素亚单位β₃、转化生长因子β1表达有明显的下降(P < 0.05)，而α_v表达无明显变化(P > 0.05)。低转移潜能细胞(MHCC97-L)与骨髓间充质干细胞共培养后，骨桥蛋白、β₃、转化生长因子β1、α_v表达均下降(P < 0.05)；⑤结果表明，MRI成像中Gd-DTPA和Gd-RGD示踪剂CNR指标可以很好地区分两种具有高低转移潜能肝癌组织，在骨髓间充质干细胞干预后MRI成像中Gd-DTPA和Gd-RGD示踪剂SNR、CNR指标均可以很好地区分两种具有高低转移潜能肝癌组织，且Gd-RGD效果更优。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-7033-2092(李天然)

关键词: 骨髓间充质干细胞, 高转移潜能肝癌细胞, 低转移潜能肝癌细胞, 整合素, Gd-RGD, Gd-DTPA, 干细胞, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: With the advancement of modern molecular imaging, possibilities to monitor the efficacy of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) against tumors have been achieved.
OBJECTIVE: To construct a novel metastasis-associated MRI molecular imaging probe, Gd-RGD, and to observe metastasis and proliferation of hepatocellular carcinoma (HCC) before and after intervention with BMSCs using MRI imaging
.METHODS: The metastasis-associated MR molecular imaging probe, integrin α_vβ₃ ligand cRGD-PEG-DGL-DTPA-Gd (Gd-RGD), was constructed, and the ingredient analysis and identification were implemented through ¹H-magnetic resonance spectroscopy (¹H-MRS) and inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry (ICP-AES) methods. MHCC97-H and MHCC97-L animal models were established. After BMSCs intervention was administrated via the tail vein for 6 weeks, tumor weight inhibition rate was calculated. MRI imaging with a metastasis-associated integrin ligand RGD molecular probe was performed. Molecular imaging probe Gd-DTPA was taken as control. Signal noise ratio (SNR) and contrast to noise ratio (CNR) of MRI were taken as semi-quantitative indicators. MHCC97-H and MHCC97-L animal models before BMSCs intervention were co-cultured with BMSCs using Transwell method. Quantitative PCR method was used to detect proliferation and metastasis-associated indicators, tumor growth factor β1 (TGF-β1), osteopontin, integrin subunits α_v and β₃.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) After BMSCs transplantation, the tumor tissue weight of HCC decreased obviously, and the tumor weight inhibition rate was peaked in the 3^rd week. (2) For high metastatic potential (MHCC97-H), both SNRs and CNRs of Gd-RGD MR imaging before and after BMSCs intervention were statistically different (P < 0.05). For low metastatic potential (MHCC97-L), SNRs of Gd-RGD MR imaging before and after BMSCs intervention were not statistically different (P > 0.05), while CNRs were statistically different (P < 0.05). (3) SNRs of Gd-RGD MRI were significant different between MHCC97-L and MHCC97-H after transplantation (P < 0.05), while SNRs and CNR of Gd-RGD MRI changed significantly as compared with those of Gd-DTPA after cell transplantation. (4) In MHCC97-H cells co-cultured with BMSCs, the osteopontin, integrin subunits α_v and β₃ and TGF-β1 expression significantly decreased (P < 0.05), but integrin subunit αv expression did not change obviously (P > 0.05). In MHCC97-L cells co-cultured with BMSCs, OPN, β₃, TGFβ1 and α_v expression significantly decreased (P < 0.05). These findings reveal that the CNR index of MR imaging in two kinds of tracers is a good indicator to distinguish high and low potential HCC tissues. After BMSCs transplantation, the SNR and CNR indexes of Gd-DTPA and Gd-RGD can both distinguish high and low potential HCC tissues, and Gd-RGD imaging can achieve a more accurate distinction compared with Gd-DTPA.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Liver Neoplasms, Integrin alphaVbeta3, Magnetic Resonance Imaging, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

李天然，黄晓斌，杨志杰，卢光明，李延军，禹名卉. 高低转移潜能肝癌在骨髓间充质干细胞干预前后的Gd-RGD成像[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(21): 3341-3348.

Li Tian-ran, Huang Xiao-bin, Yang Zhi-jie, Lu Guang-ming, Li Yan-jun, Yu Ming-hui. Hepatocellular carcinoma with high and low metastatic potential before and after bone marrow mesenchymal stem cell transplantation: a MRI imaging study using Gd-RGD probe[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(21): 3341-3348.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析 60只健康Balb/c裸鼠均进入结果分析。

2.2 BMSCs干预前后MHCC97-H肿瘤Gd-RGD和Gd-DTPA成像结果分析 MHCC97-H细胞接种于裸鼠腋窝处，MRI 增强采用T1WI成像序列，先T1WI平扫，后行CE-T1WI成像(图1，2)。由图可见，MHCC97-H肿瘤组织位于腋窝处，肿瘤组织分别行Gd-DTPA和Gd-RGD成像。肝癌组织在BMSCs干预前后Gd-RGD强化程度低于Gd-DTPA。计算定量指标SNR和CNR(图3，4)，结果显示，BSMCs干预前后Gd-DTPA成像SNR和CNR均高于Gd-RGD成像(P < 0.05)。

2.3 BMSCs干预前后MHCC97-L肿瘤模型Gd-RGD和Gd-DTPA成像结果分析 MHCC97-L细胞接种于裸鼠腋窝处，MRI 增强采用T1WI成像序列，先T1WI平扫，后行CE-T1WI成像(图5，6)，可见MHCC97-L肿瘤位于腋窝处，肿瘤组织分别行Gd-DTPA和Gd-RGD成像。肝癌组织在BMSCs干预前后，Gd-RGD强化程度低于Gd-DTPA。肝脏组织Gd-RGD强化程度也低于Gd-DTPA。计算定量指标SNR和CNR(图7，8)，结果显示，BSMCs干预前后Gd-DTPA对照组成像SNR和CNR均高于实验组Gd-RGD成像(P < 0.05)。

2.4 BMSCs干预肝癌组织前后MRI图像对比分析 采用SNR和CNR作为半定量指标，分析肿瘤组织在BMSCs干预前后两种示踪剂对肿瘤成像结果(表3)。

BMSCs干预6周后，行Gd-RGD和Gd-DTPA成像。Gd-RGD成像SNR分析结果显示，MHCC97-H和MHCC97-L差异无显著性意义(P > 0.05)，而BMSCs干预后，MHCC97-L SNR高于MHCC97-H，差异有显著性意义(P < 0.05)；Gd-DTPA成像SNR结果与Gd-RGD结果相同。Gd-RGD成像CNR分析结果显示，MHCC97-L CNR高于MHCC97-H，差异有显著性意义(P < 0.05)，同样，BMSCs干预后，MHCC97-L CNR高于MHCC97-H，差异有显著性意义(P < 0.05)；Gd-DTPA成像CNR结果与Gd-RGD结果相同。

对于高转移潜能肝癌(MHCC97-H)，BMSCs干预前后Gd-RGD成像SNR和CNR比较差异有显著性意义(P < 0.05)。而BMSCs干预前后Gd-DTPA成像SNR比较差异无显著性意义(P > 0.05)，CNR差异有显著性意义(P < 0.05)。

对于低转移潜能肝癌(MHCC97-L)，BMSCs干预前后Gd-RGD成像SNR比较差异无显著性意义(P > 0.05)，CNR比较差异有显著性意义(P < 0.05)。而BMSC干预前后Gd- DTPA成像SNR和CNR比较差异均无显著性意义(P > 0.05)。

2.5 高、低转移潜能肝癌组织(MHCC97-H和MHCC97-L)在BMSCs干预前后肿瘤质量变化 从BMSCs干预后第2周开始后观察(图9，10)。经BMSCs干预后，肿瘤质量降低，表明BMSCs对肝癌组织增殖能力具有抑制作用。实验结果显示MHCC97-H第2周肿瘤质量抑制率为22.71%，第3周为42.86%，第4周为34.48%，第5周为31.60%，第6周为29.17%。MHCC97-L第2周肿瘤质量抑制率为26.62%，第3周为52.00%，第4周为38.20%，第5周为31.98%，第6周为30.23%。结果显示，肿瘤在第3周时肿瘤质量抑制率最高，且BMSCs对MHCC97-L肿瘤的抑制率高于对MHCC97-H肿瘤的抑制率。

2.6 BMSCs与肝癌细胞共培养前后转移相关因子骨桥蛋白、α_v、β₃、转化生长因子β1基因表达 见表4。高转移潜能细胞(MHCC97-H)与BMSCs共培养后骨桥蛋白、β₃、转化生长因子β1表达明显下降(P < 0.05)，而α_v表达无明显变化(P > 0.05)。低转移潜能细胞(MHCC97-L)与BMSCs共培养后骨桥蛋白、β₃、转化生长因子β1、α_v表达下降，差异有显著性意义(P < 0.05)。

参考文献

[1] Niess H, Bao Q, Conrad C, et al. Selective targeting of genetically engineered mesenchymal stem cells to tumor stroma microenvironments using tissue-specific suicide gene expression suppresses growth of hepatocellular carcinoma. Ann Surg. 2011; 254(5):767-774.

[2] Liu C, Liu Y, Xu XX, et al. Mesenchymal stem cells enhance the metastasis of 3D-cultured hepatocellular carcinoma cells. BMC Cancer. 2016;16:566.

[3] Li T, Zhao S, Song B, et al. Effects of transforming growth factor β-1 infected human bone marrow mesenchymal stem cells on high- and low-metastatic potential hepatocellular carcinoma. Eur J Med Res. 2015;20:56.

[4] Li T, Song B, Du X, et al. Effect of bone-marrow-derived mesenchymal stem cells on high-potential hepatocellular carcinoma in mouse models: an intervention study. Eur J Med Res. 2013;18:34.

[5] Leng L, Wang Y, He N, et al. Molecular imaging for assessment of mesenchymal stem cells mediated breast cancer therapy. Biomaterials. 2014;35(19):5162-5170.

[6] Supokawej A, Nimsanor N, Sanvoranart T, et al. Mesenchymal stem cell in vitro labeling by hybrid fluorescent magnetic polymeric particles for application in cell tracking. Med Mol Morphol. 2015;48(4):204-213.

[7] Haris M, Yadav SK, Rizwan A, et al. Molecular magnetic resonance imaging in cancer. J Transl Med. 2015;13:313.

[8] Weber MR, Zuka M, Lorger M, et al. Activated tumor cell integrin αvβ3 cooperates with platelets to promote extravasation and metastasis from the blood stream. Thromb Res. 2016;140 Suppl 1:S27-36.

[9] Chen L, Liu Y, Wang W, et al. Effect of integrin receptor-targeted liposomal paclitaxel for hepatocellular carcinoma targeting and therapy. Oncol Lett. 2015;10(1):77-84.

[10] 张春丽,杨铭,王荣福. RGD肽与整合素αvβ3受体结合的构效关系及放射性标记配体的设计[J].肿瘤学杂志, 2009,15(1):76-81.

[11] Petersen BE, Bowen WC, Patrene KD, et al. Bone marrow as a potential source of hepatic oval cells. Science. 1999;284(5417):1168-1170.

[12] Sato Y, Araki H, Kato J, et al. Human mesenchymal stem cells xenografted directly to rat liver are differentiated into human hepatocytes without fusion. Blood. 2005;106(2):756-763.

[13] Choi D, Kim JH, Lim M, et al. Hepatocyte-like cells from human mesenchymal stem cells engrafted in regenerating rat liver tracked with in vivo magnetic resonance imaging. Tissue Eng Part C Methods. 2008;14(1):15-23.

[14] Snykers S, Vanhaecke T, Papeleu P, et al. Sequential exposure to cytokines reflecting embryogenesis: the key for in vitro differentiation of adult bone marrow stem cells into functional hepatocyte-like cells. Toxicol Sci. 2006;94(2):330-341.

[15] Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 2006;8(4):315-317.

[16] Liu G, Fan X, Tang M, et al. Osteopontin induces autophagy to promote chemo-resistance in human hepatocellular carcinoma cells. Cancer Lett. 2016;383(2):171-182.

[17] Chen WT, Shih TT, Chen RC, et al. Integrin αvβ3-targeted dynamic contrast-enhanced magnetic resonance imaging using a gadolinium- loaded polyethylene gycol-dendrimer-cyclic RGD conjugate to evaluate tumor angiogenesis and to assess early antiangiogenic treatment response in a mouse xenograft tumor model. Mol Imaging. 2012;11(4):286-300.

[18] Durand DJ, Carrino JA, Fayad LM, et al. MRI pyschophysics: an experimental framework relating image quality to diagnostic performance metrics. J Magn Reson Imaging. 2013;37(6):1402-1408.

[19] Zhang L, Li HY, Yin XL, et al. Relative analysis of OPN and its related signal molecules in hepatocellular carcinoma. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. 2011;19(1):48-51.

[20] Zhang R, Pan X, Huang Z, et al. Osteopontin enhances the expression and activity of MMP-2 via the SDF-1/CXCR4 axis in hepatocellular carcinoma cell lines. PLoS One. 2011;6(8):e23831.

[21] Liu C, Liu DB, Long GX, et al. Specific targeting of angiogenesis in lung cancer with RGD-conjugated ultrasmall superparamagnetic iron oxide particles using a 4.7T magnetic resonance scanner. Chin Med J (Engl). 2013;126(12):2242-2247.

[22] Jarzyna PA, Deddens LH, Kann BH, et al. Tumor angiogenesis phenotyping by nanoparticle-facilitated magnetic resonance and near-infrared fluorescence molecular imaging. Neoplasia. 2012;14(10): 964-973.

引言

材料方法

1.1 设计 动物模型MRI成像实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年1至5月在解放军南京总医院医学影像科分子影像实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 60只健康Balb/c裸鼠，6周龄，雌雄各半，SPF级，由中国药品生物制品检定所实验动物中心提供，购入时动物体质量为20 g左右。饮用水为灭菌二级超纯水，饮用水质量符合中华人民共和国国家标准《生活饮用水卫生标准》(GB5749-2006)的规定。饲养环境：裸鼠饲养在IVC-Ⅱ型(智能型)独立送风隔离笼具屏蔽系统辅以洁净层流柜的动物饲养室内，温度范围20-25 ℃，相对湿度范围40%-70%，裸鼠食用灭菌裸鼠饲料(SPF级，中国医学科学院实验动物研究所产品)。裸鼠实验前在动物房环境中适应6 d。实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。

1.3.2 实验用主要细胞、试剂和仪器 BMSCs(赛业(广州)生物科技有限公司)；高、低转移潜能肝癌细胞(MHCC97-H和MHCC97-L)(上海复旦大学肝癌研究所)；DMEM培养基(Gibco公司)；胎牛血清(BI公司)；青-链霉素(100×P.S.)(杭州昊天生物技术有限公司)；胰蛋白酶(Gibco公司)；磷酸盐缓冲液(国药化学试剂有限公司)；隔水式恒温培养箱(PYX-DHS500BS-Ⅱ型，上海跃进医疗器械有限公司)。聚赖氨酸树枝状分子(Dendrigraft-poly-L-lysines，DGL)( 法国Colcom公司)；双功能基团聚乙二醇(α-Malemidyl-ω-N-hydroxysuccinimidyl polyethleneglycol，NHS-PEG-MAL，PEG)(北京键凯科技有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 转移相关因子整合素α_vβ₃的配体RGD的磁共振分子探针构建方法

DGL-PEG的合成：将DGL(表面123个氨基，相对分子质量22 000，3代)溶于甲醇中形成反应工作液，密闭保存于4 ℃冰箱中。取60 mg的DGL甲醇溶液，并氮气吹干；再定量称取50 mg双功能基团聚乙二醇(NHS-PEG3500-MAL)，溶于PBS(pH=8.0)，质量浓度为5 g/L。按照PEG∶DGL=15∶1(mol/mol)的比例，室温搅拌反应2 h，PEG上的NHS基团和DGL表面上的伯胺特异反应，生成DGL-PEG。产物采用截流相对分子质量为5 000的透析袋活水纯化24 h，冷冻干燥后得白色固体粉末。

DGL-PEG-cRGD的合成：cRGD肽的N-末端连接一个半胱氨酸，形成含有游离巯基的多肽。将多肽溶于PBS(pH=7.0)中，质量浓度为5 g/L。定量称DGL-PEG，按照cRGD︰DGL=10︰1(mol/mol)的比例，室温避光搅拌反应24 h，制得DGL-PEG-cRGD。产物采用截流相对分子质量为750的透析袋活水纯化24 h，冷冻干燥后得白色固体粉末。

cRGD-PEG-DGL-DTPA的合成：定量称取DGL-PEG- cRGD与p-SCN-Bn-DTPA(物质的量之比为1∶90)在50 mL PBS(pH=9.0)体系中室温下反应48 h。制得cRGD- PEG-DGL-DTPA采用截流相对分子质量为5 000的透析袋活水纯化24 h，冷冻干燥后得白色固体粉末。

cRGD-PEG-DGL-DTPA-Gd(Gd-RGD)的合成：将上述制得cRGD-PEG-DGL-DTPA重新溶解在2 mL 0.1 mol/L pH 6.0的醋酸纳缓冲液中，再加入过量六水合三氯化钆，4 ℃反应24 h，得到cRGD-PEG-DGL-DTPA-Gd，以相对分子质量1 500超滤管提纯并于纯水中冻干。

1.4.2 终产物cRGD-PEG-DGL-DTPA-Gd(Gd-RGD)的¹H-MRS及ICP-AES分析 取适量新鲜制备的上述化合物冻干粉溶于0.5 mL二甲基亚砜中，进行600 MHz核磁分析鉴定。上述冻干粉溶于纯水中，通过电感耦合等离子体原子发射光谱(Inductively coupled plasma atomic emission spectrometry，ICP-AES)测定Gd原子的含量，以计算其连接效率。

1.4.3 具有高、低转移潜能肝癌动物模型制备与BMSCs干预方法、成像方法

实验分组：以空白肿瘤模型为模型对照组，以BMSCs干预肝癌肿瘤模型为实验组。每组又分为GD-RGD实验探针组和Gd-DTPA对照组。见表1。BMSCs干预实验在前，MRI成像实验在后。

BMSCs干预实验：将动物随机分为4组，分别为2个模型对照组(MHCC97-H和MHCC97-L)、2个实验组(MHCC97-H和MHCC97-L)，每组15只，称体质量标号。实验组在接种肿瘤细胞(MHCC97-H和MHCC97-L)后第15天开始尾静脉注射BMSCs(每只鼠5×10⁵个)。模型对照组在接种肿瘤细胞(MHCC97-H和MHCC97-L)后第15天开始尾静脉注射BMSCs细胞培养液，每只鼠0.2 mL。于实验开始后每周用卡尺测一次皮下肿瘤体积，分别于BMSCs干预后第14天(2周)，第21天(3周)，第28天(4周)，第35天(5周)，第42天(6周)处死动物，每次每组处死3只，完整剖取瘤块并称瘤质量和体质量，计算肿瘤质量抑制率。肿瘤质量抑制率=(1-给药组平均瘤质量/对照组平均瘤质量)×100%。

MRI成像实验分组：分子探针与BMSCs干预采用交叉分组方法，以临床用二乙烯三胺五醋酸钆双葡甲胺(Gd- DTPA)为对照组，以Gd-RGD分子探针作为实验组(表1)。由于每组每次处死3只，到第5周时每组仅余3只，因此每组各3只荷瘤动物模型进行MRI成像实验，成像实验后将所有动物模型处死。

1.4.4 转移相关整合素配体Gd-RGD分子探针的MRI成像实验

设备仪器及扫描参数：扫描仪型号：MR GE Discovery HD750(3.0T)，上海辰光医疗科技股份有限公司磁共振3.0T相控阵小鼠射频线圈，线圈型号：CG—MUC40- H300-AG(Bore Diameter：5 cm)，扫描序列：T2WI，T1WI，T1WI+CE序列。检查设备及扫描参数：GE HD750 MR，Coil：HD 8Ch High Res Brain Array by Invivo，FOV 6.0cm，Slice Thickness 3.0，Slice Spacing 0.5，NEX 1, Pulse Sequence: Gradient Echo，BEAVO，FSE-XL，SPGR，TR=4 600 ms，TE=108.7 ms，层厚=3.0，层间距=1.0，矩阵=448×256，FOV=18 cm×13.5 cm。

分子探针使用剂量的计算方法：已经通过ICP-AES测定Gd与DTPA的连接效率，实验中2批次的样品连接效率分别为4.48%和5.02%(以上即为质量百分比)，第1批次产量33.5 mg，第2批次产量32.3 mg。在稀释时(生理盐水或pH=7.0的等渗PBS)请根据需要的Gd含量，计算所需要的样品量。Gd含量的计算由临床应用马根维显量计算得出。即一个原则：实验组(探针组)Gd的浓度应与对照组(小分子的马根维显)Gd的浓度是一致。

Gd-RGD 33.5 mg的配置方法为取23.5 mg药品和15 mL生理盐水；32.3 mg的配置方法为取26.3 mg药品和15 mL生理盐水；分装、备用。

临床用Gd-DTPA，规格为20 mL：9.38 g进行稀释1 000倍，只取稀释后的40 mL，分装、备用。

动物模型最终使用浓度：Gd-DTPA浓度为临床的1/10，Gd-RGD 浓度为1/1 000(对比剂用量均为0.4 mL)，延迟时间为30 min进行扫描。

MRI图像分析方法：以信噪比(signal noise ratio，SNR)和对比噪声比(contrast noise rRatio，CNR)为半定量指标。信噪比SNR=SI组织/SD背景；对比噪声比CNR=(SI病灶- SI组织)/SD背景；SI组织为组织某区域信号强度的平均值，SD背景为背景信号的标准差。

1.4.5 qPCR检测肿瘤增殖和转移相关生物学指标 增殖相关指标转化生长因子β1(tumor transforming growth factor β1，TGF-β1)，转移相关指标骨桥蛋白(osteopontin，OPN)，整合素亚单位α_v和β₃。引物序列来自GenBank数据库，由赛业(广州)生物科技公司合成，见表2。

采用Transwell法将BMSCs分别与MHCC97-H和MHCC97-L肝癌细胞进行共培养，下室加入500 μL含体积分数为20%胎牛血清的培养基和1×10⁴个BMSCs，上室加入100 μL细胞浓度为1×10⁹ L^-1的MHCC97-H肝癌细胞悬液或MHCC97-L细胞悬液，小室置于37 ℃，体积分数为5% CO₂培养箱内培养，共培养48 h后，取下室送检PCR。

方法：提取RNA，RevertAid^TM M-MLV RT反应系统和Oligo (dT)合成cDNA，然后经特异性引物聚合酶链反应(PCR)扩增相应cDNA。PCR条件：预变性95 ℃ 5 min；变性94 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s；延伸72 ℃ 30 s，共30个循环，最后72 ℃ 10 min。PCR产物电泳并经凝胶电泳处理系统扫描半定量分析。采用循环数(ΔΔCt值)作为半定量指标。

1.5 主要观察指标 ①BMSCs干预前后MHCC97-L、MHCC97-H肿瘤Gd-RGD和Gd-DTPA成像结果分析；②BMSCs干预后各组裸鼠肿瘤质量抑制率；③转化生长因子β1、骨桥蛋白、整合素亚单位α_v和β₃的mRNA表达。

1.6 统计学分析 实验数据以x(_)±s表示，统计学检验采用GraphPad Prism 统计软件中均数分析。先对数据进行方差齐性检验，若方差齐，采用单因素方差分析进行总体比较，用多个实验组与一个对照组均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据改用秩和检验进行统计，以α=0.05为检验水准。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

人骨髓干细胞主要包括造血干细胞和间充质干细胞两大类型，人BMSCs与肿瘤的关系成为研究热点之一。1999年Petersen等^[11]首次证实大鼠肝卵圆细胞和肝细胞可由骨髓细胞分化而来，Sato等^[12]将人骨髓细胞分为BMSCs、CD34细胞和非BMSCs/CD34^-细胞，分别移植到烯丙基乙醇致肝损伤大鼠肝脏后发现，BMSCs是肝癌坏死区肝细胞的主要细胞来源，细胞能够表达肝特异性标志，未见细胞融合证据。此后，BMSCs体内外研究都证实可以分化成肝细胞或肝样细胞^[13-14]。BMSCs在肿瘤生长中的作用分为3种：抑制肿瘤生长(如肺癌、肝癌等)；促进肿瘤生长(如多发性骨髓瘤、乳腺癌等)；对肿瘤生长没有效果(如结肠癌等)。实验采用的BMSCs传代均在10代以内，细胞生长良好，经表面抗原及诱导分化实验鉴定，符合国际关于BMSCs的标准^[15]。

分子探针是分子影像的核心，通过分子探针的构建可以实现靶向成像。整合素(Integrin)为亲异性细胞黏附分子，介导细胞与细胞间的相互作用及细胞与细胞外基质间的相互作用。整合素是由α和β两个亚单位形成的二聚体，整合素受体α_vβ₃在多种肿瘤细胞表面有高表达，且在肿瘤组织新生血管内皮细胞膜有强烈表达，但在成熟血管内皮细胞和绝大多数正常器官系统受体表达缺乏^[16]。整合素受体通过与细胞外基质蛋白的受体识别序列RGD特异结合，介导肿瘤细胞黏附和移行。通过肿瘤整合素受体RGD显像可以评价血管化情况^[17]。实验通过构建新型分子影像探针Gd-RGD行MRI成像，MRI具有无创、无辐射等特点，并且具有非常高的软组织分辨率和空间分辨率，在肝脏疾病的分子成像方面具有优势。实验观察高、低转移潜能肝癌在BMSCs干预下的肝癌组织影像特点，重点观察Gd-RGD能否区分具有高、低转移潜能的肝癌组织，能否显示肝癌组织在BMSCs干预下肿瘤增殖行为和转移行为的变化，为开展在体实时监测肿瘤生物学行为成像提供依据。

实验通过耦合反应构建MRI分子影像探针Gd-RGD，通过物质分析化合物中含有MRI成像所需的Gd⁺，能够满足MRI成像需要。制作高、低转移潜能肝癌(MHCC97-H和MHCC97-L)动物模型，对动物模型进行BMSCs干预，6周后行MR-RGD成像，以Gd-DTPA作为对照分子影像探针。两种分子探针成像结果显示，对于高、低转移潜能肝癌(MHCC97-H和MHCC97-L)肿瘤，在BMSCs干预前后，MR-RGD增强程度均低于MR-DTPA增强程度，其原因可能是Gd-DTPA属于细胞外间隙对比剂，与肿瘤血供丰富程度有关，而Gd-RGD属于肿瘤靶向对比剂，与肿瘤组织中整合素α_vβ₃表达多少有关，肿瘤组织的血供多于肿瘤组织中整合素受体α_vβ₃表达。同样，半定量指标SNR分析显示，MR-RGD成像的SNR和CNR低于MR-DTPA，差异有显著性意义，也证明MR-RGD增强强化程度低于MR-DTPA强化程度。

从区分高、低转移潜能肝癌的能力来看，MR-RGD成像SNR指标不能区分高、低转移潜能肝癌，而CNR则具有区分高、低转移潜能肝癌的能力，且低转移潜能肝癌组织的CNR明显高于高转移潜能肝癌。因此，CNR可以作为MR-RGD探针区分高、低转移潜能的指标。这两种MR半定量指标的差异性可能与CNR指标的计算方法剔除组织背景干扰有关，优于SNR计算方法^[18]。转移相关指标骨桥蛋白、α_v、β₃表达检测结果显示，仅有β₃在高、低转移潜能肝癌间存在差异，这表明整合素α_v和β₃两个亚单位中β₃是两种肝癌细胞转移潜能差异的关键因子。骨桥蛋白中含有RGD序列，可以与细胞表面整合素受体α_vβ₃进行特异性结合，有报道骨桥蛋白通过结合其受体整合素α_vβ₃促进肝癌细胞株HepG膜型CD44v6表达，而CD44v6与透明质酸结合促进肝癌转移^[19-20]。

与BMSCs干预前结果不同，高、低转移潜能肝癌组织在BMSCs干预后，SNR和CNR指标均可以区分高、低转移潜能肝癌组织，且Gd-RGD成像在BMSCs干预前后SNR和CNR差异程度明显高于Gd-DTPA，且低转移潜能肝癌组织的SNR和CNR明显高于高转移潜能肝癌。因此，Gd-RGD成像更适合区分BMSCs干预后的肝癌组织高、低转移潜能的变化。这表明，经BMSCs干预后肝癌组织整合素α_vβ₃的表达发生变化，随后，PCR分析转移相关指标显示，肝癌组织在BMSCs干预后转移相关指标骨桥蛋白，α_v，β₃表达在高、低转移潜能肝癌组织中均有减低，正是BMSCs干预后肿瘤表达的差异可能是Gd-RGD能够区分高低转移潜能肝癌的原因。

核磁共振成像RGD分子探针的构建已经有研究报道。由于Gd⁺需要达到毫摩尔级别才能被检测得到，因此，有作者将靶向整合素α_vβ₃的RGD与超顺磁性氧化铁(SPIO)纳米粒子结合^[21]，构建新型分子影像探针RGD-SPIO，T2*加权核磁共振成像能够非侵入性地分辨出不同整合素α_vβ₃表达水平的肿瘤血管分布。也有作者利用基于氧化铁纳米颗粒构建双模式探针^[22]，如RGD-CLIO-Cy5.5，能够用于核磁共振和荧光成像，同时具备核磁共振高分辨率和荧光成像高灵敏度的优点。开发靶向整合素α_vβ₃分子探针用于临床研究，能够为整合素α_vβ₃在新生血管生成和肿瘤发生发展中的确切作用提供更多的实验依据，为整合素α_vβ₃表达和其他新生血管生成相关的潜在药物靶点之间的相互关系提供更多的理论基础。

此外，肝癌组织在BMSCs干预前后肿瘤组织质量变化实验结果显示，高转移潜能肝癌的肿瘤质量变化率高于低转移潜能肝癌，这表明高转移潜能肝癌组织对BMSCs干预较低转移潜能肝癌更敏感。肿瘤增殖性相关因子转化生长因子β1在BMSCs干预高、低转移潜能肝癌前后表达出现差异，与肝癌在BMSCs干预后肿瘤质量变化具有一致性。

结论：MR成像中Gd-RGD示踪剂CNR指标可以很好地区分两种具有高、低转移潜能肝癌组织，在BMSCs干预后MR成像中Gd-RGD示踪剂SNR和CNR指标可以很好地区分两种具有高、低转移潜能肝癌组织，因此，Gd-RGD成像更适合区分BMSCs干预后的肝癌组织高、低转移潜能变化的显示。

高低转移潜能肝癌在骨髓间充质干细胞干预前后的Gd-RGD成像

Hepatocellular carcinoma with high and low metastatic potential before and after bone marrow mesenchymal stem cell transplantation: a MRI imaging study using Gd-RGD probe

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[1]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[2]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[3]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[4]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[5]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[6]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[7]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[8]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[9]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[10]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[11]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[12]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[13]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[14]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[15]	史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.