UM171体外扩增脐血造血干细胞的机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0898

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (21): 3328-3334.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0898

• 脐带脐血干细胞 umbilical cord blood stem cells • 上一篇下一篇

UM171体外扩增脐血造血干细胞的机制

徐诗琪，丁亚辉，张宇，纪庆，杨铭，李迎辉，高瀛岱

中国医学科学院，北京协和医学院，血液学研究所实验血液学国家重点实验室，天津市 300020

修回日期:2018-05-21 出版日期:2018-07-28 发布日期:2018-07-28
通讯作者: 高瀛岱，博士，研究员，中国医学科学院，北京协和医学院，血液学研究所实验血液学国家重点实验室，天津市 300020；并列通讯作者：李迎辉，博士，助理研究员，中国医学科学院，北京协和医学院，血液学研究所实验血液学国家重点实验室，天津市 300020
作者简介:徐诗琪，女，1992年生，辽宁省开原市人，满族，2018年北京协和医学院毕业，硕士，主要从事造血干细胞扩增研究。
基金资助:
国家重点研发计划(2016YFA0100602，2017YFA0104903)；国家自然科学基金(NSFC 81430004，81421002，81570100，81500086，81600085)；中国医学科学院医学与健康科技创新工程(2016-12M-3-008，2016-12M-1-017)

Mechanism by which UM171 sustains expansion of umbilical cord blood hematopoietic stem cells in vitro

Xu Shi-qi, Ding Ya-hui, Zhang Yu, Ji Qing, Yang Ming, Li Ying-hui, Gao Ying-dai

Key Laboratory of Experimental Hematology, Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Tianjin 300020, China

Revised:2018-05-21 Online:2018-07-28 Published:2018-07-28
Contact: Gao Ying-dai, M.D., Researcher, Key Laboratory of Experimental Hematology, Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Tianjin 300020, China; Li Ying-hui, M.D., Assistant researcher, Key Laboratory of Experimental Hematology, Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Tianjin 300020, China
About author:Xu Shi-qi, Master, Key Laboratory of Experimental Hematology, Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Tianjin 300020, China
Supported by:
the National Key Research and Development Projects of China, No. 2016YFA0100602 and 2017YFA0104903; the National Natural Science Foundation of China, No. 81430004, 81421002, 81570100, 81500086, and 81600085; CAMS Innovation Fund for Medical Sciences, No. 2016-12M-3-008 and 2016-12M-1-017

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
UM171：是人造血干细胞自我更新和体外扩增的强有力的激动剂，可以在体外扩增长周期造血干细胞和下游细胞，从而使脐血造血干细胞在体外扩增至一定数量后用于成人的临床移植治疗。
转化生长因子β 信号通路：转化生长因子β信号通路在细胞的多种反应、细胞的命运(生长、分化、发育)和几乎所有组织的行为中扮演重要的角色。此外，转化生长因子β信号失调与许多癌症的发展有关，包括白血病。根据相关研究，转化生长因子β信号通路通过将造血干细胞保持在静止状态，维持了干细胞的稳态。

摘要
背景：研究表明UM171可以在体外扩增造血干细胞，但作用机制尚不清楚。
目的：通过高通量对接(HTDocking)筛选技术研究UM171作用的靶点，并概述其潜在的作用机制。
方法：利用StemCellCKB在线计算平台，找出UM171可能的作用靶点。通过验证实验排除阴性靶点，利用表面等离子体共振(SPR)分析确定UM171和转化生长因子βRⅠ之间的相互作用。Western blot法检测UM171作用于转化生长因子β信号通路的几种重要蛋白质表达变化。
结果与结论：①根据StemCellCKB计算得分，找出了UM171可能的作用靶点有转化生长因子βRⅠ等；②表面等离子体共振分析得出KD50值为62.5 µmol/L，说明UM171和转化生长因子βRⅠ有较强的结合能力；③转化生长因子β信号通路中转化生长因子βRⅠ、Smad3、p-Smad3、Smad4等主要蛋白质的表达水平显著提高；④结果提示UM171通过作用于转化生长因子β信号通路扩增脐血造血干细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-3476-6920(徐诗琪)

关键词: 高通量筛选, 脐血, 造血干细胞, UM171, 转化生长因子β信号通路, HDAC, PPAR gamma, 扩增, UM171靶点, 干细胞, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: It has been reported that UM171 enables an ex vivo expansion of human hematopoietic stem cells. However, the intracellular regulatory mechanisms remain unclear.
OBJECTIVE: To investigate the compound-target interaction network of UM171 by High-Throughput Docking (HTDocking) screening technology and TargetHunter, and to outline its potential mechanisms of action.
METHODS: Using the online StemCellCKB interface, we searched the possible targets of UM171. Negative targets were excluded by validation experiments, and a surface plasmon resonance (SPR) assay was used to identify the interaction between UM171 and transforming growth factor βRI. Several important proteins which are known to regulate this pathway were investigated by western blot.
RESULTS AND CONCLUSION: StemCellCKB program automatically calculated the docking scores, which indicated the possible targets of UM171. The KD50 values were calculated as 62.5 µmol/L by SPR, indicating the high affinity between UM171 and its target protein. Western blot analysis results revealed that the expression levels of main proteins in transforming growth factor β signaling pathway, including TGF-βRI, Smad3, p-Smad3, Smad4, were increased significantly in a concentration-depend manner. Overall, UM171 can sustain the expansion of umbilical cord blood hematopoietic stem cells through the transforming growth factor β signaling pathway.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Fetal Blood, Hematopoietic Stem Cells, Transforming Growth Factor beta, PPAR gamma, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

徐诗琪，丁亚辉，张宇，纪庆，杨铭，李迎辉，高瀛岱. UM171体外扩增脐血造血干细胞的机制[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(21): 3328-3334.

Xu Shi-qi, Ding Ya-hui, Zhang Yu, Ji Qing, Yang Ming, Li Ying-hui, Gao Ying-dai. Mechanism by which UM171 sustains expansion of umbilical cord blood hematopoietic stem cells in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(21): 3328-3334.

图/表（结果） 2

2.1 UM171作用于造血干细胞的流式检测结果 实验中使用CD34、CD38和CD49f作为造血干细胞的富集标记来验证造血干细胞扩增效果。从人脐血中收集分离的CD34⁺细胞进行剂量反应分析。结果显示，UM171作用 7 d后，造血干祖细胞(CD34⁺CD38^-)的比例和绝对数量均显著增加(图1A，B)。UM171处理后相对更原始的造血干祖细胞(CD34⁺CD49f⁺)百分比增加1倍(图1C)，同时CD34⁺CD49f⁺细胞的绝对数量也显著增加(图1D)。

2.2 StemCellCKB高通量对接(HTDocking)在线预测结果 首先根据HTDocking在线预测打分结果，发现UM171的可能主要蛋白靶点为CDK2，GSK-3β，Hras，TGF-βRⅠ，erbB-2和MAPK14(图2)。

2.3 高通量对接(HTDocking)提示UM171可能抑制HDAC 在蛋白靶点预测的过程中采用与UM171具有相同生物学功能的Valproic acid(HDAC抑制剂)进行对照，根据预测发现Valproic acid(HDAC抑制剂)的主要作用靶点为CDK2，GSK-3β，Hras，erbB-2和MAPK14。通过对比分析，发现Valproic acid和UM171的预测作用靶点有90%的相似度(3A)，因此推测UM171也为一个HDAC抑制剂。然而通过酶活水平的验证结果可知，UM171对HDAC酶活的影响较小，因此UM171不是特异的HDAC抑制剂(图3B)。UM171与Valproic acid(HDAC抑制剂)预测结果中的差异蛋白质转化生长因子βRⅠ成为下一步研究的重点。

2.4 TargetHunter在线预测提示UM171可能抑制PPAR gamma 根据TargetHunter在线预测的结果可知，Chembl1801743化合物与UM171有82.98%的结构相似性(图4A，B)，因此推测Chembl1801743化合物和UM171具有相同的作用靶点。Chembl1801743是PPAR gamma的抑制剂，根据相同结构具有相似作用机制的设想，作者初步推测UM171也为PPAR gamma的抑制剂。采用PPAR gamma分析试剂盒进行验证表明，UM171对PPAR gamma并没有显著的抑制作用(图4C)。

2.5 表面等离子体共振分析 根据HTDocking和TargetHunter在线预测的结果进行分析和排除后，初步选定转化生长因子βRⅠ成为下一步研究的重点。通过查阅相关文献也发现，转化生长因子βRⅠ与造血干细胞自我更新和干性维持具有较强的相关性^[12，22]。而且已知55F可以与转化生长因子βRⅠ结合，通过结构模拟分析UM171与转化生长因子βRⅠ相互作用的评分与55F接近，作用相似氨基酸位点(图2，图5A)。为了确定UM171和转化生长因子βRⅠ之间的相互作用，使用了表面等离子体共振分析。重组的转化生长因子βRⅠ蛋白质通过标准氨基偶联化学过程，被偶联在CM5芯片上固定了10 min，结合在芯片上的蛋白达到6 000 RU，UM171被运行缓冲液稀释后在25 ℃以10 μL/min的流速上样。结果显示UM171与转化生长因子βRⅠ的结合具有浓度依赖性(图5B)。KD₅₀值为62.5 µmol/L(图5C)，这意味着UM171和它的靶蛋白之间的结合能力强，不容易解离。

2. 6转化生长因子β信号通路激活 为了证明UM171通过转化生长因子β信号通路扩增造血干细胞的途径，研究了几种已知的调节该途径的重要蛋白质。据报道，Smad2、Smad3和Smad4羧基端磷酸化被激活，引起细胞状态特异性调节的转录^[23]。首先在细胞膜形成转化生长因子βRⅠ-转化生长因子βRⅡ复合物，然后转化生长因子βRⅡ磷酸化转化生长因子βRⅠ。激活的转化生长因子βRⅠ接下来激活Smads(p-Smad2，p-Smad3是Smad2和Smad3的激活形式)^[24]。激活的Smad2和Smad3可以与Smad4形成复合物^[25-26]，转移到细胞核，然后作为转录因子调节转化生长因子β通路的靶基因^[20，27-28]。分析结果表明，转化生长因子βRⅠ，Smad3，p-Smad3，Smad4等主要蛋白质的表达水平显著提高，然而总的Smad2/3表达明显减少，提示UM171主要通过上调p-Smad3和Smad3/4来扩增造血干细胞。

参考文献

[1] Bozda? SC, Yüksel MK, Demirer T. Adult Stem Cells and Medicine. Adv Exp Med Biol. 2018 Mar 20. doi: 10. 1007/5584_2018_184. [Epub ahead of print]

[2] Peccatori J, Ciceri F. Allogeneic stem cell transplantation for acute myeloid leukemia. Haematologica. 2010;95(6): 857-859.

[3] Gragert L, Eapen M, Williams E, et al. HLA match likelihoods for hematopoietic stem-cell grafts in the U. S. registry. N Engl J Med. 2014;371(4):339-348.

[4] Fares I, Chagraoui J, Gareau Y, et al. Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal. Science. 2014;345 (6203):1509-1512.

[5] Ramírez P, Brunstein CG, Miller B, et al. Delayed platelet recovery after allogeneic transplantation: a predictor of increased treatment-related mortality and poorer survival. Bone Marrow Transplant. 2011;46(7):981-986.

[6] Rocha V, Labopin M, Sanz G, et al. Transplants of umbilical-cord blood or bone marrow from unrelated donors in adults with acute leukemia. N Engl J Med. 2004;351(22): 2276-2285.

[7] Miller PH, Knapp DJ, Eaves CJ. Heterogeneity in hematopoietic stem cell populations: implications for transplantation. Curr Opin Hematol. 2013;20(4):257-264.

[8] Morin V. Stem-cell replication to treat blood diseases. CMAJ. 2014;186(17):E648.

[9] Brunstein CG, Gutman JA, Weisdorf DJ, et al. Allogeneic hematopoietic cell transplantation for hematologic malignancy: relative risks and benefits of double umbilical cord blood. Blood. 2010;116(22):4693-4699.

[10] Ali S, Yu SM, Yao ZJ. Gram-Scale Laboratory Synthesis of UM171, a Potent Agonist of Human Hematopoietic Stem Cell Self-Renewal. J Org Chem. 2016;81(21):10236-10241.

[11] Zhang Y, Wang L, Feng Z, et al. StemCellCKB: An Integrated Stem Cell-Specific Chemogenomics KnowledgeBase for Target Identification and Systems-Pharmacology Research. J Chem Inf Model. 2016;56(10):1995-2004.

[12] Blank U, Karlsson S. TGF-β signaling in the control of hematopoietic stem cells. Blood. 2015;125(23):3542-3550.

[13] Batard P, Monier MN, Fortunel N, et al. TGF-(beta)1 maintains hematopoietic immaturity by a reversible negative control of cell cycle and induces CD34 antigen up-modulation. J Cell Sci. 2000;113(Pt 3):383-390.

[14] Fortunel NO, Hatzfeld A, Hatzfeld JA. Transforming growth factor-beta: pleiotropic role in the regulation of hematopoiesis. Blood. 2000;96(6):2022-2036.

[15] Garbe A, Spyridonidis A, Möbest D, et al. Transforming growth factor-beta 1 delays formation of granulocyte- macrophage colony-forming cells, but spares more primitive progenitors during ex vivo expansion of CD34+ haemopoietic progenitor cells. Br J Haematol. 1997;99(4):951-958.

[16] Yamazaki S, Iwama A, Takayanagi S, et al. Cytokine signals modulated via lipid rafts mimic niche signals and induce hibernation in hematopoietic stem cells. EMBO J. 2006;25(15): 3515-3523.

[17] Yamazaki S, Iwama A, Takayanagi S, et al. TGF-beta as a candidate bone marrow niche signal to induce hematopoietic stem cell hibernation. Blood. 2009;113(6):1250-1256.

[18] Cheshier SH, Morrison SJ, Liao X, et al. In vivo proliferation and cell cycle kinetics of long-term self-renewing hematopoietic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999; 96(6):3120-3125.

[19] Wilson A, Laurenti E, Oser G, et al. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 2008;135(6):1118-1129.

[20] Heldin CH, Landström M, Moustakas A. Mechanism of TGF-beta signaling to growth arrest, apoptosis, and epithelial-mesenchymal transition. Curr Opin Cell Biol. 2009;21(2):166-176.

[21] Zuo W, Huang F, Chiang YJ, et al. c-Cbl-mediated neddylation antagonizes ubiquitination and degradation of the TGF-β type II receptor. Mol Cell. 2013;49(3):499-510.

[22] Xie WL, Jiang R, Shen XL, et al. Diosgenin attenuates hepatic stellate cell activation through transforming growth factor-β/Smad signaling pathway. Int J Clin Exp Med. 2015; 8(11):20323-20329.

[23] Wang Z, Fei S, Suo C, et al. Antifibrotic Effects of Hepatocyte Growth Factor on Endothelial-to-Mesenchymal Transition via Transforming Growth Factor-Beta1 (TGF-β1)/Smad and Akt/mTOR/P70S6K Signaling Pathways. Ann Transplant. 2018;23:1-10.

[24] You SP, Ma L, Zhao J, et al. Phenylethanol Glycosides from Cistanche tubulosa Suppress Hepatic Stellate Cell Activation and Block the Conduction of Signaling Pathways in TGF-β1/smad as Potential Anti-Hepatic Fibrosis Agents. Molecules. 2016;21(1):102.

[25] Feng XH, Derynck R. Specificity and versatility in tgf-beta signaling through Smads. Annu Rev Cell Dev Biol. 2005;21: 659-693.

[26] Massagué J, Seoane J, Wotton D. Smad transcription factors. Genes Dev. 2005;19(23):2783-2810.

[27] Ikushima H, Miyazono K. TGFbeta signalling: a complex web in cancer progression. Nat Rev Cancer. 2010;10(6):415-424.

[28] Carli C, Giroux M, Delisle JS. Roles of transforming growth factor-β in graft-versus-host and graft-versus-tumor effects. Biol Blood Marrow Transplant. 2012;18(9):1329-1340.

[29] Lee MKS, Al-Sharea A, Dragoljevic D, et al. Hand of FATe: lipid metabolism in hematopoietic stem cells. Curr Opin Lipidol. 2018;29(3):240-245.

[30] Sugimura R. Bioengineering Hematopoietic Stem Cell Niche toward Regenerative Medicine. Adv Drug Deliv Rev.2016; 99(Pt B):212-220.

[31] Bari S, Seah KK, Poon Z, et al. Expansion and homing of umbilical cord blood hematopoietic stem and progenitor cells for clinical transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 2015;21(6):1008-1019.

[32] Fares I, Rivest-Khan L, Cohen S, et al. Small molecule regulation of normal and leukemic stem cells. Curr Opin Hematol. 2015;22(4):309-316.

[33] Sitnicka E, Ruscetti FW, Priestley GV, et al. Transforming growth factor beta 1 directly and reversibly inhibits the initial cell divisions of long-term repopulating hematopoietic stem cells. Blood. 1996;88(1):82-88.

[34] Hao S, Chen C, Cheng T. Cell cycle regulation of hematopoietic stem or progenitor cells. Int J Hematol. 2016; 103(5):487-497.

引言

造血干细胞的再生潜能使其成为某些血液恶性肿瘤和退行性疾病临床治疗的重要方法。造血干细胞移植治疗已广泛应用于包括骨髓衰竭、白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、某些遗传性血液病以及自身免疫性疾病^[1]。同种异体造血干细胞移植是治疗多种恶性血液病的有效方法^[2]，但大部分患者由于人类白细胞抗原(HLA)供者配型不成功，无法进行造血干细胞移植治疗^[3]，寻找一个免疫兼容的健康来源供者组织特别困难^[3]。脐血造血干细胞具有体积小、HLA匹配要求低的特点，可能会成为未来造血干细胞移植治疗的优先来源^[4]，但在应用脐血造血干细胞移植治疗时，特别是成年患者，因为脐血中有限的祖细胞数量，会导致中性粒细胞移植延迟，从而增加早期感染和与移植相关的死亡率^[5-7]。据报道，自1990年以来，在世界范围内临床上越来越多的患者进行脐血造血干细胞移植，但是可以用脐血造血干细胞移植治疗的成人只有5%^[8]。很多研究结果表明，在体外扩增脐血造血干细胞对临床移植应用具有重要意义^[6，9]。

UM171是人造血干细胞自我更新和体外扩增的强有力的激动剂^[10]，可以在体外扩增长周期造血干细胞和下游细胞，从而使脐血造血干细胞在体外扩增至一定数量后用于成人的临床移植治疗。然而，UM171扩增造血干细胞的机制尚不清楚。

高通量对接(HTDocking)设计和构建的目的是通过高通量对接多种药物可能的蛋白质靶点，发现小分子化合物的潜在药理学靶点。StemCellCKB(http://www.cbligand. org/StemCellCKB)是一个强大的在线计算进行靶点识别的平台，可以利用这个平台来找到UM171可能的作用靶点^[11]。

转化生长因子β信号通路在细胞的多种反应、细胞的命运和几乎所有组织的行为中扮演重要的角色^[12]，而且被认为是造血干细胞体外增殖的调控因子之一^[13-15]，通过阻止造血干细胞进入细胞周期^[16]，参与调控造血干细胞的静止状态^[17]。研究证明，在稳态条件下，大多数造血干细胞处于静止的细胞周期状态^[18-19]。经典的转化生长因子β信号通路是通过胞质Smad蛋白的磷酸化，向细胞核传递信号^[20]。此外，转化生长因子β信号通路失调与许多癌症的发展有关，包括白血病^[21]。实验通过反向药效基团数据库筛选技术研究UM171的靶点作用网络，并概述其潜在的作用机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 药理学细胞实验和细胞分子生物学体外实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年10月至2017年6月在天津血液学研究所实验血液学国家重点实验室完成。

1.3 材料 人脐血样本采集于天津市中心妇产医院妇产科，符合伦理批准的程序。CD34分选磁珠(德国Miltenyi Biotec公司)；流式抗体CD34-APC，CD38^-PE.cy7和CD49f-PE(美国BD Bioscience公司)；UM171化合物(美国Selleck Chemicals公司)；抗转化生长因子βRⅠ抗体(美国Santa Cruz Biotechnology公司)；抗p-Smad2，Smad2，p-Smad3，Smad3，Smad4 抗体(美国Cell Signaling Technology公司)；HDAC检测试剂盒(英国Abcam公司)；PPAR gamma检测试剂盒(英国Abcam公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 脐血中CD34⁺细胞的分离培养与流式分析 先用羟乙基淀粉和红细胞裂解液去除红细胞，然后用人CD34 MicroBead Kit将CD34⁺细胞从脐血中分离出来。分离出的CD34⁺细胞用扩增培养基重悬后(培养基成分：IMDM+体积分数为10%胎牛血清+100 μg/L促血小板生成素+ 100 μg/L干细胞因子+100 μg/L FMS样酪氨酸激酶3配体+ 1%双抗)加入96孔板中进行培养，初始细胞浓度为1×10⁴/孔。培养1 h后，加入0，17.5，35，70 nmol/L浓度的UM171，每个浓度8个复孔。在37 ℃，体积分数为5% CO₂恒温细胞培养箱中培养7 d，离心弃上清，PBS清洗2次，加入100 µL PBS重悬，每孔加1 µL CD34-APC抗体，1 µL CD38-PE.cy7抗体和0.5 µL CD49f-PE抗体标记细胞，室温避光孵育30 min，离心洗去未结合的抗体，加入200 µL PBS重悬，用流式细胞仪进行流式检测分析。

1.4.2 StemCellCKB在线计算平台

(1)TargetHunter在线预测：TargetHunter在线靶点识别程序具有强大的数据计算功能，依据结构相似的化合物常常有相似的生物学特性的原理来预测新型化合物的作用靶点。

首先登陆网址http://www.cbligand.org/StemCellCKB，在StemCellCKB在线计算平台中提交小分子化合物UM171分子结构的SDF文件，然后利用StemCellCKB数据库中的化学信息学工具TargetHunter寻找与UM171具有相似结构且作用机制已经明确的小分子化合物。根据已知的和UM171结构相似化合物的信息进一步推断并验证UM171的可能作用靶点。

(2)HTDocking在线预测：HTDocking是在线高通量分子对接程序，可以利用已经建立的强大蛋白质结构库，将小分子化合物分别与数据库中的蛋白质进行虚拟对接，预测小分子化合物可能的作用靶点。

首先登陆网址http，在StemCellCKB在线计算平台中提交小分子化合物UM171分子结构的SDF文件。然后利用StemCellCKB数据库中的化学信息学工具HTDocking将小分子化合物分别与数据库中的蛋白质进行虚拟对接。全部预测完成后，根据Docking Score的大小自动排列，选择前5-10个蛋白靶点进行保存和分析。 ://www.cbligand.org/StemCellCKB

1.4.3 HDAC活性分析 将30 µL ddH₂O，5 µL HDAC缓冲液和5 µL底物肽或5 µL脱乙酰基肽加到包被好的96孔板中。UM171被溶解并稀释到适当的浓度加入到相应的孔中，室温孵育20 min，加入20 μL终止液，混匀，然后在孔板的每个孔加入5 μL Developer混合至少10 min。用酶标仪测定荧光强度，其激发波长/发射波长为Ex/Em= 350-380 nm/440-460 nm。

1.4.4 PPAR gamma活性分析 将实验过程中所用试剂室温平衡1 h，并根据实验方案配制转录因子结合缓冲液(complete transcription factor binding assay，CFBA)。取出包被dsDNA的96孔板，每孔加入10 µL阳性PPAR gamma提取物，10 µL一定浓度稀释后的UM171，80 µL CFBA缓冲液，室温摇床上孵育2 h。用wash buffer洗板5次，每次200 µL，3 min。每孔加入100 µL稀释后的PPAR gamma一抗，室温孵育1 h，用wash buffer洗板5次，每次200 µL，3 min。每孔加入100 µL稀释后的PPAR gamma二抗，室温孵育1 h，用wash buffer洗板5次，每次200 µL，3 min。每孔加入100 µL developing buffer，室温摇床上孵育15-45 min。待A_{650 nm}介于0.4-0.5，A_{450 nm}接近1时，每孔加入100 µL stop buffer，测定A_{450 nm}。

1.4.5表面等离子体共振(SPR)分析 将转化生长因子βRⅠ蛋白溶解于10 mmol/L乙酸钠溶液(pH 4.0)中，使蛋白终质量浓度为100 mg/L。使用氨基偶联方法将转化生长因子βRⅠ蛋白偶联至CM5芯片上。运行中使用含0.005% P20表面活性剂的PBS(pH=7.4)作为缓冲液，将化合物原液(二甲基亚砜稀释)使用运行缓冲液稀释至指定的不同浓度，按序流过CM5芯片。根据不同的结合曲线分析化合物与蛋白的结合情况。

1.4.6 Western blot分析转化生长因子β通路主要蛋白表达 收集不同浓度UM171处理的细胞，加入RIPA裂解液冰上裂解细胞30 min，采用蛋白定量试剂盒对蛋白进行定量，进行SDS-PAGE电泳，选用PVDF膜转膜，加入相应的转化生长因子βRⅠ，p-Smad2，Smad2，p-Smad3，Smad3，Smad4一抗，4 ℃摇床过夜，PBST洗膜3次，加入二抗室温孵育2 h，再次洗膜3次，最后通过ECL显色、超敏感化学发光及荧光影像分析仪上进行显影，保存图片并进行分析。以β-actin为内参。

1.5 主要观察指标 ①UM171扩增能力；②StemCellCKB预测结果；③UM171对HDAC和PPAR gamma活性的影响；④表面等离子体共振KD50值；⑤Western blot检测转化生长因子β信号通路中几种已知的调节该途径的重要蛋白质的表达变化。

1.6 统计学分析 应用 GraphPad Prism5软件进行统计分析，两组之间比较采用Student t 检验，变量比较采用列联表检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

造血干细胞通过自我更新和多向分化能力不断产生成熟的造血和免疫系统^[29]，造血干细胞存在于骨髓中，通过造血过程来补充血液中的所有细胞。移植造血干细胞治疗血液恶性肿瘤和退行性疾病是目前临床治疗的重要方法。脐血造血干细胞的优势在于采集方便、慢性移植物抗宿主病发生率低、快速可获得性以及移植患者疾病复发率较低^[9-30]。成功扩增脐血中的造血干细胞和祖细胞，可以使这种体积小的、HLA匹配的脐血单位更广泛的用于移植，并改善移植相关的结果^[31]。UM171可以在体外扩增人的脐血造血干细胞，是第一类能独立于AhR抑制作用而扩增造血干细胞的小分子^[32]。为了研究其作用机制，利用StemCellCKB在线计算平台。2016年课题组Zhang等建立了StemCellCKB在线计算平台，同时验证了StemCellCKB具有强大的数据完整性和靶点预测准确的特点。StemCellCKB关注于造血干细胞、胚胎干细胞和诱导多能干细胞3个干细胞类型共包括458个基因和蛋白质，207个相关的通路和生物学分析，而且还包括了102个已知对造血干细胞、胚胎干细胞和诱导多能干细胞有生物学作用的小分子信息，463个有待证实的对干细胞表型起作用的小分子(这些小分子的靶蛋白包含在与干细胞有关的信号通路中)。同时通过使用StemCellCKB对已知靶点的小分子进行预测，得到了与已知实验数据相同的结果，证明了StemCellCKB预测靶点的准确性^[11]。由此，通过StemCellCKB预测和相关验证实验，找到了UM171可能的靶点是转化生长因子β信号通路。转化生长因子β信号通路在细胞生长、分化、发育和广泛的生物系统中起着重要的作用^[33]。根据相关研究，转化生长因子β信号通路将造血干细胞保持在静止状态，维持了干细胞的稳态[34]。通过研究UM171处理的脐血造血干细胞中转化生长因子β信号通路表达的变化，确定了其作用机制。结果显示，转化生长因子βRⅠ、Smad3、p-Smad3、Smad4蛋白质的表达水平显著提高，证明UM171扩增脐血造血干细胞时可能激活了转化生长因子β信号通路。确定了UM171的作用靶点，可以进一步的确定其作用机制及作用的靶点网络，使UM171体外扩增的脐血造血干细胞用于临床移植治疗成为现实。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

UM171体外扩增脐血造血干细胞的机制

Mechanism by which UM171 sustains expansion of umbilical cord blood hematopoietic stem cells in vitro

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 2

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[2]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[3]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[4]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[5]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[6]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[7]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[8]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[9]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[10]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[11]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[12]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[13]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[14]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[15]	史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.