不同来源神经干细胞移植治疗大鼠脑缺血损伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0881

摘要/Abstract

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文题释义：
诱导性多能干细胞：是来源于成体细胞却具有与胚胎干细胞相似的真正的全能性，可分化为多种成体细胞的一种新细胞系，既避免了伦理学问题，又无免疫原性，且取材方便，在移植再生领域有更广泛的应用前景，也为自体神经干细胞治疗提供了一个新途径。
神经干细胞移植治疗脑缺血等损伤性疾病的机制：①能够在体外特定诱导条件或体内神经组织损伤部位定向分化为有功能的神经元和神经胶质细胞；②神经干细胞的迁移作用和较好的组织相容性使其向神经组织损伤区域迁移与募集，从而达到损伤修复的目的；③神经干细胞的低免疫原性在移植后很少引起排斥反应而利于其在移植部位的存活；④神经干细胞可诱导脑缺血部位的血管新生；⑤神经干细胞还能产生多种神经营养因子，促进缺血部位神经功能的恢复；⑥神经干细胞可通过血-脑屏障进行远距离扩散却不干扰正常脑组织的功能。

摘要
背景：脑缺血导致神经功能障碍的根本原因是神经元损伤，促进神经元再生是神经功能恢复的关键，而内源性神经干细胞的修复作用有限，外源性神经干细胞移植为脑缺血后组织重构与功能恢复带来希望，但种子细胞的选择仍缺乏系统的比较研究。
目的：比较3种不同来源神经干细胞移植治疗大鼠脑缺血损伤的效果。
方法：分离培养SD大鼠脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞和皮肤来源的诱导性多能干细胞，在体外进行神经向诱导分化7 d检测神经干细胞的转化率。取脑缺血损伤模型造模成功的100只SD大鼠，随机分为模型组、骨髓间充质干细胞来源组、诱导性多能干细胞来源组、脂肪间充质干细胞来源组和磷酸盐缓冲液组，每组20只，移植相应的细胞悬液或磷酸盐缓冲液；另随机取20只SD大鼠为假手术组，20只SD大鼠为对照组，不进行细胞移植。细胞移植后1周和4周进行各项指标检测。
结果与结论：①体外诱导分化7 d后，诱导性多能干细胞来源的神经干细胞的转化率明显高于脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞，差异有显著性意义(P < 0.01)；②移植1周和4周后，移植不同来源神经干细胞的大鼠神经元凋亡数量和脑梗死体积明显小于磷酸盐缓冲液组和模型组(P < 0.05)，诱导性多能干细胞来源组神经功能缺损评分、脑梗死体积和神经元凋亡数量明显低于脂肪间充质干细胞来源组和骨髓间充质干细胞来源组(P < 0.05)；③移植4周时，各组大鼠神经功能缺损评分、神经元凋亡数量和脑梗死体积明显低于移植1周(P < 0.01)；④移植神经干细胞3组大鼠纹状体神经元胞质内尼氏体数量较对照组和假手术组明显增多；⑤研究结果表明，3种来源的神经干细胞均能明显改善神经缺损症状、缩小缺血区域的脑梗死面积、减少神经元变性和凋亡的数量，特别是诱导性多能干细胞具有更高的分化能力和更好的移植效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-3278-1406(钟波)

关键词: 神经干细胞, 脂肪间充质干细胞, 骨髓间充质干细胞, 诱导性多能干细胞, 缺血性脑卒中, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: The underlying mechanism of neurological dysfunction caused by cerebral ischemia is neuronal damage, and facilitating neuronal regeneration is the key to neural function recovery. However, endogenous neural stem cells have limited use in nerve repair. Transplantation of exogenous neural stem cells brings hope for tissue remodeling and functional recovery after cerebral ischemia, but systematic comparative studies on the selection of seed cells are still lacking.
OBJECTIVE: To compare the therapeutic effect of neural stem cells from three sources in the treatment of cerebral ischemia injury in rats.
METHODS: Adipose-derived mesenchymal stem cells (ADMSCs), bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs), and skin-derived induced pluripotent stem cells (iPSCs) from Sprague-Dawley rats were isolated and cultured, and induced in vitro to differentiate into neural stem cells. Conversion efficiency was detected at 7 days of neuronal induction. One hundred rat models of cerebral ischemia were randomized into model, BMSCs, iPSCs, ADMSCs, and PBS groups, with 20 rats in each group. Then, corresponding cell suspension or PBS solution was transplanted in each group. Another 40 Sprague-Dawley rats were taken as sham operation group (n=20) and control group (n=20) with no intervention. Index measurements were performed at 1 and 4 weeks after cell transplantation.
RESULTS AND CONCLUSION: After 7 days of in vitro induction, the conversion efficiency of iPSCs was significantly higher than that of ADMSCs and BMSCs (P < 0.01). At 1 and 4 weeks after transplantation, neuronal apoptosis and infarction size were significantly reduced in the iPSCs, ADMSCs and BMSCs groups as compared with the PBS and model groups (P < 0.05). Moreover, neurological severity score, infarction size and neuronal apoptosis were significantly reduced in the iPSCs group as compared with the ADMSCs and BMSCs groups (P < 0.05). At 4 weeks after cell transplantation, neurological severity score, infarction size and neuronal apoptosis in each group showed significant reduction as compared with the values at 1 week after cell transplantation (P < 0.01). Numbers of Nissl bodies in neurons of the striatum in the three cell transplantation groups were significantly higher than those in the control and sham operation groups. Our findings from this study reveal that neural stem cells differentiated from three sources can significantly improve the symptoms of neurological deficits, and reduce infarction size, neuronal degeneration and neuronal apoptosis. iPSCs especially have better differentiation ability and therapeutic effects than BMSCs and ADMSCs.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Mesenchymal Stem Cells, Bone Marrow, Adipose Tissue, Induced Pluripotent Stem Cells, Neural Stem Cells, Cell Differentiation, Brain Infarction, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

钟波，柳霞，吴伟. 不同来源神经干细胞移植治疗大鼠脑缺血损伤[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(21): 3349-3356.

Zhong Bo, Liu Xia, Wu Wei . Transplantation of neural stem cells from different sources in the treatment of cerebral ischemia injury in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(21): 3349-3356.

图/表（结果） 2

2.1 诱导性多能干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞的鉴定 倒置相差显微镜下，传代脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞呈典型的成纤维细胞样形态，多边形，轮廓清晰，骨髓间充质干细胞表面标志物CD29、CD34、CD90和CD45表达率依次为99.56%，62.73%，97.92%，73.77%，脂肪间充质干细胞表面标志物CD29、CD44、CD90和CD105表达率依次为98.62%，96.75%，100%和97.24%；诱导性多能干细胞克隆光镜下可见边界清晰，细胞聚集成团，免疫荧光染色细胞中SSEA-4呈绿色荧光为阳性表达；传代神经干细胞呈大小不等的细胞团悬浮于培养基中，免疫荧光染色细胞中巢蛋白呈绿色荧光为阳性表达，见图1。

2.2 不同来源神经干细胞的转化率比较 诱导分化7 d后，诱导性多能干细胞来源的神经干细胞的转化率为(89.46±2.63)%，明显高于脂肪间充质干细胞来源(65.32± 3.77)%和骨髓间充质干细胞来源(67.28±4.51)%，差异有显著性意义(P < 0.01)，脂肪间充质干细胞来源的神经干细胞的转化率与骨髓间充质干细胞来源差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.3 实验动物数量分析 用于研究的SD大鼠共150只，随机选取110只进行脑缺血模型建立，其中10只SD大鼠造模不理想予以剔除，将100只造模成功的SD大鼠随机分为5组进行后续实验，每组20只；另将剩余40只SD大鼠随机分为对照组和假手术组，每组20只；最终140只SD大鼠的研究数据进入结果分析，实验过程顺利，无中途脱落。

2.4 各组大鼠神经功能缺损评分比较 移植1周和4周后，脂肪间充质干细胞来源组、骨髓间充质干细胞来源组、诱导性多能干细胞来源组、模型组和磷酸盐缓冲液组大鼠的神经功能缺损评分均明显高于对照组和假手术组(P < 0.01)；模型组和磷酸盐缓冲液组大鼠的神经功能缺损评分均明显高于脂肪间充质干细胞来源组、骨髓间充质干细胞来源组和诱导性多能干细胞来源组(P < 0.01)；移植4周时脂肪间充质干细胞来源组、骨髓间充质干细胞来源组、诱导性多能干细胞来源组和磷酸盐缓冲液组大鼠的神经功能缺损评分均明显低于移植1周(P < 0.01)；移植4周后，诱导性多能干细胞来源组神经功能缺损评分明显低于脂肪间充质干细胞来源组和骨髓间充质干细胞来源组(P < 0.05)，见表1。

2.5 各组大鼠脑梗死体积比较 移植1周和4周后，脂肪间充质干细胞来源组、骨髓间充质干细胞来源组和诱导性多能干细胞来源组的大鼠脑梗死体积明显小于磷酸盐缓冲液组和模型组(P < 0.01)；移植4周时，脂肪间充质干细胞来源组、骨髓间充质干细胞来源组、诱导性多能干细胞来源组、模型组和磷酸盐缓冲液组大鼠脑梗死体积明显低于移植1周(P < 0.01)；移植4周时，诱导性多能干细胞来源组的大鼠脑梗死体积明显低于脂肪间充质干细胞来源组、骨髓间充质干细胞来源组(P < 0.01)，见表2。

2.6 各组大鼠神经元凋亡数量比较 移植1周和4周后，脂肪间充质干细胞来源组、骨髓间充质干细胞来源组和诱导性多能干细胞来源组的大鼠神经元凋亡数量明显小于磷酸盐缓冲液组和模型组(P < 0.01)；移植4周时，脂肪间充质干细胞来源组、骨髓间充质干细胞来源组、诱导性多能干细胞来源组、模型组和磷酸盐缓冲液组大鼠神经元凋亡数量明显低于移植1周(P < 0.01)，见表3。

2.7 各组大鼠神经元丢失情况比较 尼氏染色显示，对照组纹状体的神经元形态正常，尼氏体呈蓝紫色斑块或颗粒状，分布均匀；假手术组纹状体的神经元形态正常，数目无明显改变，尼氏体分布正常；模型组、磷酸盐缓冲液组纹状体构松散、神经元排列紊乱、神经元数量明显减少；脂肪间充质干细胞来源组和骨髓间充质干细胞来源组神经元数量增多，聚集成团；诱导性多能干细胞来源组神经元数量明显增多，排列较整齐，见图2。

2.8 各组大鼠移植的神经干细胞分化率比较 移植1周和4周后，诱导性多能干细胞来源组高于脂肪间充质干细胞来源组、骨髓间充质干细胞来源组(P < 0.01)；移植4周时，脂肪间充质干细胞来源组、骨髓间充质干细胞来源组、诱导性多能干细胞来源组大鼠神经干细胞分化率均明显低于移植1周(P < 0.05)，见表4。

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞实验和随机对照动物模型实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年1至12月在山东大学齐鲁医院完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 8-10周龄SD大鼠150只，雌雄各半，体质量(270±25) g；5周龄SD大鼠15只，体质量(210±20) g，均购于北京维通利华实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK(京)2012-0001，清洁级环境饲养：室温(26±2) ℃，湿度为(70±5)%，12 h/12 h明暗交替、自由饮食。实验过程中对大鼠的处置完全符合由中国科学院生物研究伦理委员会批准的国家健康指南中关于实验室动物饲养和使用的各项规则。

1.3.2 实验试剂与仪器 胰蛋白酶、Ⅰ型胶原蛋白酶、维甲酸(美国Sigma公司)；DMEM培养基、神经细胞诱导培养基、成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、胰岛样生长因子1、脑源性神经生长因子和干细胞因子(美国Gibco公司)；兔抗鼠Nestin单克隆抗体、兔抗鼠神经元核抗原(NeuN)单克隆抗体、兔抗鼠Brdu单克隆抗体、兔抗鼠GFAP多克隆抗体和Tunel细胞凋亡检测试剂盒(美国Abcam公司)；TTC染色试剂(美国Amresco公司)；二氧化碳培养箱(美国THERMO公司)；超净工作台(苏州净化设备厂)；全自动显微照相系统和荧光显微镜(德国Leica公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠脑缺血损伤模型建立与评估 根据文献[11]报道，采用线栓法建立大鼠缺血性脑卒中模型，方法如下：随机取110只SD大鼠，腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)进行麻醉，将大鼠仰卧固定于解剖操作台上，剪毛并消毒颈部，做颈部正中切口，钝性分离皮下各层组织，暴露右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，结扎颈外动脉远端并剪断，经颈外动脉插入头端涂硅胶的线栓至颈内动脉-翼腭动脉分叉深部6 mm处，成功阻断大脑中动脉的血液供应，1.5 h后拔除线栓，逐层缝合。另随机取20只SD大鼠为假手术组只分离颈总、颈内和颈外动脉，不结扎；20只SD大鼠为对照组，不进行任何处理。

分别于造模后1 d和1周对各组大鼠进行神经功能缺损严重程度判断，参照Cheng等^[12]报道的神经功能缺损症状评分方法评价神经功能缺损程度，评分标准：无神经缺损症状为正常计0分；对侧前爪不能伸展为轻度缺损计1分；提起鼠尾后，对侧肩内收、前肢内旋，行走时向对侧转圈为中度缺损计2分；行走时向对侧跌倒为重度缺损计3分；意识丧失或不能自行行走计4分。评分2分或3分为造模成功。

1.4.2 不同来源神经干细胞制备、诱导分化与鉴定

大鼠脂肪间充质干细胞来源的神经干细胞制备^[13]：取5只5周龄SD大鼠，麻醉后在无菌条件下取双侧腹股沟脂肪组织，用含抗生素的PBS彻底冲洗后加入0.1%Ⅰ型胶原酶消化30 min，用100目滤网过滤至离心管，经1 500 r/min离心10 min后，弃上清液，加入6 mL DMEM培养基制成细胞悬液，接种于培养皿中培养，每隔2 d换液1次，待细胞融合达到85%时传代培养，应用流式细胞术检测第3代脂肪间充质细胞的表面标志物CD29、CD44、CD90和CD105。取第3代贴壁细胞用含10 μg/L成纤维细胞生长因子、20 μg/L表皮细胞生长因子、10 μg/L胰岛样生长因子1、10 μg/L脑源性神经生长因子和5 μg/L干细胞因子的神经细胞诱导培养基进行培养，7 d后形成神经球，进行鉴定获得神经干细胞。

大鼠骨髓间充质干细胞来源的神经干细胞制备^[14]：分离上述5只SD大鼠股骨和胫骨，无菌条件下暴露骨髓腔，用DMEM培养基反复冲洗，收集冲洗液，低温1 000 r/min离心10 min，，弃上清液，加入6 mL DMEM培养基制成细胞悬液，接种于培养皿中培养，每隔2 d换液1次，待细胞融合达到85%时传代培养，应用流式细胞术检测第3代脂肪间充质细胞的表面标志物CD29、CD34、CD90和CD45。取第3代骨髓间充质干细胞用含5%葡萄糖、10 μg/L成纤维细胞生长因子、20 μg/L表皮细胞生长因子、10 μg/L胰岛样生长因子1、10 μg/L脑源性神经生长因子和5 μg/L干细胞因子的神经细胞诱导培养基进行培养，7 d后形成神经球，进行鉴定即获得神经干细胞。

大鼠诱导性多能干细胞来源的神经干细胞制备^[15]：分离上述5只SD大鼠皮肤组织5 mm²，0.25%胰酶消化3次获得成纤维细胞，将细胞接种于底部涂有明胶的培养皿，用携带OCT4、SOX2和KLF4 cDNAs的慢病毒转染30 d后挑取诱导性多能干细胞样克隆，传代并应用荧光实时定量PCR法检测诱导性多能干细胞中多能性标志物Oct3/4、Nanog、SSEA-4和TRA1-60的表达，免疫荧光检测细胞中SSEA-4的表达。取诱导性多能干细胞克隆移至一培养皿中，差速贴壁30 min，去除饲养层细胞，使用含10 μg/L成纤维细胞生长因子、20 μg/L表皮细胞生长因子、10 μg/L胰岛样生长因子1、10 μg/L脑源性神经生长因子和5 μg/L干细胞因子的神经细胞诱导培养基培养，7 d后形成神经管样结构，制成细胞悬液悬浮培养4 d形成神经球，进行鉴定即获得神经干细胞。

神经干细胞形态学鉴定^[16]：应用免疫荧光方法用抗巢蛋白(Nestin)抗体进行染色鉴定神经干细胞，方法如下：于诱导后7 d取培养的神经干细胞制成细胞悬液，用预冷的丙酮固定5 min，Tritonx-100膜上打孔，体积分数为10%山羊血清封闭30 min，用抗Nestin单克隆抗体(工作浓度为1∶100)4 ℃孵育过夜，次日加入荧光标记的IgG(工作浓度为1∶200)，室温避光孵育60 min，封固后荧光显微镜下观察并摄片，胞质内有绿色荧光为阳性表达。

1.4.3 神经干细胞移植 造模1周后，去除造模不成功和死亡的10只大鼠，将造模成功的100只SD大鼠用随机数字表法分为5组，每组20只。①模型组造模成功但不移植神经干细胞；②脂肪间充质干细胞来源组移植脂肪间充质干细胞来源的神经干细胞；③骨髓间充质干细胞来源组移植骨髓间充质干细胞来源的神经干细胞；④诱导性多能干细胞来源组移植诱导性多能干细胞来源的神经干细胞；⑤磷酸盐缓冲液组只注射磷酸盐缓冲液。假手术组不进行细胞移植，只注射生理盐水；对照组不进行任何处理。

根据文献[17]的移植方法进行神经干细胞移植：常规麻醉后将大鼠仰卧固定于解剖台上，应用脑立体定位仪定位大鼠右侧纹状体，以Bregma点为坐标零点，使AP=0 mm，ML=2.0 mm，DV=4.5 mm，收集不同来源神经干细胞用磷酸盐缓冲液制成细胞浓度为2×10¹⁰ L^-1的细胞悬液，用微量注射器取10 μL细胞悬液或磷酸盐缓冲液以0.15 μL/s的速度注入纹状体内，结束后留针20 min再拔针。

1.4.4 神经干细胞的转化率 应用流式细胞术检测不同来源干细胞向神经干细胞的转化效率，诱导分化7 d后，经0.25%胰蛋白酶消化，PBS洗涤，制成细胞浓度为1×10⁶ L^-1的单细胞悬液，用Nestin或FITC标记的单克隆抗体室温下避光孵育40 min，磷酸盐缓冲液洗涤后上流式细胞仪检测Nestin细胞阳性率为诱导分化的神经干细胞转化率。

1.4.5 移植后神经功能评分移植1周和4周后，参照文献[18]方法，对各组大鼠进行Garcia JH评分，从运动、感觉、反射和平衡能力4个方面评价神经功能，无神经功能损害为0分，最高总分值为18分，分数越高表示损伤的程度越重。

1.4.6 脑梗死体积测量 移植1周和4周后，应用TTC染色法测量脑梗死面积^[19]。每个时间点每组取10只大鼠。常规麻醉大鼠后，迅速断头取脑，去除嗅球、小脑头尾两端和低位脑干，放入-20 ℃冷冻10 min，做脑组织冠状面切片，厚度为30 μm，每隔2 mm切片一张，将脑片置于含2%TTC溶液的培养皿中，37 ℃避光孵育30 min，染色后正常脑组织呈红色，梗死区域组织呈白色，40 g/L多聚甲醛固定24 h，数码相机拍照，应用Image Pro Plus 6.0软件分析10张脑片的梗死面积，根据公式：①脑梗死面积=健侧面积之和-患侧未发生梗死面积；②脑梗死体积=脑梗死面积×30 (切片厚度)；③脑梗死体积=对侧大脑体积-同侧未梗死大脑的体积，计算梗死体积。分别采用公式①+②和③两种方法计算脑梗死体积取平均值，降低水肿对梗死体积的影响程度，减小误差。

1.4.7 梗死脑组织神经细胞凋亡情况 移植1周和4周后，应用Tunel染色法检测梗死脑组织神经细胞凋亡数^[20]。严格按照Tunel细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作，用体积分数为3%H₂O₂室温下处理脑组织冰冻切片10 min，蒸馏水冲洗后加入蛋白酶工作液于37 ℃消化10 min，每张脑片上滴加20 μL标记液于37 ℃标记2 h，漂洗后依次滴加50 μL封闭液、抗地高辛抗体工作液和SABC液，室温封闭 30 min，漂洗后DAB显色，水洗，苏木精复染1 min，流水冲洗、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封固，显微镜下观察并摄片，细胞核中有棕黄色颗粒为凋亡阳性细胞，选取10个400倍显微视野，计数阳性细胞求平均值。

1.4.8 神经元丢失情况 移植1周和4周后，应用尼氏染色法观察神经元的丢失情况^[21]。常规脑组织石蜡切片，37 ℃烘烤30 min，蒸馏水漂洗后甲苯胺蓝染液染色15 min，蒸馏水漂洗、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封固，显微镜下观察并摄片，胞质内有蓝色颗粒为阳性细胞。

1.4.9 移植的神经干细胞分化情况 移植1周和4周后，应用免疫荧光双标记法检测移植的神经干细胞的分化情况^[22]。用0.1%TritonX-100孵育脑组织冰冻切片10 min，体积分数为10%山羊血清室温封闭30 min，兔抗鼠NeuN/ GFAP多克隆抗体(工作浓度均为1∶150)4 ℃孵育过夜，次晨滴加FITC标记的二抗(工作浓度为1∶200)室温孵育60 min，漂洗后40 g/L多聚甲醛固定10 min，2 mol/L HCl 37 ℃孵育30 min，体积分数为10%山羊血清室温封闭30 min，兔抗鼠Brdu单克隆抗体(工作浓度为1∶100)4℃过夜，次晨滴加FITC标记的二抗(工作浓度为1∶200)室温孵育60 min，漂洗后荧光显微镜观察并摄片，Brdu/NeuN双标阳性细胞为由神经干细胞分化的神经元，Brdu/GFAP双标阳性细胞为由神经干细胞分化的神经胶质细胞。将右侧侧脑室下区切片用图像分析系统计数10个400高倍视野中Brdu/NeuN和Brdu/GFAP阳性细胞数。神经干细胞分化率= (Brdu/NeuN阳性细胞数+Brdu/GFAP阳性细胞数)/Brdu阳性细胞数×100%。

1.5 主要观察指标 ①诱导分化后7 d检测神经干细胞的转化率；②细胞移植后1周和4周各组大鼠神经功能缺损评分、脑梗死体积、神经细胞凋亡计数、神经元丢失与移植的神经干细胞分化情况。

1.6 统计学分析 应用SPSS 17.0统计软件进行统计，计量资料用x(_)±s表示，组间比较采用单因素方差分析和t 检验，组间两两比较采用LSD-t 检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

干细胞的自我更新与多向分化潜能为临床难治性疾病的治疗提供了种子细胞^[23]。近年来，有研究表明神经干细胞移植能够恢复或改善脑出血模型动物的部分神经功能^[24]。静脉注射到模型动物脑内的神经干细胞能分化为神经元和星形胶质细胞，运动功能得到明显改善^[25]。随后的多个实验研究证实神经干细胞、胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞、脐血干细胞和脂肪间充质干细胞均能在脑卒中动物模型脑内发生神经元样细胞分化，脑损伤动物的行为能力在移植后4周内得到显著改善。研究还发现，移植诱导分化的神经干细胞的治疗效果优于直接移植未经分化的干细胞^[26-29]。虽然大脑是免疫豁免区，但研究发现异体种子细胞来源的神经干细胞移植，很难长时间存活发挥神经修复作用^[30]。胚胎干细胞来源的种子细胞面临伦理和致瘤等问题；脐血来源的干细胞不仅数量有限，保存成本高且有感染未知病原菌的可能^[31]。因此，理想的干细胞来源和高效的神经干细胞诱导分化是干细胞移植治疗疾病的关键。干细胞移植治疗出血性脑卒中的作用机制主要是移植的干细胞在梗死组织内分化为具有功能的神经元替代死亡神经元、旁分泌调节局部微环境内的营养因子和促进血管再生^[32-34]。实验选取脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、诱导性多能干细胞作为神经干细胞的种子细胞来源，观察神经干细胞的转化效率和移植后的疗效，结果发现，3种来源的神经干细胞在移植后均能改善模型大鼠的神经功能缺损症状，其中诱导性多能干细胞来源的神经干细胞更明显减少梗死区域神经元的凋亡与变性损伤，说明诱导性多能干细胞来源的神经干细胞移植后向神经元分化的比例高于脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞来源的神经干细胞，可能原因是诱导性多能干细胞比成体干细胞具有更强大的自我更新能力和多向分化潜能。

在神经干细胞治疗神经系统相关疾病的研究中，外源性神经干细胞移植一直是主要的研究手段，诱导不同来源的种子细胞分化为神经干细胞的技术与方法已经成熟和完善^[35-37]。作者在前期的大量工作中已完成脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞和皮肤来源的诱导性多能干细胞等多种干细胞的提取和鉴定，均成功诱导出神经干细胞，在将这些细胞诱导分化为神经干细胞的过程中发现，诱导性多能干细胞来源的神经干细胞转化率明显高于脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞，而脂肪间充质干细胞来源的神经干细胞的转化率与骨髓间充质干细胞相当，说明诱导性多能干细胞作为种子细胞可以获得更多的神经干细胞，能很好的解决移植细胞数量的问题^[38]。但诱导性多能干细胞的致瘤性一度使其治疗的安全性受到很大挑战^[39]。研究发现，直接移植诱导性多能干细胞确实提高了受区肿瘤发生率，但经诱导分化为不同阶段的细胞再用于移植时，则显著降低了成瘤风险^[40]。虽然脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞的生物安全性高，在体内、外没有致瘤性，但直接移植后向神经细胞的分化效率远远低于二者来源的神经干细胞^[41]。同时，3种种子细胞来源于自体，可以建立与受者遗传背景相似的供体细胞，可提供针对性强的个体化治疗。因此，先将种子细胞在体外诱导为神经干细胞再进行移植，随后对移植的效果进行形态与功能两方面的观察和比较。

神经功能缺损症状评分结果显示，移植1周和4周后，模型组和各移植组大鼠的神经功能缺损评分均明显高于对照组和假手术组，但3个神经干细胞移植组大鼠的神经功能缺损评分均明显低于模型组和磷酸盐缓冲液组，说明神经干细胞移植确实能明显改善受损的神经功能。同时研究还发现，脂肪间充质干细胞组、骨髓间充质干细胞组、诱导性多能干细胞组和磷酸盐缓冲液组大鼠移植4周的神经功能缺损评分均明显低于移植1周，不仅说明神经干细胞移植促进神经功能恢复需要一定的时间，还说明没有进行干细胞移植的磷酸盐缓冲液组大鼠的神经功能也在恢复，这与文献[42]中报道的缺血性脑损伤修复机制中内源性神经干细胞发挥一定作用的结果相似。此外，研究还发现，移植4周后，诱导性多能干细胞组神经功能缺损评分明显低于脂肪间充质干细胞组和骨髓间充质干细胞组，提示诱导性多能干细胞来源的神经干细胞可能在脑组织损伤修复过程中的作用更明显。

为了进一步探讨原因，从形态学角度分别观察了移植后受区脑组织内神经元的凋亡和丢失情况。神经元凋亡结果显示，各移植组大鼠的神经元凋亡数量明显小于磷酸盐缓冲液组和模型组，并且移植4周后大鼠神经元凋亡数量明显低于移植1周后，说明移植神经干细胞确实能减少受损组织内神经元的凋亡，可能原因是内源性和外源性神经干细胞同时发挥旁分泌生长因子与营养因子的作用。神经元丢失情况结果显示，各移植组纹状体内神经元胞质内尼氏体数量较对照组和假手术组明显增多，说明发生变性坏死的神经元数量明显减少，此结果与神经元凋亡结果一致，也与脑梗死体积变化的实验结果一致。虽然有研究证实缺血性脑损伤能够引起脑组织中的内源性神经干细胞发生募集、增殖和分化，但再生数量和时间有限，而且多向神经胶质细胞分化，因此，外源神经干细胞移植治疗缺血性脑损伤必不可少^[43]。移植神经干细胞分化率的比较结果显示，移植1周和4周后，诱导性多能干细胞来源组神经干细胞分化率高于脂肪间充质干细胞来源组、骨髓间充质干细胞来源组；移植4周时，各组神经干细胞分化率均明显低于移植1周后，提示随着移植时间的延长神经干细胞的分化效率会逐渐降低，但诱导性多能干细胞来源的神经干细胞的分化率降低较慢，且在不同移植时间点的分化率均高于脂肪间充质干细胞来源和骨髓间充质干细胞来源的神经干细胞，可能原因是移植的神经干细胞分化为神经元和神经胶质细胞；神经干细胞移植可抑制脑损伤部位神经元的凋亡，但随着移植时间的延长，神经干细胞的分化效率会逐渐降低使神经元的增加幅度减小。

综上所述，来源于脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞和诱导性多能干细胞的神经干细胞移植治疗缺血性脑损伤，不仅能明显改善损伤的神经功能，使神经缺损症状减轻，还能缩小缺血区域的脑梗死体积、减少神经元变性和凋亡的数量，特别是诱导性多能干细胞具有更强的分化能力和更好的脑组织损伤修复效果，为神经干细胞移植治疗缺血性脑损伤从基础研究向临床应用转化提供最佳的治疗选择。

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