1.1 设计 随机对照动物实验。
1.2 时间及地点 于2016年1月至2016年6月在内蒙古医科大学分子病理实验室(内蒙古自治区重点实验室)完成。
1.3 材料 健康4月龄新西兰大耳白兔20只,雌雄不限,体质量2.0-3.5 kg,由内蒙古农业大学动物实验中心提供。许可证号:SYXK(蒙)20160075。所有实验动物标准饮食,通风,普通饲料,单笼喂养。
1.4 实验方法
1.4.1 实验分组与动物模型制作 20只兔适应性喂养1周后,精确称体质量,采用随机数字法将其随机分成实验组和对照组,每组10只,实验组动物于臀肌注射甲强龙 (7.5 mg/kg),每周2次,持续给药8周。对照组动物以同种方式于相同部位注射等量生理盐水,并在同一条件下,单笼喂养,8周后空气栓塞法处死实验动物,在相对无菌条件下切取双侧股骨头组织。Yusuke等[18]通过临床影像学观察应用大剂量皮质类固醇激素治疗的患者,激素开始应用后第3周后便可以在STIR序列图像中观察到股骨头内的异常结节。他们的研究还发现激素导致的骨坏死在激素使用的早期阶段发生,激素诱发的股骨头缺血性坏死,使用激素后1周便可以出现股骨头组织的病理改变[19]。既往研究证实正常成年家兔股骨头软骨下区空缺骨陷窝率为8%-12%,同等制片条件下股骨头软骨下空缺骨陷窝率超过此数目即提示骨坏死,造模成功[1,4]。并在苏木精-伊红染色切片上随机在100倍放大倍率的高倍镜下,任选10个镜视野,每个视野计数50个骨陷窝, 分别计数空骨陷窝数,求出空骨陷窝率(空骨陷窝数/500),即每500个骨陷窝中的空骨陷窝所占比例。
1.4.2 骨组织切片的制备 所取股骨头组织一侧用体积分数5%戊二醛溶液固定,另一侧浸泡于体积分数10%的甲醛溶液中固定。将体积分数10%中性甲醛溶液处理后的股骨头组织用PBS、双蒸水各洗3×20 min后分别放入已经编号的10% EDTA 脱钙液广口瓶内室温脱钙(容器容积要大于股骨头组织体积的10倍为宜),3 d更换脱钙液1次,直至骨组织变软(骨组织以刀片切割无阻力为准),脱钙后用双蒸水洗数次备用。组织脱水、透明及浸蜡(全自动组织脱水机):石蜡切片机4 μm切片、脱蜡、复水、苏木精-伊红染色、脱水、透明,中性树胶封固,光学显微镜(日本Olympus公司)下观察。
1.4.3 透射电子显微镜标本制备 取体积分数5%戊二醛固定的股骨头组织,在股骨头软骨下及骺板下取2 mm× 2 mm×2 mm大小的骨块以体积分数2.5%戊二醛溶液4 ℃固定2 h;脱水,包埋,切片:超薄切片机切片70 nm;染色:体积分数3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色;透射电镜(日本Olympus公司)观察。
1.4.4 组织切片观察 标本经过固定、脱水、透明、浸蜡、包埋等处理后,切片机4 μm切片,多聚赖氨酸处理载玻片行苏木精-伊红染色(详细方法见上述),光学显微镜观察股骨头骨小梁及骨细胞形态结构、脂肪细胞大小、关节软骨结构及空骨陷窝多少。正常成年家兔股骨头软骨下区空缺骨陷窝率为8%-12%,同等制片条件下股骨头软骨下空缺骨陷窝率超过此数目即提示骨坏死。
1.4.5 TUNEL法检测细胞凋亡 TUNEL染色试剂盒购自武汉博士德公司,切片常规脱蜡至水,用体积分数3% H2O2溶液室温处理10 min;每个标本加Proteinase K 1滴37 ℃孵育箱消化10 min;生物素化抗地高辛抗体50 μL/张切片标本37 ℃ 30 min;加SABC 10 μL,37 ℃ 30 min;DAB显色:新鲜配好的DAB显色液混匀,每片加1滴,室温显色5 min(根据显色情况而定),水洗;苏木精轻度复染,自来水洗,梯度乙醇二甲苯脱水、透明、中性树胶封固,光学显微镜观察。每张玻片随机选择10个区域,每个区域计数100个骨细胞,统计出凋亡的细胞数量,计算细胞凋亡指数(率)=凋亡阳性细胞计数/同一类型细胞总数)×1 000‰。
1.4.6 免疫组织化学法检测细胞色素C、Caspase-9阳性表达 免疫组织化学染色试剂盒购自武汉博士德公司。石蜡切片常规脱蜡,0.01 mol/L PBS(pH 7.4)洗3 min×3次;每张切片加1滴体积分数3% H2O2,室温下孵育10 min,以阻断内源性过氧化物酶的活性。0.01 mol/L PBS(pH 7.4)洗3 min×3次;除去PBS,每张切片加1滴兔抗细胞色素C、Caspase-9抗体(按1∶50),室温下孵育2 h。0.01 mol/L PBS (pH 7.4)洗3 min×5次;除去PBS液,每张切片加1滴聚合物增强剂(试剂A),阴性对照不加,室温下孵育20 min。0.01 mol/L PBS (pH 7.4)洗3 min×3次;除去PBS,每张切片加1滴酶标抗鼠/兔聚合物(试剂B),室温下孵育30 min。除去PBS,每张切片加1滴新鲜配制的DAB显色液3 min;苏木精复染,自来水冲洗,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,封固。光镜下观察细胞着色情况,设计阳性对照和阴性对照,染色阳性细胞着色定于胞核内,呈棕褐色或棕黄色,少数胞浆内出现阳性颗粒,胞质着黄褐色为阳性。每张玻片随机选择10个区域,每个区域计数100个骨细胞,统计出阳性表达的细胞数量,即为每1 000个细胞中的阳性表达数。阳性表达率=阳性表达细胞计数/同一类型细胞总数)×100%。
1.5 主要观察指标 ①实验动物一般情况;②股骨头形态观察;③标本苏木精-伊红染色观察;④电子显微镜观察凋亡小体;⑤计算各组股骨头组织空缺骨陷窝率,骨细胞凋亡率,细胞色素C和Caspase-9阳性表达率。
1.6 统计学分析 实验数据结果以x±s表示,应用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析,经正态性检验后,采用两独立样本t 检验比较组间数据差异,相关性分析采用Pearson相关分析法,P < 0.05为差异有显著性意义。
中国组织工程研究杂志出版内容重点:组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程