脂肪间充质干细胞对硬皮病小鼠皮损组织成纤维细胞增殖的影响及其机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0657

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
成纤维细胞：是皮肤组织受损后的主要修复细胞，其正常增殖、分化是维持皮肤正常结构及生理功能的重要因素。当皮肤组织受到外界刺激后，成纤维细胞被激活，进入增殖和代谢旺盛期，合成胶原蛋白、纤连蛋白等多种细胞外基质，这对真皮纤维化疾病具有重要意义。
硬皮病：即系统性硬化症，是以成纤维细胞过度增殖、细胞外基质过量积聚、免疫系统异常等为主要特征的纤维组织过度增生性疾病，其主要治疗方式多集中于免疫抑制剂、改善血管活性药物等，但治疗效果有限且不良反应较多，探究更安全、有效的治疗方法迫在眉睫。

摘要
背景：脂肪间充质干细胞在体外长期培养过程中始终保持多向分化潜能，可通过分泌多种抗纤维化细胞因子或生长因子，参与调节成纤维细胞增殖、抑制胶原沉积而发挥抗纤维化作用。
目的：观察脂肪间充质干细胞对硬皮病小鼠皮损组织成纤维细胞增殖、凋亡的影响，并初步探讨相关机制。
方法：从硬皮病小鼠模型皮损组织分离、纯化出成纤维细胞，经传代培养后，根据处理方式分为5组：空白对照组(A组)、脂肪间充质干细胞干预组(B组)、Wnt抑制剂HY-15597处理组(C组)、Wnt激活剂SB-216763处理组(D组)、脂肪间充质干细胞+SB-216763处理组(E组)。MTT法和流式细胞仪检测各组成纤维细胞增殖率和凋亡率；蛋白免疫印迹法检测各组成纤维细胞中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和Wnt信号通路相关蛋白表达水平。
结果与结论：①与A组相比，B组和C组成纤维细胞增殖率均显著降低、凋亡率显著升高，D组增殖率显著增加、凋亡率降低，且呈时间依赖性(P < 0.05)。与D组相比，E组成纤维细胞增殖率显著较低，凋亡率较高(P < 0.05)；②与A组相比，B组和C组成纤维细胞中羟脯氨酸含量以及Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、Wnt2、Wnt3a、β-catenin表达水平均显著降低，而D组均显著增加(P < 0.05)。E组羟脯氨酸含量和Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、Wnt2、Wnt3a、β-catenin水平均显著低于D组(P < 0.05)；③结果表明，脂肪间充质干细胞可以抑制硬皮病小鼠皮损组织成纤维细胞的增殖和胶原沉积，且这一过程与其对Wnt/β-catenin信号通路的抑制作用有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-9560-4250(王维)

关键词: 硬皮病, 脂肪间充质干细胞, 成纤维细胞, 细胞增殖, Wnt/β-catenin信号通路, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: Adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSCs) maintain the potential of multidirectional differentiation during long-term culture in vitro, and can secrete various anti-fibrotic cytokines or growth factors that are involved in regulating fibroblast proliferation and inhibiting collagen deposition, and thereby exert anti-fibrotic effects.
OBJECTIVE: To investigate the effects of ADSCs on the proliferation and apoptosis of fibroblasts in scleroderma mice and to explore the underlying mechanisms.
METHODS: Fibroblasts were isolated and purified from the skin tissue of scleroderma mice. After passage, the cells were divided into five groups according to different treatment methods: control group, ADSCs intervention group, Wnt inhibitor HY-15597 treatment group (Wnt inhibitor group), Wnt activator SB-216763 treatment group (Wnt activator group), ADSCs+SB-216763 treatment group (combined group). Cell proliferation rate and apoptosis rate were detected using MTT and flow cytometry. The levels of collagen type I, collagen type III, and Wnt signaling pathway related proteins were detected and compared.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the proliferation rate of fibroblasts in the ADSCs intervention group and Wnt inhibitor group decreased and the apoptotic rate of fibroblasts increased significantly, while the proliferation rate increased and the apoptosis rate decreased in the Wnt activator group in a time-dependent manner (P < 0.05). Compared with the Wnt activator group, the proliferation rate of fibroblasts in the combined group was significantly lowered and the apoptotic rate was significantly increased (P < 0.05). Compared with the control group, the expression of hydroxyproline, collagen type I, collagen type III, Wnt2, Wnt3a, and β-catenin in the fibroblasts of ADSCs intervention group and Wnt inhibitor group were significantly decreased, while those in the Wnt activator group were significantly increased (P < 0.05). The levels of hydroxyproline, collagen type I, collagen type III, Wnt2, Wnt3a, and β-catenin in the combined group were significantly lower than those in the Wnt activator group (P < 0.05). The overall results indicate that ADSCs can inhibit the proliferation and collagen deposition of fibroblasts in the lesion tissue of mouse scleroderma models by inhibition of the Wnt/β-catenin signaling pathway.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Skin and Connective Tissue Diseases, Fibroblasts, Adipose Tissue, Mesenchymal Stem Cells, Wnt Proteins, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

王维，黄玉成，陈燕辉. 脂肪间充质干细胞对硬皮病小鼠皮损组织成纤维细胞增殖的影响及其机制[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(33): 5249-5254.

Wang Wei, Huang Yu-cheng, Chen Yan-hui. Effects of adipose-derived mesenchymal stem cells on fibroblast proliferation in mouse scleroderma lesions and underlying mechanisms[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(33): 5249-5254.

图/表（结果） 7

2.1 成纤维细胞形态及鉴定结果 第3代成纤维细胞在培养基中孵育24 h后，于倒置显微镜下可见细胞呈梭形，胞体细长，部分细胞核仁明显(图1)。免疫荧光染色显示，成纤维细胞表面标志物波形蛋白呈阳性表达，符合成纤维细胞特征(图2)。

2.2 脂肪间充质干细胞形态及鉴定结果 第4代脂肪间充质干细胞在培养基中孵育24 h后，于倒置显微镜下观察到细胞呈漩涡状或放射样分布，细胞形态以梭形或成纤维样为主，细胞核清晰可见(图3)。流式细胞仪检测CD44和CD29高表达(99.29%，98.68%)，而CD45和CD11b几乎不表达(0.29%，0.07%)，符合脂肪间充质干细胞特点(图4)。

2.3 脂肪间充质干细胞对硬皮病成纤维细胞增殖的影响 细胞培养48 h和72 h后，与A组相比，B组和C组成纤维细胞增殖率均显著降低，而D组成纤维细胞增殖率显著增加，差异均有显著性意义(P < 0.05)。在48 h和72 h，E组成纤维细胞增殖率显著低于D组，差异有显著性意义(P < 0.05)。B组、C组、E组成纤维细胞增殖率随时间的延长逐渐降低(P < 0.05)，而D组成纤维细胞增殖率随时间的延长逐渐增加(P < 0.05)，见表1。

2.4 脂肪间充质干细胞对硬皮病成纤维细胞凋亡的影响 与A组相比，B组和C组成纤维细胞凋亡率均显著增加，而D组细胞凋亡率显著降低，差异均有显著性意义(P < 0.05)。与D组相比，E组细胞凋亡率显著增加，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图5和表2。

2.5 脂肪间充质干细胞对硬皮病成纤维细胞胶原合成、Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白表达的影响 与A组相比，B组和C组成纤维细胞中羟脯氨酸含量、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原蛋白表达水平均显著降低，而D组显著增加，差异均有显著性意义(P < 0.05)。与D组相比，E组羟脯氨酸含量、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原蛋白表达水平均显著降低，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图6和表3。

2.6 脂肪间充质干细胞对Wnt/β-catenin信号通路的影响 与A组相比，B组和C组成纤维细胞中Wnt2、Wnt3a、β-catenin蛋白表达水平均显著降低，而D组显著增加，差异均有显著性意义(P < 0.05)。与D组相比，E组Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达水平均显著降低，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图7和表4。

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引言

材料方法

1.1 设计 体外细胞学对比观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2017年7至9月在郑州人民医院实验室完成。

1.3 材料 SPF级4-6周龄雌性C57BL/6小鼠6只，体质量15-18 g，购自河南远大生物制药有限公司，许可证号：SYXK(豫)2017-0014。Wnt信号通路特异性抑制剂HY-15597和激活剂SB-216763购自美国Sigma-Aldrich公司；Western blot蛋白测定试剂盒、羟脯氨酸测试剂盒及主要抗体购自美国BD公司。

1.4 方法

1.4.1 硬皮病小鼠成纤维细胞的分离纯化及培养 根据参考文献[6]制备硬皮病小鼠模型。取6周龄C57BL/6J雌性小鼠，剃除背部局部毛发，标记药物注射部位，于标记部位皮下注射博来霉素稀释液500 mg/L×0.1 mL，1次/d，连续3周。造模过程中小鼠皮肤毛发脱落，皮肤逐渐增厚，弹性变差，至3周末时皮肤明显增厚、硬化，毛发严重脱落，则证实造模成功。造模完成后，取模型制备成功的硬皮病小鼠3只，麻醉后切取皮损边缘皮肤组织，于胶原酶溶液中消化分散成纤维细胞，经过滤、离心、洗涤后，置于含体积分数为10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM培养基中进行原代培养。倒置相差显微镜下观察成纤维细胞形态，采用免疫荧光染色进行鉴定。待梭形成纤维细胞生长至80%-90%融合时进行传代培养。

1.4.2 小鼠脂肪间充质干细胞的分离纯化及鉴定 将4周龄雌性C57BL/6小鼠脱颈处死，无菌条件下取腹股沟脂肪组织1 g，PBS冲洗后，剪碎成约1 mm²组织块，加入同等体积0.1%Ⅰ型胶原酶，于37 ℃，200 r/min恒温摇床中消化40-60 min，1 000 r/min离心8 min，弃上清，加入含体积分数为15%胎牛血清的DMEM培养基，调整细胞悬液的细胞浓度为1×10⁷ L^-1，接种于培养皿中，24 h后更换培养基，贴壁细胞生长至80%融合，进行传代培养。取第4代脂肪间充质干细胞，倒置相差显微镜下观察其形态，采用流式细胞术进行表面标志物分析鉴定。将第4代脂肪间充质干细胞重悬于无血清培养基中，调整细胞浓度为1×10⁹ L^-1，用于后续实验。

1.4.3 成纤维细胞分组及处理 将生长良好的第3代对数期硬皮病小鼠成纤维细胞根据处理方式分为5组：空白对照组(A组)、脂肪间充质干细胞干预组(B组)、HY-15597处理组(C组)、SB-216763处理组(D组)、脂肪间充质干细胞+SB-216763处理组(E组)。Transwell小室下室加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基，A组于Transwell小室的上室中接种无血清培养基重悬的成纤维细胞，2×10⁶/孔，不进行任何处理；B组于Transwell小室的上室中接种2×10⁶/孔成纤维细胞和100 μL脂肪间充质干细胞；C组于Transwell小室的上室中接种2×10⁶/孔成纤维细胞，再加入25 μg/L Wnt/β-catenin信号通路特异性抑制剂HY-15597；D组于Transwell小室的上室中接种2×10⁶/孔成纤维细胞，再加入25 μg/L Wnt/β-catenin信号通路特异性激活剂SB-216763；E组于Transwell小室的上室中接种2×10⁶/孔成纤维细胞和100 μL脂肪间充质干细胞共培养30 min，再加入SB-216763进行处理。

1.5 主要观察指标

1.5.1 成纤维细胞增殖率 培养24，48，72 h后，每孔中加入100 μL MTT(5 g/L)孵育4 h，弃上清，加入750 μL二甲基亚砜孵育10 min，振荡溶解，转移至96孔板，每孔重复7次，于490 nm酶标仪下测定吸光度值(A值)。增殖率=(实验组A值-对照组A值)/对照组A值。

1.5.2 成纤维细胞凋亡率 培养3 d后，将各组细胞用胰蛋白酶消化，PBS洗涤3次，加入体积分数为75%乙醇于4 ℃下过夜，PBS洗涤，加入10 μL RNA酶于37 ℃下孵育30 min，用Annexin V-FITC和PI对细胞进行双重染色，上流式细胞仪进行分析。

1.5.3 羟脯氨酸含量 培养3 d后，取上清液，应用羟脯氨酸测定试剂盒检测羟脯氨酸含量，所有操作均严格按照说明书进行。

1.5.4 蛋白表达分析 培养3 d后，收集细胞，加入PMSF裂解后，采用蛋白质提取试剂盒提取总蛋白质。将蛋白质(120 μg)在变性的12%聚丙烯酰胺凝胶上分离并转移到聚偏二氟乙烯膜上。使用以下一抗：Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、Wnt2、Wnt3a、β-catenin和内参照β-actin(1∶200)，与膜一起于4 ℃孵育过夜，然后用HRP缀合的二抗于室温下孵育1 h，应用Quantity One软件评估相对蛋白表达水平。

1.6 统计学分析 采用SPSS 20.0统计软件对数据进行分析。计量资料以x(_)±s表示，两组间比较行t 检验，多组间比较行方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

硬皮病的病因和发病机制尚未完全明确。目前认为，外界刺激使机体免疫系统过度激活，引起微血管损伤和组织炎症反应，进一步促进成纤维细胞过度增殖和细胞外基质过度分泌，造成胶原代谢异常，最终导致组织纤维硬化。成纤维细胞作为皮肤真皮最主要的细胞，其增殖、分化是维持皮肤正常结构及生理功能的重要因素^[7]。正常条件下，成纤维细胞处于静止状态，当皮肤组织受到外界刺激后，成纤维细胞被激活，进入增殖和代谢旺盛期，合成胶原蛋白、纤连蛋白等多种细胞外基质，这对真皮纤维化疾病具有重要意义^[8-10]。由此可见，成纤维细胞作为硬皮病组织纤维化形成过程中的关键效应细胞，其功能异常是疾病发生发展的重要原因，抑制成纤维细胞增殖或诱导细胞凋亡可能成为改善硬皮病组织纤维化的关键。

近来研究发现，间充质干细胞可通过分泌抗纤维化的生物活性因子调节成纤维细胞的增殖、抑制胶原沉积，从而发挥抗纤维化作用^[11]。武艳^[12]发现间充质干细胞对瘢痕疙瘩等病理状态下异常增殖的成纤维细胞具有显著抑制作用，且能够抑制成纤维细胞转化生长因子β的分泌、胶原的合成，而对正常成纤维细胞的影响较小。脂肪间充质干细胞不仅具有间充质干细胞的生物学功能，且由于其易于获得、提取和扩增而受到广泛关注。动物研究证实，脂肪间充质干细胞能够减轻硬皮病小鼠机体炎症反应和皮损组织纤维化^[4]，且对心、肺、肝、肾等多种器官的纤维化也具有改善作用^[13-14]。然而，脂肪间充质干细胞对硬皮病成纤维细胞增殖、凋亡的影响尚未见报道。该研究从硬皮病模型小鼠中分离得到皮损组织成纤维细胞，其增殖活力显著高于正常成纤维细胞；经脂肪间充质干细胞处理后，硬皮病成纤维细胞增殖显著降低，且细胞凋亡显著增加。成纤维细胞是合成胶原蛋白的主要细胞^[15-16]，检测羟脯氨酸含量即可反映胶原蛋白含量。该研究发现，脂肪间充质干细胞能够减少硬皮病成纤维细胞中胶原含量。结果提示，脂肪间充质干细胞可通过抑制成纤维细胞增殖、促进细胞凋亡，减少胶原的合成分泌，阻止胶原沉积。

Wnt信号通路是参与调控机体生长、发育、衰老及死亡过程的重要信号通路，与成体组织细胞的增殖、分化及凋亡密切相关^[17-21]。β-catenin是经典Wnt信号通路的关键信号转导分子。Wei等^[22]研究发现，Wnt/β-catenin信号通路与组织纤维化进程密切相关，在硬皮病发生进展中发挥重要作用。研究表明，Wnt/β-catenin信号活化可通过激活VEGF/VEGFR2信号通路，介导硬皮病患者皮肤组织血管病变，从而促进硬皮病病情发展^[23]，其异常激活可通过促进成纤维细胞增殖，并诱导真皮中上皮间充质转化过程，促进皮肤纤维化^[24-27]。该研究发现，经Wnt/β-catenin信号通路激活剂SB-216763处理后，硬皮病成纤维细胞增殖明显增加，且细胞凋亡率明显降低，胶原蛋白含量增加，与信号通路抑制剂HY-15597处理结果相反。结果提示，Wnt/β-catenin信号通路的异常激活与硬皮病成纤维细胞增殖、凋亡及胶原沉积有关。间充质干细胞通过Wnt/β-catenin通路抑制组织纤维化的研究被广泛关注^[28]。现有研究证实，脂肪间充质干细胞可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路，改善糖尿病肾病模型小鼠的肾组织纤维化以及肾小球系膜细胞增殖^[29-30]。因此推测，脂肪间充质干细胞对硬皮病成纤维细胞的增殖抑制作用可能与其对Wnt/β-catenin信号通路的调控有关。该研究结果显示，经脂肪间充质干细胞处理后，Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达水平均显著降低，与抑制剂HY-15597作用效果一致。为验证脂肪间充质干细胞对Wnt/β-catenin信号通路的抑制作用，实验设立了Wnt激活剂SB-216763组，结果显示，脂肪间充质干细胞能够抑制SB-216763所引起的Wnt/β-catenin信号通路的激活，同时抑制信号通路激活所引起的细胞过度增殖及胶原沉积。这些结果证实，脂肪间充质干细胞能够通过调控Wnt/β-catenin信号通路抑制硬皮病成纤维细胞增殖和胶原沉积。

综上所述，脂肪间充质干细胞能够抑制硬皮病小鼠皮损组织成纤维细胞增殖和胶原沉积，其机制可能是通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活，从而改善硬皮病小鼠皮损情况。由于硬皮病纤维化过程极其复杂，多种信号级联反应参与其中，且Wnt/β-catenin信号通路与其他信号通路存在交叉对话，在后续研究中还需要探究脂肪间充质干细胞对硬皮病成纤维细胞的干预功能，深入探讨其抗纤维化的作用。

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