非变性Ⅱ型胶原生产制备的纯化工艺

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0641

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
胶原(collagen)：是一种不透明、白色、无支链的纤维蛋白质，是动物体内分布最广，含量最多的蛋白质。胶原的科学定义为：“细胞外基质(ECM)的结构蛋白质，分子中至少应该有一个结构域具有α链组成的三股螺旋构象”。通俗的概念：不溶于冷水、热水，有三螺旋结构，保留生物活性。胶原与胶原蛋白不是一种物质，胶原蛋白又称水解胶原蛋白，是胶原经过水解后失去了三螺旋结构的产物。
非变性Ⅱ型胶原：是胶原的一种类型，所谓非变性是指其三螺旋结构没有被破坏。Ⅱ型胶原软骨中较为多见，参与软骨的新陈代谢，与某些疾病的发生发展有关，如类风湿关节炎及骨关节炎。

背景：非变性胶原实验室层面的纯化已有许多文献和研究，但中试和生产量级的提取和纯化的报道和文献较少。这种实用技术毕竟要走出实验室才有意义，到中试和生产阶段更多面临的是成本、得率、设备、操作便利度的衡量。

目的：探讨解决非变性Ⅱ型胶原中试及生产中脱盐、脱酸纯化的工艺方法及条件。
方法：对统一制备的非变性Ⅱ型胶原分别按透析袋法、水洗法、甩滤法、中空纤维膜法4种方法进行纯化，通过得率、胶原含量、纯度3项指标对比4种方法在胶原纯化工艺的优缺点。
结果与结论：①得率：透析袋法最高；中空纤维膜法其次；第三为甩滤法；水洗法最低；②胶原含量：透析袋法最高，中空纤维膜法其次，第三为水洗法，甩滤法最低；③胶原纯度鉴定：4种方法没有显著性区别；④压力对通量的影响：存在正相关，但差别并不大；⑤结果表明，通过得率、胶原含量、胶原纯度、压力差与膜通量数值关系等指标的比较，认为中空纤维膜法在非变性Ⅱ型胶原提纯中具有比较优势。该研究的技术路线已在2013年5月1日取得国家发明专利，专利号ZL 2011 10065733.X，作者是该专利第一发明人。

ORCID: 0000-0001-7505-3922(李洁)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: Ⅱ型胶原, 纯化, 中空纤维膜, 组织构建

Abstract:

BACKGROUND: Increasing studies have been concentrated on the purification of non-denatured collagen at the laboratory level, but there are fewer reports on the extraction and purification of pilot scale and production scale. After all, this technology has to be out of the laboratory to make sense. At the trial and production stages, more is faced with the measurement of cost, yield, and ease of operation.

OBJECTIVE: To explore the methods and conditions for the desalination and deacidification purification of non-denatured type II collagen in the pilot test and production.

METHODS: The commonly used desalination and deacidification methods for non-denatured type II collagen extracted included dialysis bag method, water washing method, rejection filtration method, and hollow fiber membrane method. The denatured type II collagen was purified according to these four methods. Disadvantages and advantages of the dialysis bag method, water washing method, rejection filtration method, and hollow fiber membrane method in the collagen purification process were compared using three indexes: yield, collagen content, and purity.

RESULTS AND CONCLUSION: For the yield, the ranking order was as follows: dialysis bag method > hollow fiber membrane method > rejection filtration method > water washing method; for the collagen content, dialysis bag method > hollow fiber membrane method > water washing method > rejection filtration method; for the purity of collagen, there was no significant difference among the four methods. Moreover, pressure was positively but insignificantly correlated with the membrane flux. By comparing the yield, collagen content, collagen purity, pressure difference, and membrane flux numerical value, it is considered that the hollow fiber membrane method has a comparative advantage in the purification of non-denatured type II collagen. This concludes that the hollow fiber membrane method is more suitable for industrial production, which has been patented on May 1, 2013 with national patent No. ZL 2011 10065733.X, and the authors are the first inventors of the patent.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Collagen Type II, Technology, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

李洁，王玉梅. 非变性Ⅱ型胶原生产制备的纯化工艺[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(34): 5496-5500.

Li Jie, Wang Yumei. Purification process of non-denatured type II collagen[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(34): 5496-5500.

图/表（结果） 4

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引言

胶原与胶原蛋白是不同的两种物质。实验室层面胶原的分离与纯化已有许多文献和研究，但胶原中试和生产量级提取和纯化的报道较少。具有三螺旋结构的称之为胶原，因保持了三螺旋结构，所以称之为非变性胶原，分子质量在10⁴ u以上；胶原在水解酶的作用下水解为小分子后，称其为胶原蛋白，或水解胶原蛋白，分子质量在1 000-3 000 u^[1-4]。

文章涉及的是从鸡软骨中提取的Ⅱ型胶原。鸡软骨中Ⅱ型胶原占软骨干质量的50%-60%，另有30%-40%是蛋白多糖^[5-8]。Ⅱ型胶原有3条相同的α链，以三螺旋结构的方式构成[α1(Ⅱ)]3。软骨组织的胶原纤维呈现不溶解状态，形成一定形状的刚性骨架。透明质酸如同锁链将游离的蛋白多糖(PG)单体固定于胶原纤维骨架之上。由于蛋白多糖浓度很高，在胶原骨架之间形成了带有负电荷，水含性极强的黏稠胶体，使软骨坚硬而富于弹性，具有巨大的缓冲容量^[2^，^9-12]。因为以上生理特性，Ⅱ型胶原的制备及利用越来越受到药品、生物材料、食品、保健品领域的关注。但是生产过程中胶原蛋白的纯化方法决定着纯度及得率，两者之于工业生产具有重要的意义，得率的多少决定着项目的可行性，也决定着成本的高低^[13-14]。

目前针对非变性Ⅱ型胶原制备中纯化工艺文献及方法多是实验室层面的，样品量普遍较小，样品量多以克重计算，比如透析袋法，但此方法很难应用到实际生产中^[15-21]。非变性Ⅱ型胶原制备液中成分包含了大分子杂质和小分子杂质以及色素，主要有杂蛋白，无机盐，酸根等，因此固液分离方法对纯化有一定的影响。传统的工业用固液分离方法有离心机离心、板框过滤、活性炭过滤、硅藻土吸附等，进行固相和液相分离^[1^，^16-18]。这些方法操作强度大，操作繁琐，过滤精度较差，产品品质较差，更重要的是对本物料不太合适，得率与适用性差。

研究旨在解决批量生产前提下Ⅱ型胶原的纯化方法，投入原料量以kg计算^[19-20]，实验中投入的提取后原料量为80 kg。研究中试及生产条件下，Ⅱ型胶原制备中的纯化工艺，通过4种方法的比较，初步探索各种方法的优劣。

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材料方法

1.1 设计对比观察。

1.2 时间及地点实验于2016年9至11月在北京通州开发区北京康佳源生物技术有限公司厂区完成。

1.3 材料鸡软骨为华都肉鸡集团的冷冻鸡胸软骨，Ⅱ型胶原标准品为sigma公司提供，Uv110型紫外-可见(Unico上海仪皿有限公司)，骨泥磨(河北廊坊阁润机电公司)，三足离心机(辽宁辽阳某机电公司)，高速管式离心机(辽宁辽阳某机电公司)，100目滤网袋由离心机厂家提供；高速台式离心机(湖南长沙湘鑫离心机公司)，海德能中空纤维膜(北京海德能膜技术公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 得率计算^[2]

得率=

单位质量盐析后胶原沉淀

单位质量浓缩液

× 100%

1.4.2 胶原含量将粗处理好的原料样品置于水解管中水解，加入6 mol/L盐酸升温，用透气棉封管，在110 ℃环境下水解24 h。蒸干盐酸后，稀释，定容得到水解液。采用WoessnerⅠ法测定，得出水解液中羟脯氨酸质量分数。

计算公式：胶原含量(%)=羟脯氨酸含量/14.4× 100%^[3-4]

1.4.3 纯度测定(SDS-PAGE电泳)^[4-6] 称取Ⅱ型胶原标准品和酶法提取的鸡胸软骨胶原蛋白各25 mg，用 0.05 mol/L的乙酸10 mL溶解，12 000 r/min的速度离心 5 min后，取上清80 μL，加入20 μL上样缓冲液，100 ℃煮沸5 min，12 000 r/min离心1 min，制备成上样样品。用1 g/L的牛血清白蛋白作为阳性对照。制备8%的分离胶，5%的浓缩胶，胶厚为0.75 mm。

电泳条件：以10 mA恒流的电流进行电泳，当溴酚蓝指示剂前沿线达到分离胶底部1 mm时候，停止电泳。进行固定、显色和脱色。电泳胶在固定液中固定30 min，在染色液中染色过夜，然后浸泡在脱色液中脱色，用数码相机照相^[4^，^22-24]。

1.4.4 Ⅱ型胶原粗制品制备^[2^，^5-6] 从鸡胸软骨表面剔除残肉，筋膜，其他非软骨成分。用去离子水洗涤2次。脱脂，骨泥磨逐级粉碎。样品液悬在1 mL/L NaCl 0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液中变速搅拌24 h，以5 000×g离心力，离心10 min，弃去上清液。将沉淀混悬于0.5 mol/L HAc中加入2%的胃蛋白酶，4 ℃下酶解36 h。然后以10 000×g离心力离心20 min，取上清液，用0.9 mol/L NaCl盐析。得到盐析后的Ⅱ型胶原沉淀，将盐析液置于4 ℃存放，4 h后去掉上清收集沉淀，此沉淀即为“盐析后胶原沉淀”。

1.4.5 Ⅱ型胶原脱盐纯化将盐析后得到的Ⅱ型胶原沉淀按4种试验方法不同分为4份，质量不一。透析袋法取

2 kg，水洗法、甩滤法、中空纤维膜法分别取样20 kg进行分离纯化。盐析后胶原沉淀分别用于透析袋法、水洗法、甩滤法、中空纤维膜法的实验^[1^，⁵^，^16-18^，^25-26]。留取纯化后所得浓缩液或沉淀，作为鉴定监测的样品。

(1)透析袋法：将盐析的Ⅱ型胶原沉淀，置于透析袋中，选择截留相对分子质量10 000的透析袋，置于磷酸盐缓冲液中透析72 h，每12 h换液1次透析液。得纯化后的沉淀^[7]。

(2)水洗法：将盐析的Ⅱ型胶原沉淀，用10 000×g离心力离心15 min，得沉淀，将沉淀置于10倍体积去离子水中，变速搅拌2 h，以10 000×g离心力离心15 min，重复3次，得沉淀。

(3)甩滤法：将盐析所得Ⅱ型胶原沉淀，置于三足离心机内，利用离心机适当的外力，配以适当目数的滤网袋。将非变性Ⅱ型胶原外的其他物质，如可溶性非纤维性蛋白质、水、NaCl、酸根离子等甩出，得到沉淀。

(4)中空纤维膜法：根据Ⅱ型胶原分子量特点，选用截留相对分子质量为10 000的聚丙烯中空纤维膜(该实验选用海德能中空纤维膜)，将盐析后的Ⅱ型胶原沉淀，以5倍体积的去离子水稀释，将溶液进行超滤纯化。调整中空纤维膜各阀门(按该设备操作说明书操作)，等超滤装置稳定后，调整压力、流速等参数。设定好取样时间，取样以便证实不同时间的透析液，按下面公式计算出膜通量。逐步收集浓缩液。

在分离过程中，压力差△P是分离性能的重要参数，在固定的温度前提下(实验环境稳定为22 ℃)，滤膜两侧压力差(△P)对膜通量(J)的影响。研究输入了4个压力，分别是：0.1，0.15，0.20，0.25 MPa。每输入一种压力维持时间在8 h，此时滤过液排出量已经很少，停止超滤。收集浓缩液的时间为每1 h收集一次透析液，称其体积，按下面的公式计算膜通量。每个压力条件下，以时间为横轴，膜通量为纵轴建立坐标，绘制操作压力对膜通量的影响图。

膜通量公式：J(%)=V/T×A×100

J为膜通量[(L/(m²·h))]；V为取样体积(L)；T为取样时间为小时(h)；A为有效面积。

1.5 主要观察指标 ①4种方法胶原的得率和含量；②4种方法胶原纯度鉴定；③中空纤维膜法操作压力对膜通量的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

近些年来市场中胶原及胶原蛋白制品门类众多，但非变性胶原却并不多见；与此状况相同的是实验室量级的非变性胶原的文献、专利各种研究很多，但中试和生产量级的文献鲜有见到。作者作为兼具研究单位和企业人员的阅历，深知实验室技术转化为生产工艺的重点和难点。该研究以生产产品为出发点和落脚点，在不同的工艺阶段选用不同规格的离心机进行提取和纯化，放弃了业界常用的板框过滤，活性炭过滤，引入了中空纤维膜超滤，形成了以骨泥磨、离心机和中空纤维膜为主要设备的制造设备体系。通过透析袋法取，水洗法、甩滤法、中空纤维膜法分别对提取物Ⅱ型胶原进行脱酸、脱盐；设定得率、含量、纯度3个指标对4种方法的纯化工艺的进行比较；又对使用中空纤维膜的压力差与膜通量数值关系输入4个压力变量，得出以中空纤维膜纯化Ⅱ型胶原的压力参数及数值图。该研究不仅对Ⅱ型胶原的中试和生产有指导和参考意义，对具有黏性、有温度要求的类似性状的其他生物材料也有直接的借鉴和参考意义。非变性Ⅱ型胶原的量产意义是重要的，因为它的组织来源相对容易，前期处理相比于Ⅰ型胶原、Ⅲ胶原相对简单，提取的有效成分含量也相对高，所以非变性Ⅱ型胶原的生产工艺的研究具有现实意义。

该研究的局限性是由于设备规模的问题实验每个周期只能操作几十公斤的物料，如能每个周期操作100 kg的物料，对生产的指导意义更具体和逼真；另外该研究还没有包括最终产品的制备与形成，有待另外撰文发表和讨论下一个工艺。以下具体讨论4种方法的优缺点。

3.1 透析袋法是实验室中经常用到的方法，也是文献中最为常见的方法，其操作简便，成本低廉，分离纯度高，质量较为可靠；缺点是每次透析量太少，且操作繁琐，不适合工业化生产，适合于实验室操作。该研究再次证实了这一点。

3.2 水洗法操作相对简单，但该研究过程中使用水洗法时，以10倍体积的去离子水水洗，产生两个问题：一是大量增加了液体量，为下一步的离心收集沉淀带来巨大的工作量；二是10倍体积的去离子水水洗胶原的pH值为5左右，并不能达到制备要求。且通过实验结果可以看出水洗法得率在4种方法中最低，仅为67.3%。分析原因水洗法很难一次性使溶液达到中性，在弱酸性环境里，被盐析的II型胶原，又变成溶于弱酸溶液的可溶性胶原，为下一步的分离与纯化造成困难，所以较难应用于工业生产。同时使提纯的胶原丢失，造成浪费。不适合工业生产。

3.3 甩滤法是一种快速和实用的方法。但在该研究过程中，遇到的最大问题是滤袋堵塞的问题，要不断清理被堵塞的滤袋，致使试验难以顺利进行。分析原因三足离心机是通过滤袋收集有效成分，胶原蛋白的黏稠性使滤袋空隙容易被堵塞，滤袋膜的选择非常困难，很难找到各方面都合适的膜。膜孔的阻塞问题，在初期尚可使用，但一段时间后，膜孔阻塞成为无法逾越的障碍，所以到目前为止作者还没有找到更好的解决方法。

3.4 中空纤维膜法对比以上3种方法，实验过程相对流畅，得率、操作的便利性等中空纤维膜法比较理想。分析原因中空纤维膜法是一种超滤方法。首先，中空纤维膜法优点是无相变，只是将液体浓缩；其次对温度没有特别要求，可以在常温和低压下进行分离，因而耗能较低；第三是物质在浓缩和液体分离的过程中不会发生质的变化，所以适用分离热敏性物质；第四它是以压力为驱动的膜分离过程，压力使蛋白类胶体处于流动状态，胶体颗粒不易阻塞膜孔，因而适合于性状有黏性的Ⅱ型胶原的分离与纯化。以上4点是胶原类和一些生物组织所具有的共同特性，即热敏性和胶黏性。中空纤维膜法可以比较好的解决这一问题^[12]。

3.5 四种方法得率、胶原含量、纯度、压力实验结果比较通过结果比较，发现透析袋法得率最高，中空纤维膜法次之，水洗法、甩滤法得滤较低，且差别不大；胶原含量4种方法没有显著性差异；SDS-PAGE电泳纯度鉴定，4种方法没有显著性差异；操作压力与膜通量成正相关，2 h后不同压力作用下的膜通量均趋于平缓，持续时间最长可到 8 h还有透析液流出。

综上所述，研究的结论是透析袋法分离纯度高，但是每次透析量太少，且操作繁琐不适合工业化生产，适合于实验室操作；水洗法容易造成提纯的胶原溶解到溶解到弱酸溶液中，造成胶原丢失，不适合工业生产；甩滤法难以解决粘性物料阻塞过滤膜的问题，亦难以推广使用；中空纤维膜超滤法解决了物料热敏性和胶黏性问题，且可以工业化生产，所以是非变型胶原生产制备中最为可取的纯化工艺。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程