高纯度大鼠下颌骨来源间充质干细胞的分离、培养及生物学特性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2151

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (1): 67-72.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2151

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

高纯度大鼠下颌骨来源间充质干细胞的分离、培养及生物学特性

程兵坤1，2，3，梁建飞3，秦东泽3，程子绪1，赵云转1

1河北医科大学第二医院口腔颌面外科，河北省石家庄市 050000；2邯郸市中心医院口腔科，河北省邯郸市 056000；3解放军第四军医大学口腔医院颌面外科，军事口腔医学国家重点实验室，陕西省西安市 710032

收稿日期:2020-02-18 修回日期:2020-02-26 接受日期:2020-04-03 出版日期:2021-01-08 发布日期:2020-11-19
通讯作者: 赵云转，博士，副教授，副主任医师，硕士生导师，河北医科大学第二医院口腔颌面外科，河北省石家庄市 050000
作者简介:程兵坤，男，1988年生，河北省肥乡县人，汉族，2017年河北医科大学毕业，硕士，医师，主要从事骨发育和种植体表面处理相关研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81371186)；河北省自然科学基金项目(H2020109157)

Isolation, culture and biological characteristics of high-purity orofacial-bone-derived mesenchymal stem cells of the rats

Cheng Bingkun1, 2, 3, Liang Jianfei3, Qin Dongze3, Cheng Zixu1, Zhao Yunzhuan1

1Department of Oral and Maxillofacial Surgery, The Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, Hebei Province, China; 2Department of Stomatology, HanDan Central Hospital, Handan 056000, Hebei Province, China; 3State Key Laboratory of Military Stomatology, Department of Maxillofacial Surgery, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China

Received:2020-02-18 Revised:2020-02-26 Accepted:2020-04-03 Online:2021-01-08 Published:2020-11-19
Contact: Zhao Yunzhuan, MD, Associate professor, Associate chief physician, Master’s supervisor, Department of Oral and Maxillofacial Surgery, The Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, Hebei Province, China
About author:Cheng Bingkun, Master, Physician, Department of Oral and Maxillofacial Surgery, The Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, Hebei Province, China; Department of Stomatology, HanDan Central Hospital, Handan 056000, Hebei Province, China; State Key Laboratory of Military Stomatology, Department of Maxillofacial Surgery, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81371186; the Natural Science Foundation of Hebei Province, No. H2020109157

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
间充质干细胞：是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，既可以不断地自我更新，又可在特定条件下转变成为一种或多种构成人体组织或器官的细胞。间充质干细胞不仅存在于骨髓中，也存在于骨骼肌、骨外膜和骨小梁中，因此采用胶原酶消化骨片(密质骨+松质骨)可分离间充质干细胞。
下颌骨：位于面下部，呈弓形，其水平部分为下颌体，垂直部分为下颌支，不规则，围成口腔的前壁和侧壁，是面部唯一能活动的骨骼。下颌骨表层为骨密质，内部为骨松质，且其骨质较致密，血供较差，因此下颌骨单纯采用全骨髓贴壁培养法很难提取足够的间充质干细胞。

背景：以募集颌骨来源间充质干细胞来修复颌骨骨缺损这种新观点逐渐被广泛认可，但目前对颌骨来源间充质干细胞的研究相对较少，主要由于颌骨来源间充质干细胞分离困难。
目的：建立大鼠下颌骨来源间充质干细胞的体外分离、培养方法，并观察研究其相关生物学特性。
方法：解剖分离大鼠下颌骨，剥离表面附着肌肉后剪碎，用Ⅱ型胶原酶消化疏松密质骨，利用间充质干细胞的迁徙和贴壁生长能力分离下颌骨间充质干细胞。采用倒置显微镜观察细胞形态；流式细胞仪检测细胞表面抗原；MTT法检测细胞增殖情况并绘制细胞生长曲线；克隆形成实验计算克隆形成率；成骨、成脂诱导实验研究细胞的多向分化潜能。
结果与结论：胶原酶消化骨片培养法分离的细胞阳性表达CD29、CD44、Sca-1，阴性表达CD31、CD34和CD45；细胞增殖能力检测提示下颌骨间充质干细胞生长经历了潜伏期、对数生长期和平台期，具有较强的增殖能力；细胞克隆形成率达20%且处于DNA合成期的细胞占52.5%；成骨、成脂诱导后行茜素红和油红O染色均呈阳性，表明该细胞具有多向分化潜能。结果表明胶原酶消化骨片培养法可从大鼠下颌骨分离足量、高纯度的下颌骨间充质干细胞，且该细胞具有较强的增殖和成骨分化能力，为以种植体骨缺损修复为代表的颌骨骨组织工程提供充足的种子细胞来源。
https://orcid.org/0000-0002-9862-5986(程兵坤)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 间充质干细胞, 下颌骨, Ⅱ型胶原酶, 增殖, 分化, 骨, 大鼠

Abstract: BACKGROUND: It is widely accepted to recruit mesenchymal stem cells from the jaws to repair the defects of the jaws. However, there are relatively few researches on orofacial-bone-derived mesenchymal stem cells, mainly due to the difficulty in separating mesenchymal stem cells from the jaws.
OBJECTIVE: To establish the methods of in vitro isolation and culture of rat orofacial-bone-derived mesenchymal stem cells and observe and study its related biological characteristics.
METHODS: The mandibles of rats were dissected. The attached muscles were stripped and cut into pieces. Cortical bone was loosened by digesting with collagenase II. The migration and adherent growth ability of mesenchymal stem cells was used to isolate orofacial-bone-derived mesenchymal stem cells. Cell morphology was observed by inverted microscope. Surface markers of the cell were detected by flow cytometry. Cell proliferation was detected by MTT assay and cell growth curve was drawn. Fibroblast colony forming rate was calculated by colony formation. Osteogenic and lipogenic induction experiments were conducted to study the multi-directional differentiation potential of cells.
RESULTS AND CONCLUSION: Cells isolated by collagenase digestion and bone slice culture were positive for CD29, CD44 and Sca-1, and negative for CD31, CD34 and CD45. Cell proliferation test showed that the growth curves of orofacial-bone-derived mesenchymal stem cells exhibited incubation period, logarithmic phase and platform period. In addition, the cells had a strong ability of proliferation, and the cell clone formation rate was 20% and the cells in DNA synthesis stage accounted for 52.5%. Alizarin red and oil red O staining showed positive reaction after osteogenic and lipogenic induction, indicating that the cells have the potential of multi-directional differentiation. It is concluded that the method of bone fragment culture after digestion with collagenase II could separate orofacial-bone-derived mesenchymal stem cells sufficiently and purely. Besides, the orofacial-bone-derived mesenchymal stem cells show strong proliferative and osteogenic differentiation capacities. Thus, it provides abundant source of seed cells for bone tissue engineering of maxillofacial represented by bone defects repairing of implants.

Key words: stem cells, mesenchymal stem cells, mandible, type II collagenase, proliferation, differentiation, bone, rat

中图分类号:

程兵坤, 梁建飞, 秦东泽, 程子绪, 赵云转. 高纯度大鼠下颌骨来源间充质干细胞的分离、培养及生物学特性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(1): 67-72.

Cheng Bingkun, Liang Jianfei, Qin Dongze, Cheng Zixu, Zhao Yunzhuan. Isolation, culture and biological characteristics of high-purity orofacial-bone-derived mesenchymal stem cells of the rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(1): 67-72.

图/表（结果） 7

2.1 下颌骨间充质干细胞的形态扫描电镜检测Ⅱ型胶原酶消化前(图1A)及消化后骨的表面微观结构变化，可见消化后骨表面有大量的孔洞，直径70-80 μm，见图1B，便于细胞从骨片中爬出。
骨片中的间充质干细胞在适合的培养体系内培养72 h后，可见少量细胞从骨片中爬出，见图1C，呈克隆和鱼群样生长。随着培养时间的延长，更多的细胞迁出，见图1D。在骨片的周围，可以发现少数的成纤维细胞样的克隆，见图1E。通常情况下，5 d左右培养瓶底能够铺满成纤维样细胞，见图1F，7 d时细胞已达到70%-80%汇合，并以1∶2比例传代。传代培养至第4代时贴壁细胞同质性基本一致，具有典型成纤维样细胞形态，并呈漩涡状生长。

2.2 下颌骨间充质干细胞的表型鉴定流式细胞术结果提示，细胞高表达干细胞表面标志Sca-1，阳性率达95.7%，高表达黏附分子CD29和CD44且阳性率分别为99.9%和100%，不表达造血细胞表面标志CD34和CD45，同时也不表达MHC Ⅱ类分子IA/IE及内皮标志之一CD31，见图2。

2.3 下颌骨间充质干细胞的生长曲线 MTT法检测细胞增殖1-7 d的吸光度值，见表1，按照所测吸光度值绘制细胞生长曲线，见图3，可见细胞增殖过程经历了潜伏期、对数生长期和平台期，且细胞群体三四天可增殖1倍。

2.4 细胞克隆形成情况下颌骨间充质干细胞培养2周后，单个细胞具有自我复制、增殖的特性，甲苯胺蓝染色可显示集落，见图4，克隆形成率为20%。

2.5 细胞周期检测结果流式细胞术细胞周期分析结果显示，47.5%细胞处于G0/G1期，43.8%细胞处于G2/M期，8.7%细胞处于S期，见图5，表明处于DNA合成期的细胞量达52.5%，故该细胞具有较强的分裂增殖潜能。

2.6 下颌骨间充质干细胞的成骨及成脂诱导分化能力
2.6.1 成骨诱导分化能力成骨诱导第4天细胞开始聚合；第7天可见聚合的中央部透光性差，周围细胞形态稍有变化，碱性磷酸酶染色可见阳性细胞被染成蓝色；第14天培养皿底壁有少量白色小结节，第21天可见培养皿底部有大量的白色小结节，茜素红染色阳性，见图6A。
2.6.2 成脂诱导分化能力成脂诱导第3天细胞核周围出现少许小圆形脂滴。随着诱导时间的延长，脂滴数目增多，并将细胞核推向一侧。成脂诱导第14天，油红O染色阳性，见图6B。

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引言

间充质干细胞是具有多向分化潜能的干细胞，其应用于以种植体骨缺损修复为代表的颌骨骨组织工程进而促进骨形成是近年来研究的热点，目前的基础研究及临床应用中以股骨和髂骨来源骨髓间充质干细胞为主[1-4]。近年来一种新的观点逐渐被多数专家认可，即不同部位受到损伤等刺激时会募集同种来源骨髓间充质干细胞到损伤部位，进而修复缺损；而股骨来源间充质干细胞与颌骨来源间充质干细胞的胚层起源不同，其中颌骨来源间充质干细胞来源于外胚层，股骨来源间充质干细胞来源于中胚层[5]，因此颌骨的骨缺损修复以募集颌骨来源间充质干细胞为主。另外，两者在受到刺激时的增殖、迁移和分化能力也有差异[6-8]。因此研究颌骨来源间充质干细胞可以为颌骨骨组织工程的发展及应用于临床提供实验依据。目前对颌骨来源间充质干细胞的研究有限，对其在骨缺损修复中的作用尚不十分清楚，可能原因是下颌骨薄且松质骨含量少，而且鼠的松质骨含量更少，因此采用普通的冲洗骨髓法分离颌骨来源间充质干细胞很难实现[9]。近年来研究发现密质骨组织是一种新的可靠的间充质干细胞来源，并由此衍生出了相对简单的间充质干细胞分离方法，即胶原酶消化骨片培养法，且该方法分离的间充质干细胞具有较高纯度[10-12]。该研究旨在通过密质骨消化培养法分离下颌骨间充质干细胞，从细胞形态、细胞增殖能力、克隆形成能力及多向分化能力对分离的细胞进行研究，旨在建立大鼠颌骨间充质干细胞的分离方法以及为颌骨骨组织工程提供充足的种子细胞来源。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计动物实验和体外细胞实验。
1.2 时间及地点实验于2015年9月至2016年11月在解放军第四军医大学口腔医院口腔颌面外科实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物雄性健康SD大鼠10只，4周龄，体质量
70 g左右，由解放军第四军医大学实验动物中心提供。
1.3.2 实验试剂和仪器 Ⅱ型胶原酶(美国GIBCO公司，cat. No. 17101015)；二氧化碳恒温孵箱(美国Forma公司)；α-MEM培养基、胎牛血清(美国Hyclone公司)；2.5 g /L胰蛋白酶、谷氨酰胺(美国GIBCO公司)；场发射扫描电子显微镜(日本日立公司，S-4800)；流式细胞仪(美国Beckmen-Coulter公司)；MTT试剂盒(美国Sigma-Aldrich公司)；β-甘油磷酸钠、地塞米松、维生素C (美国Sigma公司)；茜素红、油红O(上海化学试剂采购供应站)。
1.4 实验方法
1.4.1 下颌骨间充质干细胞的分离、培养和纯化取体质量
70 g左右SD大鼠，颈椎脱臼处死，体积分数为75%乙醇浸泡消毒大鼠5 min，以无菌解剖剪和解剖镊解剖、剥离颌骨表面附着的皮肤及肌肉，同时拔除下颌切牙及磨牙。将分离的骨质剪碎成1-3 mm3的细小骨片，移入25 cm2培养瓶中，加入0.1% Ⅱ型胶原酶3 mL，37 ℃摇床200 r/min消化
90 min，期间注意观察骨片状态，发现骨片轻微相粘，但是轻摇可以打散时，终止消化；吸出胶原酶弃之，再以含体积分数为2%胎牛血清的α-MEM培养基反复冲洗骨片3遍以上，确保消化释放出来的细胞被洗掉。将骨片种入25 cm2塑料培养瓶使骨片均匀分布瓶底，加入间充质干细胞培养体系，内含α-MEM培养基、体积分数为10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素，在37 ℃、体积分数为5%CO2及饱和湿度条件下培养；培养的前3 d避免移动培养瓶，减少对细胞迁出的影响。第3天首次换液，第7天贴壁细胞近80%-90%汇合时，加入0.25%胰酶消化，按照1∶2的比例传代。第1次传代时将骨片与细胞一起回种，以利于骨片中的细胞继续迁出，之后每2 d换液1次；当细胞汇合近80%-90%时，加入0.25%胰酶消化，按照1∶3的比例传代，且第2次传代时，去除骨片。

1.4.2 流式细胞仪检测细胞表面标记分子用0.25%胰蛋白酶消化第3代细胞，以含体积分数为3%胎牛血清的PBS洗涤2次后重悬，调整细胞浓度为1×109 L-1，分装至EP管中，每管100 μL，分别加入Sca-1、CD44、CD29、CD31、CD34、CD45抗体后37 ℃孵育45 min，PBS洗涤2遍后重悬，流式细胞仪检测。
1.4.3 MTT法检测细胞增殖能力取第3代下颌骨间充质干细胞，以2× 103/孔细胞密度接种于96孔板，37 ℃、体积分数为5%CO2孵箱中培养，每天用MTT法在酶标仪上分别测10个孔的吸光度值，取平均值，连续测7 d。以时间为横轴，吸光度值为纵轴绘制生长曲线。
1.4.4 克隆形成实验取第3代下颌骨间充质干细胞按2×103细胞密度接种于10 cm2培养皿中，设置3个重复培养皿，加入含体积分数为10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的α-MEM完全培养基培养14 d，期间每2 d换液1次，新形成的克隆用40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS清洗2次后进行甲苯胺蓝染色20 min，PBS冲洗2遍，倒置显微镜下观察并记录，每个细胞集落含多于50个细胞为1个克隆。克隆形成率(%)=克隆数/接种细胞数×100%。
1.4.5 流式细胞仪检测细胞周期取第3代下颌骨间充质干细胞经胰酶消化后，弃上清，加入已预冷的体积分数为75%冰乙醇重悬细胞，4 ℃放置过夜。流式上机前，800 r/min离心去上清，用预冷的PBS清洗2次，12 000 r/min离心6 min，加入100 μL PBS重悬细胞后加入5%碘化丙啶染液320 μL，充分混匀避光孵育30 min，流式细胞仪测定DNA含量，判定细胞所处的周期。
1.4.6 成骨和成脂诱导培养
成骨细胞诱导分化：取第3代下颌骨间充质干细胞以2×108 L-1的细胞浓度接种于6孔培养板中(1 mL/孔)，培养至贴壁细胞达70%汇合后弃原培养液，加入成骨诱导液(含
10 mmol/L β-甘油磷酸钠液、0.3 mmol/L抗坏血酸、1×
10-5 mmol/L地塞米松、体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养液)进行诱导培养，每2 d换1次液，诱导7 d后进行碱性磷酸酶染色，诱导21 d后进行茜素红染色，倒置显微镜下观察、拍照。
成脂肪细胞诱导分化：取第3代下颌骨间充质干细胞以2×108 L-1的细胞浓度接种于6 孔培养板中(1 mL/孔)，培养至贴壁细胞达70%汇合后弃原培养液，加入成脂诱导液(含
1 μmol/L地塞米松、0.5 mmol/L IBMX、10 mg/L胰岛素、
100 mmol/L吲哚美辛、体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养液)进行成脂诱导，后每2 d换液1次。诱导14 d后进行油红O染色，倒置显微镜下观察、拍照。
1.5 主要观察指标 ①MTT法检测下颌骨间充质干细胞增殖情况；②克隆形成实验检测下颌骨间充质干细胞单个细胞的克隆能力；③流式细胞仪检测细胞周期观察细胞的分裂增殖潜能；④成骨和成脂诱导分化实验观察细胞多向分化潜能。

讨论

骨髓间充质干细胞因其具有多项分化潜能，在特定条件下可分化为骨、肌肉、脂肪和神经等多种组织，成为组织工程的种子细胞[1-3]。骨髓间充质干细胞通常来源于股骨和髂骨的骨髓，但近年来有研究表明相比于股骨和髂骨来源骨髓间充质干细胞，颌骨来源间充质干细胞具有更强的增殖和成骨分化能力[7，13]，同时其与颌面部骨的胚胎来源相同，均由神经外胚层细胞分化而成，且在颌面部受刺激时更易被招
募[4]，因此颌骨来源间充质干细胞将是颌骨骨组织工程的新的种子细胞。但由于大鼠颌骨来源间充质干细胞的分离一直是难点[9]，故对其研究较少。近年来，GUO等[14]以酶消化骨片培养法培养小鼠股骨间充质干细胞，发现骨密质中同样存在广泛的间充质干细胞，且分离培养后的细胞经鉴定为间充质干细胞。ZHU等[12]和SHORT等[11]也证实密质骨是一种新的可靠的间充质干细胞来源，并由此衍生出了一种相对简单的胶原酶消化骨片培养法分离密质骨间充质干细胞。该实验拟采用该方法分离下颌骨间充质干细胞，并对该细胞的增殖及多项分化能力进行检测。
该研究中利用胶原酶消化骨片培养法分离的细胞高表达干细胞表面标志Sca-1及CD44，不表达造血细胞系细胞表面标志CD34、CD45；同时该方法分离的细胞具有成骨、成脂诱导分化潜能，符合国际细胞治疗学会间充质及组织干细胞委员会提出的鉴定人来源间充质干细胞的最低标准[15-18]，因此可证实该方法分离的细胞是间充质干细胞。光镜下可见分离的下颌骨间充质干细胞形态均一呈纺锤体状，同时该方法分离的细胞具有较强的增殖能力。
胶原酶消化骨片培养法分离的下颌骨间充质干细胞具有较高纯度，符合组织工程对种子细胞的纯度要求。首先拔除下颌切牙和磨牙避免牙髓干细胞的污染；然后将下颌角处的骨剪成1-3 mm3的骨片，使骨髓腔中的骨髓外流至胶原酶中，进行Ⅱ型胶原酶消化，可从骨实质髓腔面上去除附着的造血细胞、内皮细胞、破骨细胞等，消化完成后吸弃胶原酶，同时用培养液反复冲洗骨片，以彻底去除骨片上的造血细胞等杂细胞，最后将骨片接种到培养皿上培养使细胞从骨片中爬出，因此该方法分离的间充质干细胞理论上有较高的纯度[11-12]。CD44是间充质干细胞的一个特异性表面标志[19-20]，该研究发现分离的细胞CD44阳性率达100%，也提示该方法分离的间充质干细胞有较高的纯度。
细胞增殖能力是干细胞的特征之一，也是组织工程中种子细胞的重要基础[21-24]。该研究采用MTT、克隆形成实验及细胞周期来评估下颌骨间充质干细胞的增殖情况。MTT实验检测该方法分离的下颌骨间充质干细胞在体外条件下与其他部位来源间充质干细胞经历相似的细胞潜伏期、对数生长期和平台期[18]，同时群体倍增时间平均为三四天，时间较短，说明下颌骨来源间充质干细胞在体外生长活跃，有较强的增殖能力。细胞周期检测证实该细胞中处于DNA合成期的比例较大及细胞克隆形成实验表明克隆形成率达20%，均提示该细胞生长旺盛，有较强的增殖能力，这可能是由于颌骨所含造血性骨髓较少，相对的非造血性骨髓含量较多，因而骨中的基质细胞亦较多，故具有更高的分裂活性[25]。
多向分化潜能是间充质干细胞应用于组织工程进而分化为不同组织的前体[21，26-27]。该研究用胶原酶消化骨片培养法分离的大鼠下颌骨间充质干细胞经体外成骨、成脂诱导后，可分别形成钙结节和脂滴，这与从髂骨或股骨中获取的骨髓间充质干细胞的生物学特性相同，可以体外多向诱导分
化[1，17，28-31]。同时研究也发现该方法分离的间充质干细胞具有更强的成骨向分化能力，而成脂分化能力较弱。因此其更适用于骨组织工程的种子细胞。
总之，该研究利用密质骨是间充质干细胞的新来源，细胞可从骨片中迁徙这一特性，建立了一种新的、有效的、高纯度的下颌骨间充质干细胞分离方法。研究表明胶原酶消化骨片培养法分离的细胞高表达干细胞表面抗原而不表达造血系细胞特异性抗原；该细胞具有较强的自我复制和增殖能力，及在特定条件下可向成骨细胞、脂肪细胞分化的潜能。上述结果证实了胶原酶消化骨片培养法可成功分离足量的、高纯度的下颌骨间充质干细胞，为以种植体骨缺损修复为代表的颌骨骨组织工程提供充足的细胞来源，具有重要的意义。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

高纯度大鼠下颌骨来源间充质干细胞的分离、培养及生物学特性

Isolation, culture and biological characteristics of high-purity orofacial-bone-derived mesenchymal stem cells of the rats

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