Lingo-1介导Rho-ROCK通路调控神经干细胞的分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0625

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (29): 4669-4674.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0625

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Lingo-1介导Rho-ROCK通路调控神经干细胞的分化

彭志明，赵晓阳，朱凯，万勇

中山大学附属第一医院脊柱外科，广东省广州市 510080

修回日期:2018-05-14 出版日期:2018-10-18 发布日期:2018-10-18
通讯作者: 万勇，教授，主任医师，中山大学附属第一医院脊柱外科，广东省广州市 510080
作者简介:彭志明，男，1993年生，江西省上饶市人，汉族，中山大学附属第一医院脊柱外科在读硕士，主要从事神经干细胞与脊髓损伤相关研究。
基金资助:
国家自然科学基金(面上项目)(81472069，81171711)

Lingo-1 regulates neural stem cell differentiation via Rho-ROCK signaling pathway

Peng Zhi-ming, Zhao Xiao-yang, Zhu Kai, Wan Yong

Department of Spine Surgery, the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China

Revised:2018-05-14 Online:2018-10-18 Published:2018-10-18
Contact: Wan Yong, Professor, Chief physician, Department of Spine Surgery, the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China
About author:Peng Zhi-ming, Master candidate, Department of Spine Surgery, the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81472069 and 81171711

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
Lingo-1：由位于15q24-26染色体的LRRN6A基因表达的含614个氨基酸组成的跨膜蛋白，属于富含亮氨酸重复片段结构域(leucine-rich repeats，LRR)蛋白家族成员，是一种特异表达于神经元和少突胶质细胞的功能蛋白，对轴突再生、成髓鞘细胞分化等过程可能具有重要的负向调控作用。
Lingo-1的重要意义：已有较多的相关研究显示Lingo-1在中枢神经系统损伤后神经元死亡、轴突变性等多种病理生理过程中发挥重要作用，Lingo-1拮抗剂亦已成为了促进脊髓损伤修复的研究热点之一。Lv等发现使用Lingo-1抗体可改善脊髓损伤模型动物神经元的存活，Zhang等发现敲除Lingo-1基因可促进脊髓脱髓鞘病变动物的轴突再生。但目前关于Lingo-1对于神经干细胞影响的研究相对较少，而后者是治疗中枢神经系统损伤的一种极具应用前景的种子细胞，故探索Lingo-1对神经干细胞的影响及其具体机制具有重要的科研价值与现实意义。

摘要
背景：Lingo-1在神经元轴突再生、髓鞘形成等过程中具有重要作用，但其是否参与对神经干细胞分化的调控以及具体机制尚无定论。
目的：观察干预神经干细胞Lingo-1表达水平对其分化方向的影响，并探索其可能机制。
方法：从新生大鼠脑组织分离培养神经干细胞，经神经干细胞标志物检测鉴定后分别使用Lingo-1 shRNA慢病毒载体及阴性对照病毒转染神经干细胞，再用成神经元诱导分化培养基培养7 d，随后运用免疫荧光、免疫印迹技术检测神经元相关标志物表达，并检测RhoA、ROCK1蛋白表达水平。
结果与结论：①从新生大鼠脑组织所分离培养的神经干细胞呈浮球状生长，高表达神经干细胞特异性标志物Nestin、Sox2与Pax6，符合神经干细胞特征；②慢病毒载体转染可在mRNA及蛋白质水平实现对神经干细胞Lingo-1的干扰，经诱导培养7 d后Lingo-1敲低的神经干细胞分化为神经元的比例显著增加，且伴随着RhoA、ROCK1蛋白表达水平的下降；③结果表明，Lingo-1参与对神经干细胞分化方向的调控，抑制Lingo-1可促进其向神经元方向分化，该过程可能与调控Rho-ROCK通路有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-3399-7452(彭志明)

关键词: 神经干细胞, 巢蛋白, β-微管蛋白Ⅲ, 微管相关蛋白2, Rho/ROCK通路, Lingo-1蛋白, 细胞分化, 干细胞, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: It has been reported that Lingo-1 plays an important role in neuronal axon regeneration and myelination, but whether it participates in the regulation of neural stem cell differentiation remains unknown.
OBJECTIVE: To examine the effect of Lingo-1 knockdown on the differentiation of neural stem cells and to explore its potential mechanism.
METHODS: Neural stem cells were isolated from neonatal rat brain tissue and identified by determination of several neural stem cell specific markers. Then the cells were transfected with Lingo-1 shRNA lentivirus or negative control vectors, and were further cultured in induced differentiation medium for 7 days. Immunofluorescence and western blot techniques were thereafter used to detect the expression of neuron specific markers and to examine expression levels of RhoA and ROCK1.
RESULTS AND CONCLUSION: The cells isolated from brain tissue of neonatal rats aggregated to form non-adherent spherical clusters with high expression of Nestin, Sox2, and Pax6, specific markers of neural stem cells, which exhibited the characteristics of neural stem cells. After transfected with lentivirus, expression of Lingo-1 was successfully knocked down at mRNA and protein levels. After 7 days of induction, expression of neuron specific markers was significantly increased in Lingo-1 knocked-down neural stem cells. Meanwhile, expressions of RhoA and ROCK1 were decreased. Thus, Lingo-1 can be involved in the differentiation of neural stem cells. Inhibition of Lingo-1 can induce neural stem cells to differentiate into neurons, which is possibly related to the regulation of Rho-ROCK signaling pathway.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Neural Stem Cells, Cell Differentiation, Neurons, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

彭志明，赵晓阳，朱凯，万勇. Lingo-1介导Rho-ROCK通路调控神经干细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(29): 4669-4674.

Peng Zhi-ming, Zhao Xiao-yang, Zhu Kai, Wan Yong. Lingo-1 regulates neural stem cell differentiation via Rho-ROCK signaling pathway[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(29): 4669-4674.

图/表（结果） 2

参考文献

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引言

神经干细胞(neural stem cells，NSCs)作为神经系统发育和再生的种子细胞，被认为是治疗神经系统损伤和某些退行性疾病的潜在重要工具^[1]，其应用前景广阔，而对神经干细胞分化命运的调控一直是该领域重要研究方向之一^[2]。通过移植神经干细胞替代神经系统中损伤或死亡的神经细胞，进而修复神经系统的功能，这一治疗策略已在部分动物模型中得到验证，但距离真正应用于临床仍存在不少问题需要解决，特别是如何诱导神经干细胞定向分化^[3-4]。已有较多研究对诱导神经干细胞定向分化为神经元的可能方法与机制进行了探索，相关研究提示包括Notch、Wnt、PI3K/AKT/mTOR等多种信号通路均参与了该过程^[5-7]。众多机制的存在从另一角度反映了神经干细胞分化调控机制的复杂多样，需要进一步深入研究与探索。Lingo-1是富含亮氨酸重复片段结构域(leucine-rich repeats，LRR)蛋白家族的成员之一，且是该家族的主要功能蛋白。相关研究显示Lingo-1在神经元轴突再生、髓鞘形成等过程中具有重要的调控作用^[8]。正是基于Lingo-1在神经系统发生、发育过程中的重要地位^[9-10]，Lingo-1对神经干细胞分化过程的调控作用已成为一个研究热点，但目前该方面的相关研究主要集中于神经干细胞分化为少突胶质细胞、髓鞘化等^[11]，在神经干细胞分化为神经元方面少有报道。Lööv等^[12]研究提示了Lingo-1可能在神经干细胞分化为神经元过程中具有一定作用，但未对其可能机制进行进一步研究。

实验通过在基因水平调控神经干细胞Lingo-1表达，研究干预Lingo-1对神经干细胞向神经元分化的影响，并对其可能机制进行探索，以期为阐明Lingo-1在神经干细胞定向诱导分化为神经元中的作用与机制提供一定的实验依据与启示。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞分子生物学体外实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年12月至2017年10月在中山大学附属第一医院转化医学研究中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 SPF级健康孕SD大鼠(孕14 d)2只，由中山大学实验动物中心提供。实验动物生产许可证号：SCXK(粤)2016-0029。所有动物均在SPF环境(实验动物使用许可证号：SYXK(粤)2017-0081)中予以正常喂养，以减少环境干扰造成的差异。

1.3.2 实验用主要试剂 DMEM/F12基础培养基、B27无血清添加物(GIBCO公司)；表皮生长因子(EGF)、重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(PeproTech公司)；Accutase酶(eBioscience公司)；青霉素-链霉素、抗荧光淬灭封固液、DAPI、RIPA裂解液(强)、PMSF、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、Western封闭液、ECL显色液(上海碧云天生物技术有限公司)；大鼠神经干细胞成神经元诱导分化培养基(赛业生物科技有限公司)；LV-Lingo-1-shRNA及对照LV-control-shRNA(上海吉凯基因化学技术有限公司)；多聚赖氨酸(SIGMA公司)；40 g/L多聚甲醛(博士德生物工程有限公司)；Anti-Nestin抗体、Anti-β-actin抗体、Anti-GFAP抗体、Anti-β3-tubulin抗体、Anti-MAP2抗体、HRP标记的山羊抗兔抗体(CST公司)；Anti-Sox2抗体、Anti-Lingo-1抗体、Anti-ROCK1抗体、Anti-RhoA抗体(Abcam公司)；PVDF膜(0.45 μm，Merckmillipore公司)；HRP标记的山羊抗小鼠抗体(Affinity公司)；MiniBEST Universal RNA Extraction Kit(Cat No.9767，TaKaRa公司)；PrimeScript RT Master Mix(Cat No.#RR036Q，TaKaRa公司)；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(Cat No.#RR820A，TaKaRa公司)；引物由TIAN YI HUI YUAN合成，各引物序列(5'→3')分别为：Pax6基因：F，ACA GGG AGA AAA CAC CAA CT；R，AAA CTG CTG CTG ATA GGG AT；Lingo-1基因：F，AGG GCA AGG AGT TCA AGG AC；R，GGG TGA GAG CCA AAG GAT AG；β-actin：F，GCC CAT CTA TGA GGG TTA CGC；R，TAA TGT CAC GCA CGA TTT CCC。

1.4 实验方法

1.4.1 神经干细胞的分离培养 孕14 d SD大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠(2 mL/kg)，待麻醉后将其脱颈处死，于体积分数为75%乙醇中浸泡消毒10 min，无菌条件下剖腹取出胎鼠，再取出胎鼠全脑并置于含PBS的培养皿中，进一步分离除去小脑、脑干、血管、脑膜等组织，用眼科剪将脑组织剪碎至糜状，经200目不锈钢滤网过滤后离心所得滤液(1 000 r/min×5 min)，弃去上清液，加入神经干细胞增殖培养基(DMEM/F12培养基，添加2% B27、20 μg/L表皮生长因子、10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、1%青霉素-链霉素)重悬细胞并计数，以2×10⁸ L^-1细胞浓度于37 ℃、体积分数为5% CO₂、饱和湿度的恒温培养箱中培养，每2 d或3 d半量换液，观察细胞形态变化，五六天后使用Accutase酶消化分离克隆球并按1∶2传代继续培养。

1.4.2 神经干细胞的鉴定 无菌巴氏吸管吸取第3代神经干细胞克隆球接种至预先放置了40 g/L多聚赖氨酸包被无菌盖玻片的6孔板中，于37 ℃、体积分数为5% CO₂、饱和湿度的恒温培养箱中继续培养24 h，待克隆球贴壁后取出盖玻片，用PBS溶液轻轻漂洗2次，每次5 min，随后40 g/L多聚甲醛室温固定10 min，0.2% Triton X-100室温透化处理2 min，3% BSA 37 ℃封闭30 min，分别滴加Nestin、Sox2一抗覆盖细胞，室温孵育1 h，PBS洗3次，每次5 min，再分别滴加FITC标记的山羊抗小鼠IgG及PE标记的山羊抗兔IgG，室温孵育30 min，PBS洗3次，每次5 min，使用抗荧光淬灭封固液封固，于荧光显微镜下观察并拍照。

将神经干细胞分为增殖培养组和诱导分化组，分别予以神经干细胞增殖培养基和大鼠神经干细胞成神经元诱导分化培养基培养7 d，随后按RNA提取试剂盒说明分别提取各组神经干细胞的总RNA，再使用PrimeScript RT Master Mix试剂盒将RNA反转录成cDNA第一链，分别加入Pax6和β-actin基因引物，按照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒说明构建反应体系进行荧光定量PCR反应。

1.4.3 Lingo-1慢病毒转染神经干细胞 取第3代神经干细胞用Accutase酶消化成单细胞悬液，调整至5×10⁷ L^-1细胞浓度接种至6孔板中，分为3组，即未转染组(NT)、转染对照慢病毒组(Control LV)以及转染Lingo-1 shRNA慢病毒组(Lingo1 shRNA LV)，后两组按MOI=5分别加入LV-Lingo-1-shRNA和对照LV-control-shRNA慢病毒载体，于37 ℃、体积分数为5% CO₂条件下继续培养，3 d后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(eGFP)表达情况。

按RNA提取试剂盒说明分别提取上述3组神经干细胞的总RNA，使用PrimeScript RT Master Mix试剂盒将RNA反转录成cDNA第一链，分别加入Lingo-1和β-actin基因引物，按照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒说明构建反应体系进行荧光定量PCR反应。使用相对定量-ΔΔCT法计算基因的相对表达水平。

取上述3组神经干细胞，用PBS溶液漂洗后加入RIPA裂解液(含1% PMSF)按试剂说明书要求提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，上样至SDS-PAGE凝胶电泳，转移至PVDF膜后予5%脱脂奶粉封闭1 h，Lingo-1、β-actin一抗4 ℃孵育过夜，HRP标记的二抗室温孵育1 h，滴加ECL显色液后显影成像。结果以条带灰度值表示。

1.4.4 神经干细胞诱导分化为神经元及Rho/ROCK通路的检测 取上述3组神经干细胞用Accutase酶消化成单细胞悬液，以2×10⁴/cm²接种至预先以40 g/L多聚赖氨酸包被的6孔板中，待细胞贴壁后每孔更换为2 mL大鼠神经干细胞成神经元诱导分化培养基，于37 ℃、体积分数为5% CO₂条件下继续培养，每3 d换液1次，7 d后按上述步骤提取总蛋白检测神经元标志物β3-tubulin、星形胶质细胞标志物GFAP以及ROCK1、RhoA蛋白水平；同上述步骤使用免疫荧光技术检测神经元标志物MAP2表达情况。

1.5 主要观察指标 ①神经干细胞光镜下的形态以及特异性标志物Nestin、Sox2和Pax6的表达；②慢病毒转染后Lingo-1 mRNA及蛋白表达水平；③不同处理组经诱导分化后神经元特异标志物(β3-tubulin、MAP2)、星形胶质细胞特异标志物(GFAP)及RhoA、ROCK1表达水平。

1.6 统计学分析 数据以x(_)±s表示，使用SPSS 24.0统计软件进行统计分析。多组间比较采用方差分析(One-Way ANOVA)，组间两两比较采用Bonferroni法，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

实验率先对Lingo-1调控神经干细胞分化方向的可能作用与机制进行了探索，结果显示干扰Lingo-1表达水平可促进神经干细胞向神经元分化，该过程伴随着RhoA、ROCK1蛋白水平的下降，提示Lingo-1可能通过影响RhoA-ROCK通路对神经干细胞分化方向提供调控作用。

由于神经系统自我再生修复能力非常微弱，部分中枢神经系统疾病的治疗一直是难点，再生医学的快速发展为其带来了转机，其中具有分化为神经元潜能的神经干细胞前景广阔，有望为许多目前尚属于难治性神经系统疾病带来革命性突破^[13-14]。但神经干细胞除可分化为神经元外，还具有分化为星形胶质细胞和少突胶质细胞的潜能，如何调控神经干细胞的分化方向并促使其分化为神经元成为神经干细胞领域的一个重要研究方向^[15-16]。

实验从Lingo-1入手，探索其对神经干细胞分化方向的影响。Lingo-1被认为是一种神经生长抑制因子，既往研究多集中于轴突再生、少突胶质细胞的分化与髓鞘化这两方面，目前认为Lingo-1对这两个过程均发挥负性调控作用，并可能涉及多种机制^[17-19]。而关于Lingo-1对神经干细胞分化方向的调控作用则仅有少量文章报道，Lööv等^[12]发现加用Lingo-1抗体处理可使神经干细胞分化并保持在早期神经元阶段，Wang等^[20]发现通过慢病毒转染干扰神经干细胞Lingo-1基因表达同时加用Notch通路抑制剂DAPI可促进神经干细胞分化为神经元。在此次研究中，采用RNA干扰方式抑制神经干细胞Lingo-1表达后，经诱导培养基诱导后其β3-tubulin、MAP2表达水平显著增加，而GFAP表达水平则明显下降，提示抑制Lingo-1可调控神经干细胞向神经元方向分化，抑制向星形胶质细胞分化，与已有研究结论基本一致。

关于Lingo-1调控神经干细胞分化为神经元的机制方面则鲜有报道。在既往对Lingo-1与轴突再生、髓鞘化的研究中，有学者发现Rho家族可能参与了Lingo-1的调控过程^[21]。故对Rho-ROCK通路进行了研究，发现干扰Lingo-1表达后伴随着RhoA、ROCK1表达水平的下降，提示干扰Lingo-1表达可能通过抑制Rho-ROCK通路促进神经干细胞分化为神经元。Rho-ROCK信号通路被认为与多种生理或病理过程有关，如诱导细胞骨架重组、细胞迁移和应力纤维形成，调控内皮通透性、组织收缩和生长、神经细胞凋亡，以及参与糖尿病肾病、眼疾病、肿瘤、心脏病、神经损伤性疾病、高血压、辐射损伤和白血病等疾病的发生^[22-23]。此外，较多研究显示许多神经系统疾病可发现伴有ROCK的异常激活，抑制ROCK活性除了能够动员神经干细胞分化，还可通过调控炎性微环境等机制发挥保护或治疗作用^[24-27]，而干扰Lingo-1表达是否有类似效应，尚需进一步研究探讨。

值得注意的是，该研究仍有一些有待完善的地方。首先，在实验中发现干扰Lingo-1伴随着RhoA、ROCK1水平的下降，但二者之间是否是因果关系，尚无法证实。其次，仅在细胞水平开展研究，在复杂的体内环境中干预Lingo-1对神经干细胞分化方向是否仍有类似调控作用尚不得而知。这些问题的解答，尚需进一步深入研究。

总而言之，已有较多研究显示干扰Lingo-1可发挥对脊髓损伤等神经系统疾病的治疗作用^[28-30]，Lingo-1作为靶点其应用前景广阔、潜力巨大，对其作用机制的继续深入研究将促进其更快更好地向临床转化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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