不同途径移植脂肪间充质干细胞修复肝纤维化：客观标准评价的比较

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0624

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
肝纤维化的评价指标：
(1)透明质酸：为细胞基质的主要成分之一，由间质细胞合成，可较准确灵敏地反映肝内已生成的纤维量及肝细胞受损状况，有人认为该指标较之肝活检更能完整反映出病肝全貌，是肝纤维化和肝硬变的敏感指标。
(2)层粘连蛋白：为基底膜中特有的非胶原性结构蛋白，与肝纤维化活动程度及门静脉压力呈正相关，慢活肝和肝硬变及原发性肝癌时明显增高。层粘连蛋白也可以反映肝纤维化的进展与严重程度。
(3)Ⅲ型前胶原：反映肝内Ⅲ型胶原合成，血清含量与肝纤程度一致，并与血清γ-球蛋白水平明显相关。Ⅲ型前胶原与肝纤维化形成的活动程度密切相关，但无特异性。其他器官纤维化时，Ⅲ型前胶原也升高。持续Ⅲ型前胶原升高的慢性肝炎患者提示病情向肝硬变形成发展，而Ⅲ型前胶原降至正常可预示病情缓解。血清Ⅲ型前胶原水平与肝纤维化病变程度呈密切相关，反映肝纤维合成状况和炎症活动性，早期即显著升高，而陈旧性肝硬化和部分晚期肝硬变、肝萎缩患者血清Ⅲ型前胶原不一定增高。

摘要
背景：在干细胞移植治疗肝脏损伤的过程中，移植途径的选择可能会直接影响治疗效果。
目的：对比分析经尾静脉、门静脉及肝动脉途径移植脂肪间充质干细胞修复肝纤维化大鼠的差异。
方法：75只雄性大鼠中取15只作为正常对照，不进行任何干预；取剩余60只大鼠，采用皮下注射四氯化碳的方法建立肝纤维化模型，建模成功后随机分4组干预，其中3组分别经肝动脉、门静脉、尾静脉移植同种异体脂肪间充质干细胞悬液2 mL(细胞浓度为1×10⁹ L^-1)，模型组尾静脉注射等量的细胞培养液。细胞移植4周后，进行肝功能、肝纤维化指标检测及肝脏组织病理学观察。
结果与结论：①与模型组相比，尾静脉移植组、肝动脉移植组和门静脉移植组大鼠谷丙转氨酶、谷草转氨酶及总胆红素水平显著降低(P < 0.05)；与尾静脉移植组相比，肝动脉移植组和门静脉移植组上述指标均显著降低(P < 0.05)；肝动脉移植组上述指标与门静脉移植组相比差异无显著性意义；②与模型组相比，尾静脉移植组、肝动脉移植组和门静脉移植组大鼠肝组织透明质酸、层粘连蛋白和Ⅲ型前胶原水平均显著降低(P < 0.05)；与尾静脉移植组相比，肝动脉移植组和门静脉移植组上述指标均显著降低(P < 0.05)；肝动脉移植组上述指标与门静脉组相比差异无显著性意义；③苏木精-伊红及Masson染色显示，模型组呈典型的肝纤维化病理改变；与模型组相比，尾静脉移植组、肝动脉移植组和门静脉移植组肝纤维化均有不同程度的改善，其中肝动脉移植组和门静脉移植组改善程度优于尾静脉移植组；④结果表明，经尾静脉、肝动脉及门静脉移植脂肪间充质干细胞，均可改善SD大鼠肝纤维化的肝功能及肝纤维化程度，其中经肝动脉与门静脉移植的效果要优于尾静脉移植。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-8799-9659(古春)

关键词: 脂肪间充质干细胞, 移植途径, 肝纤维化, SD大鼠, 尾静脉移植, 门静脉移植, 肝动脉移植, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: The choice of transplant approach may directly affect the therapeutic effect of stem cell transplantation on liver injury.
OBJECTIVE: To compare the therapeutic differences in liver fibrosis rats treated with transplantation of adipose-derived mesenchymal stem cells via caudal vein, portal vein and hepatic artery.
METHODS: Seventy-five male Sprague-Dawley rats were selected, 15 of which were used as normal control without any intervention, and the remaining 60 rats were used to establish liver fibrosis models by subcutaneous injection of carbon tetrachloride. After modeling, these model rats were divided into four groups, in three groups of which, allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cell suspension (2 mL, cell concentration of 1×10⁹/L) was transplanted through hepatic artery, portal vein and caudal vein. The model group was injected with the same amount of cell culture medium via caudal vein. After 4 weeks of transplantation, liver function, liver fibrosis indexes and liver histopathology were detected and observed.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the model group, the serum levels of alanine aminotransferase, alanine aminotransferase and total bilirubin were significantly reduced in the three transplantation groups (P < 0.05). Compared with the caudal vein transplantation group, the above indexes in and hepatic artery and portal vein transplantation groups were significantly lowered (P < 0.05). However, there was no difference between hepatic artery transplantation group and portal vein transplantation group. (2) Compared with the model group, the levels of hyaluronic acid, laminin and type III procollagen in liver tissues decreased significantly in the three cell transplantation groups (P < 0.05). Compared with the caudal vein transplantation group, the above indexes were significantly decreased in the hepatic artery transplantation group and portal vein transplantation group (P < 0.05). However, there was no difference in the above indexes between hepatic artery transplantation group and portal vein transplantation group. (3) Findings from hematoxylin-eosin staining and Masson staining showed typical pathological changes of liver fibrosis in the model group. Liver fibrosis was improved to different extents in the three transplantation groups as compared with the model group. The regression of liver fibrosis in hepatic artery transplantation group and portal vein transplantation group was better than that in caudal vein transplantation group. These findings indicate that adipose-derived mesenchymal stem cells transplanted via caudal vein, hepatic artery and portal vein can improve liver function and regress liver fibrosis in hepatic fibrosis rats. Moreover, cell transplantation via hepatic artery and portal vein is better than that via caudal vein.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cell Transplantation, Liver Cirrhosis, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

古春，俞小炯，董科，熊伟，彭盛坤. 不同途径移植脂肪间充质干细胞修复肝纤维化：客观标准评价的比较[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(29): 4663-4668.

Gu Chun, Yu Xiao-jiong, Dong Ke, Xiong Wei, Peng Sheng-kun. Regression of liver fibrosis after adipose-derived mesenchymal stem cell transplantation via different approaches: an objective standard comparison[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(29): 4663-4668.

图/表（结果） 1

2.1 脂肪间充质干细胞培养与鉴定结果 分离培养的脂肪间充质干细胞接种24 h开始贴壁，细胞多为圆形或多角形，随着时间的延长，细胞胞体变大，生长缓慢，换液后细胞增殖加快，5 d可传代；第3代脂肪间充质干细胞生长旺盛，细胞形态伸展为三角形、多角形，最终趋于长梭形，见图1。第3代脂肪间充质干细胞表面标记物CD90、CD29为阳性表达，CD34、CD45为阴性表达(图2)，并可向脂肪细胞与成骨细胞分化(图3)，说明分离培养的为间充质干细胞。

2.2 实验动物数量分析 实验过程中每组均保证15只实验动物，最终75只大鼠进入结果分析。

2.3 肝功能指标 细胞移植4周后，与正常对照组相比，模型组大鼠血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶和总胆红素水平均显著升高(P < 0.05)；与模型组相比，尾静脉移植组、肝动脉移植组和门静脉移植组大鼠谷丙转氨酶、谷草转氨酶及总胆红素水平均显著降低(P < 0.05)；与尾静脉移植组相比，肝动脉移植组和门静脉移植组大鼠谷丙转氨酶、谷草转氨酶及总胆红素水平均显著降低(P < 0.05)；肝动脉移植组大鼠谷丙转氨酶、谷草转氨酶及总胆红素水平与门静脉移植组接近，见表1。

2.4 肝纤维化指标 肝组织透明质酸、层粘连蛋白和Ⅲ型前胶原水平能反映细胞外基质的沉积程度^[8]。细胞移植4周后，与正常对照组相比，模型组大鼠肝组织透明质酸、层粘连蛋白和Ⅲ型前胶原水平明显升高(P < 0.05)；与模型组相比，尾静脉移植组、肝动脉移植组和门静脉移植组大鼠肝组织透明质酸、层粘连蛋白和Ⅲ型前胶原水平均显著降低(P < 0.05)；与尾静脉移植组相比，肝动脉移植组和门静脉移植组肝组大鼠织透明质酸、层粘连蛋白和Ⅲ型前胶原水平均显著降低(P < 0.05)；肝动脉移植组大鼠肝组织透明质酸、层粘连蛋白和Ⅲ型前胶原水平与门静脉组接近，见表2。

2.5 肝组织病理变化 细胞移植4周后，苏木精-伊红染色结果显示，正常对照组肝组织及肝细胞结构正常，无炎细胞浸润及纤维组织增生；模型组可见大范围的肝细胞变性及坏死，纤维组织增生，在汇管区及中央静脉周围有大量炎性细胞浸润，呈典型的肝纤维化病理改变；与模型组相比，尾静脉移植组、肝动脉移植组和门静脉移植组大鼠肝细胞变性及坏死、炎性细胞浸润及纤维组织增生均有不同程度的改善，其中肝动脉移植组和门静脉移植组改善程度优于尾静脉移植组(图4)。

Masson染色结果显示，模型组肝组织呈现典型的肝纤维化表现，尾静脉移植组、门静脉移植组与肝动脉移植组肝纤维化程度均明显轻于模型组，并且门静脉移植组、肝动脉移植组肝纤维化改善程度优于尾静脉移植组(图4B)。

Chevallier肝纤维化组织学半定量计分系统显示，正常对照组为1.23±0.98，模型组为18.86±3.26，尾静脉移植组为13.25±1.69，门静脉移植组为9.28±3.16，肝动脉移植组为9.43±2.97；模型组评分显著高于正常对照组(P < 0.05)；尾静脉移植组、门静脉移植组、肝动脉移植组评分明显低于模型组(P < 0.05)；门静脉移植组、肝动脉移植组评分明显低于尾静脉移植组(P < 0.05)；门静脉移植组与肝动脉移植组评分差异无显著性意义。

参考文献

[1] Pavlov CS, Casazza G, Nikolova D, et al. Transient elastography for diagnosis of stages of hepatic fibrosis and cirrhosis in people with alcoholic liver disease. Cochrane Database Syst Rev. 2015;1: CD010542.

[2] Friedman SL. Hepatic Fibrosis: Emerging Therapies. Dig Dis. 2015; 33(4):504-507.

[3] 李辰,李勇文. 氧化应激致肝纤维化发生机制[J]. 中国保健营养, 2017, 27(5):296.

[4] Yamashita T, Takayama K, Sakurai F, et al. Billion-scale production of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 2018;496(4):1269-1275.

[5] Takayama K, Akita N, Mimura N, et al. Generation of safe and therapeutically effective human induced pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like cells for regenerative medicine. Hepatol Commun. 2017;1(10):1058-1069.

[6] 杜盼,余江南,徐希明. 人源多能干细胞体外定向诱导分化为肝细胞[J]. 江苏大学学报(医学版), 2018,28(1):39-46.

[7] 王彦会,王志茹,孙岩,等. HBV感染者脂肪间充质干细胞体外诱导为肝样细胞[J]. 中国组织工程研究, 2017,21(25):3983-3988.

[8] 刘卫,余森源,严和中,等. 骨髓间质干细胞移植对肝纤维化模型大鼠治疗效果[J]. 临床军医杂志, 2017,45(9):903-907.

[9] 马虎成,王鑫,吴旻娜,等. 骨髓间充质干细胞对急性肝衰竭的治疗作用及机制[J]. 中华肝胆外科杂志, 2017,23(10):694-699.

[10] 顾世杰,陈云浩,赵辉,等. 不同途径移植人脐带间充质干细胞对大鼠肝脏缺血-再灌注损伤修复研究[J]. 器官移植, 2017,8(3):190-194.

[11] 刘志娟,安曦洲,肖莉,等. 人脐带间充质干细胞对类噬血细胞性淋巴组织细胞增多症小鼠模型肝脏损伤的修复作用及机制[J]. 第三军医大学学报, 2016,38(17):1929-1936.

[12] Abdellatif H, Shiha G, Saleh DM, et al. Effect of human umbilical cord blood stem cell transplantation on oval cell response in 2-AAF/CCL4 liver injury model: experimental immunohistochemical study. Inflamm Regen. 2017;37:5.

[13] Hong J, Jin H, Han J, et al. Infusion of human umbilical cord?derived mesenchymal stem cells effectively relieves liver cirrhosis in DEN?induced rats. Mol Med Rep. 2014;9(4):1103-1111.

[14] Teshima T, Matsumoto H, Michishita M, et al. Allogenic Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells Ameliorate Acute Hepatic Injury in Dogs. Stem Cells Int. 2017;2017:3892514.

[15] Qu Y, Zhang Q, Cai X, et al. Exosomes derived from miR-181-5p-modified adipose-derived mesenchymal stem cells prevent liver fibrosis via autophagy activation. J Cell Mol Med. 2017;21(10): 2491-2502.

[16] 张洁利, 靳寸朵. 一例脐带间充质干细胞治疗肝衰竭合并腹水的护理[J]. 中华现代护理杂志, 2015,21(3):359-360.

[17] 薛改,陈则纱,刘建芳, 等. 不同方案移植脐带间充质干细胞对硫代乙酰胺所致大鼠肝纤维化治疗效果的比较[J]. 解放军医药杂志, 2016,28(4):12-17, 21.

[18] Deng L, Kong X, Liu G, et al. Transplantation of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells Efficiently Rescues Thioacetamide-Induced Acute Liver Failure in Mice. Transplant Proc. 2016;48(6):2208-2215.

[19] Saidi R, Rajeshkumar R, Shariftabrizi A, et al. Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells Promote Liver Regeneration. J Invest Surg. 2015;28(6):303-308.

[20] 陈霞,胡文君,王英杰. 人眼袋脂肪组织来源间充质干细胞的分离及生物学特性观察[J]. 延安大学学报(医学科学版), 2017,15(2):1-4.

[21] 赵刚,刘微微,高伟玮,等. 不同组织来源间充质干细胞体外成骨分化能力的比较研究[J]. 中国骨质疏松杂志, 2017,23(5):561-566,584.

[22] 周炜,张骏,凡进,等. 过氧化物酶体增殖物激活受体2及其磷酸化形式在脂肪干细胞脂向分化过程中的表达[J]. 中国老年学杂志, 2017,37(6): 1304-1306.

[23] 王三虎,满荣勇,高细强,等. 脂肪干细胞的诱导分化及其来源的研究[J]. 现代生物医学进展, 2017,17(24):4606-4609.

[24] 兰玲, 于静, 刘冉, 等. 骨髓内皮祖细胞输注后在肝纤维化大鼠肝脏内的示踪研究[J]. 中华器官移植杂志, 2012,33(11):684-688.

[25] 李蓉. 脂肪间质干细胞移植对肝硬化大鼠的实验研究[J]. 河北医学, 2016, 22(2):180-184.

[26] 曹后康,高雅,黄思茂,等. 杠板归总黄酮抗大鼠肝纤维化作用的机制研究[J]. 中国药理学通报, 2017,33(9):1303-1308.

[27] 寻权. 人羊膜上皮细胞移植治疗肝硬化大鼠的初步研究[D]. 长沙: 中南大学, 2013.

[28] 范冬梅,张子祥,赵英新,等. 人脐带来源间充质干细胞向HepG2肝癌细胞原位移植瘤的归巢及分化[J]. 中国肿瘤生物治疗杂志, 2017,24(6):595-600.

[29] 杨鹏飞,解景东,颜炳柱,等. Bcl-2基因修饰的骨髓间充质干细胞治疗急性肝衰竭的初步研究[J]. 肝脏, 2017,22(1):27-31.

[30] 李畅. Wip1基因敲除对急性肝损伤的影响及其机制研究[D]. 北京: 北京协和医学院中国医学科学院;清华大学医学部, 2015.

[31] 游佳,焦艳,郑琦,等. 不同途径移植骨髓间充质干细胞对大鼠肝纤维化进程的影响[J]. 中华实验外科杂志, 2015,32(10):2417-2419.

[32] 张雯,陈香宇,何巧玉,等. 经不同方式移植骨髓间充质干细胞治疗肝纤维化的疗效[J]. 实用医学杂志, 2013,29(6):889-891.

[33] Wang Y, Lian F, Li J, et al. Adipose derived mesenchymal stem cells transplantation via portal vein improves microcirculation and ameliorates liver fibrosis induced by CCl4 in rats. J Transl Med. 2012;10:133.

引言

材料方法

1.1 设计 随机分组，对照观察动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年12月至2017年6月在四川省人民医院完成。

1.3 材料

实验动物：4周龄SD大鼠3只，清洁级，体质量100-150 g，用于脂肪间充质干细胞的分离培养；7周龄雄性SD大鼠79只，体质量(260±15) g，用于动物实验，实验动物由四川省医学科学院提供。实验过程中对动物的处置遵循动物医学伦理学要求。

实验用主要试剂与仪器：四氯化碳购自南京化学试剂股份有限公司；成骨细胞诱导培养基、成脂细胞诱导培养基、橄榄油购自行知生物科技有限公司；水合氯醛购自武汉博莱特化工有限公司；胰酶、胶原酶Ⅰ购自北京智杰方远科技有限公司；胎牛血清购自上海抚生实业有限公司；DMEM培养基购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；成纤维细胞培养基购自赛业生物科技有限公司；鼠抗人CD34、CD29、CD45、CD90单抗购自上海信裕生物科技有限公司；ELISA试剂盒购自江苏科晶生物科技有限公司；苏木精、伊红购自北京索莱宝生物科技公司；流式细胞仪、全自动生化分析仪购自贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司；CO₂培养箱购自上海启前电子科技有限公司；倒置显微镜(购自奥林巴斯(中国)有限公司。

1.4 方法

1.4.1 脂肪间充质干细胞的分离培养、鉴定 参照以往文献的方法分离培养脂肪间充质干细胞^[20]。取4周龄SD大鼠3只，7%水合氯醛(5 mL/kg)麻醉后处死，无菌条件下获取大鼠腹股沟处皮下脂肪组织，将脂肪组织用含有双倍双抗的PBS漂洗，洗净血块。将脂肪组织放入少量PBS中，以眼科剪反复剪碎成1 mm×1 mm×1 mm细小组织块；加入2 mL左右1 g/L胶原酶Ⅰ消化液，转移至15 mL离心管中，37 ℃恒温摇床振荡消化30 min，见基本没有大的组织块后，加入等体积成纤维细胞培养基中止消化，1 000 r/min离心8 min。弃去上清液及悬浮脂肪组织，加入含有体积分数10%胎牛血清的DMEM完全培养基，接种于培养皿中，置于37 ℃ CO₂培养箱中培养。2 d后进行首次换液，以后3 d换液1次，细胞达80%以上融合时胰酶消化，按照1∶3细胞比例进行传代培养。倒置显微镜观察细胞的生长情况。实验选择第3代脂肪间充质干细胞进行细胞移植。

1.4.2 脂肪间充质干细胞的鉴定 ①取生长状态良好的第3代脂肪间充质干细胞，经胰酶消化后，用含0.5% BSA的PBS冲洗，采用流式细胞仪检测细胞CD34、CD90、CD29、CD45表面标记物的表达(同型对照抗体分别为IgG1-FITC、IgG2a-FITC、IgG2a-PE、IgG1-PE)^[21]；②取生长良好的第3代脂肪间充质干细胞，以1×10⁷ L^-1的细胞浓度接种至6孔板，加入成脂细胞诱导培养基(含1 μmol/L地塞米松，200 μmol/L吲哚美辛、0.5 μmol/L IBMX，10 mg/L胰岛素，含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基)培养10 d，进行油红O染色，观察脂滴形成情况^[22]；③取生长良好的第3代脂肪间充质干细胞，以1×10⁷ L^-1的细胞浓度接种至6孔板，加入成骨细胞诱导培养基(含10 μmol/L地塞米松、50 μmol/L维生素C、10 mmol/L β-磷酸甘油钠、含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基)培养21 d，进行茜素红染色，观察钙结节形成情况^[23]。

1.4.3 肝纤维化动物模型的建立 取4只SD大鼠，皮下注射体积分数40%四氯化碳3 mL/kg(四氯化碳与橄榄油体积为2∶3)，2次/周，首剂加倍，共注射6周，建立肝纤维化模型^[24]。6周后，通过肝组织苏木精-伊红染色病理观察大鼠肝小叶界限不清，胞质内还可见多个大小不等的脂肪空泡，出现炎性细胞浸润及纤维组织增生，结果证明肝纤维化大鼠造模成功。

1.4.4 实验动物分组及干预 取75只SD大鼠，随机选取其中的15只作为正常对照，不进行任何干预。将剩余的60只大鼠随机分为模型组、肝动脉移植组、门静脉移植组与尾静脉移植组4组，每组15只，4组均按照上述介绍的方法建立肝纤维化模型，建模成功后立即采用水合氯醛麻醉大鼠，门静脉移植组在上腹部正中制作一3 cm的切口，分离结缔组织，暴露门静脉，将33G针穿刺入门静脉近端，缓慢注射2 mL脂肪间充质干细胞悬液，细胞浓度为1×10⁹L^-1[25]，拔针，压迫止血，关闭腹腔；肝动脉移植组在上腹部正中制作一长度为3 cm的切口，暴露肝总动脉、肝固有动脉与胃十二指肠动脉，显微镜下结扎胃十二指肠动脉，以血管夹阻断肝总动脉，在胃十二指肠动脉结扎处近端插入33G针，缓慢注射2 mL脂肪间充质干细胞悬液，细胞浓度为1×10⁹L^-1，结扎胃十二指肠动脉近端，拔针，恢复肝总动脉血流，关闭腹腔；尾静脉移植组通过尾静脉缓慢注射2 mL脂肪间充质干细胞悬液，细胞浓度为1×10⁹L^-1；模型组尾静脉注射等量的细胞培养液。如造模过程中有动物死亡，则采用相同方法再次造模，补足动物数量。

1.5 主要观察指标

1.5.1 肝功能指标检测 细胞移植4周后，抽取各组大鼠尾静脉血1.5-2.0 mL，加入含肝素的抗凝管内，3 000 r/min离心8 min，收集血清，采用全自动生化分析仪检测谷丙转氨酶、谷草转氨酶和总胆红素水平。

1.5.2 肝纤维化指标检测 细胞移植4周后，麻醉处死各组大鼠，取肝脏组织，精确称取100 mg组织块，制备肝组织匀浆，离心，留取上清液。采用ELISA法检测上清液中透明质酸、层粘连蛋白和Ⅲ型前胶原蛋白水平^[26]。

1.5.3 肝脏病理组织学变化 细胞移植4周后，麻醉处死各组大鼠，取肝脏组织，切成约1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm的小块，体积分数10%甲醛固定72 h，切片，进行苏木精-伊红染色，观察肝脏组织病理改变。结合Masson染色，按照Chevallier肝纤维化组织学半定量计分系统进行评估，此系统包括小叶中央静脉及窦周间隙、汇管区、纤维隔3部分，评分越高说明肝纤维化程度越重^[27]。每个样本随机选取3个含汇管区的视野。

1.6 统计学分析 采用SPSS 20.0统计软件包进行统计学处理，数据均采用x(_)±s表示，如果符合正态分布和方差齐性检验，进行多样本均数两两之间全面比较的 LSD-t 检验，如果不符合则秩转换后用非参数检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

间充质干细胞具有较强的肝脏归巢能力，是治疗肝纤维化较理想的细胞，并且美国FDA已批准干细胞移植可作为肝纤维化治疗的有效方法。间充质干细胞经不同途径移植入机体后，在基质细胞衍生因子1与肝细胞生长因子的作用下归巢至受损肝组织，分化为肝细胞^[28-29]。但是不同途径移植干细胞对肝纤维化的修复作用是否存在差异呢？查阅文献发现，目前有关脂肪间充质干细胞通过尾静脉、肝动脉及门静脉移植修复肝纤维化的研究较多见，但是对比不同移植途径修复效果的研究并不多见，因此实验主要观察3种移植途径对干细胞移植效果是否有影响。

肝动脉是肝脏的营养血管，其血流量占肝全部血流量的20%-30%；门静脉是肝的功能血管，其血量占肝血供的70%-80%；由外周血供应肝脏的血量近占很小一部分^[30]，那么经这些途径移植的效果如何呢？作者对3种途径的移植效果做了比较，肝功能检测结果显示注射四氯化碳6周后，模型组肝功能指标谷丙转氨酶、谷草转氨酶和总胆红素水平较正常对照组均显著升高(P < 0.05)，经脂肪间充质干细胞移植治疗后，谷丙转氨酶、谷草转氨酶和总胆红素水平明显下降(P < 0.05)，说明经尾静脉、肝动脉及门静脉移植均可改善肝纤维化的肝功能；随后对不同途径移植效果进行了对比，发现门静脉、肝动脉移植途径对肝纤维化肝功能的改善程度均优于尾静脉移植途径(P < 0.05)。肝纤维化指标检测结果显示注射四氯化碳6周后，模型组大鼠肝组织透明质酸、层粘连蛋白和Ⅲ型前胶原水平较正常对照组明显升高(P < 0.05)；经脂肪间充质干细胞移植治疗后，肝组织透明质酸、层粘连蛋白和Ⅲ型前胶原水平均显著降低(P < 0.05)，说明经尾静脉、肝动脉及门静脉移植均可改善肝纤维化的肝纤维化程度；随后对不同途径移植效果进行了对比，发现门静脉、肝动脉移植途径对肝纤维化的改善程度均优于尾静脉移植途径(P < 0.05)。为了进一步验证脂肪间充质干细胞的移植效果，实施了肝脏病理观察。苏木精-伊红及Masson染色显示，模型组呈典型的肝纤维化病理改变；与模型组比较，尾静脉移植组、肝动脉移植组、门静脉移植组肝纤维化均有不同程度的改善，其中肝动脉移植组、门静脉移植组改善程度优于尾静脉移植组。实验结果说明经不同途径移植脂肪间充质干细胞对大鼠肝纤维化治疗有一定的影响。但是不同的研究有不同的结果，例如：游佳等^[31]观察经尾静脉、腹膜腔或肝内注射3种途径移植骨髓间充质干细胞对大鼠肝纤维化进程的影响，造模12周结束时发现仅经尾静脉移植组炎症活动度、纤维化以及α-平滑肌肌动蛋白表达均低于模型组(P < 0.01)，认为经外周静脉移植骨髓间充质干细胞能减轻大鼠肝脏炎症和α-平滑肌肌动蛋白表达，减轻肝纤维化。张雯等^[32]观察静脉内、肝内、及腹腔注射移植骨髓间充质干细胞治疗大鼠肝纤维化的疗效，认为静脉移植骨髓间充质干细胞是最有效抵抗肝脏纤维化的治疗途径，与游佳等的结论相同。Wang等^[33]研究发现在肝功能及组织学检查方面，门静脉注射脂肪间充质干细胞大鼠肝纤维化模型的效果要优于尾静脉注射，说明尾静脉注射脂肪间充质干细胞的归巢作用可能相对较弱，与此次研究结果一致。分析研究结果差异的原因可能为：所选择的干细胞来源不同，不同间充质干细胞的研究进展不一，实验动物模型制作差异，移植细胞数量不同等。

分析经肝动脉、门静脉移植脂肪间充质干细胞修复肝纤维化优于尾静脉移植途径的可能原因：在移植治疗过程中，在相同条件下通过肝动脉或门静脉移植途径到达肝脏的有效细胞更多，用于修复肝脏的细胞也相对较多；通过肝动脉或门静脉移植的脂肪间充质干细胞，在肝脏内分布更均匀，更加接近于人体肝脏运作功能，发挥更好的治疗效果^[25]。但是此次实验仅是在大鼠肝纤维化模型中得到的结论，是否适用于其他动物的肝纤维化模型还需要进一步的研究。

结合临床可知，外周静脉移植是较简便的方法，通过肝动脉移植干细胞移植治疗肝纤维化已是常规技术，而门静脉移植较困难，临床风险也较大，一般不将其作为首选移植途径。所以在临床上，应结合多方面的原因选择合适的移植途径。

综上所述，脂肪间充质干细胞移植治疗肝纤维化具有较好的治疗作用，经不同途径移植治疗可能存在一定的差异。但是移植细胞归巢定植的具体机制、远期疗效及安全性评价等都是需要继续努力的方向。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程