内质网凋亡途径参与了高糖诱导髓核细胞凋亡的过程

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0542

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
细胞凋亡：是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用；它并不是病理条件下自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。细胞发生凋亡时，就像树叶或花的自然凋落一样，对于这种生物学观察，借用希腊“Apoptosis”来表示，意思是像树叶或花的自然凋落，可译为细胞凋亡。
内质网应激(ER stress)：表现为内质网腔内错误折叠与未折叠蛋白聚集以及钙离子平衡紊乱，可激活未折叠蛋白反应、内质网超负荷反应和 caspase-12介导的凋亡通路等信号途径，既能诱导糖调节蛋白GRP78、GRP94等内质网分子伴侣表达而产生保护效应，亦能独立地诱导细胞凋亡。内质网应激直接影响应激细胞的转归，如适应、损伤或凋亡。

摘要
背景：椎间盘退变是下腰痛的主要诱因，髓核细胞的凋亡是椎间盘退变的重要危险因素。然而，椎间盘退变引起下腰痛的具体分子机制目前尚不明确。
目的：探讨内质网应激是否参与高糖诱导兔髓核细胞凋亡的过程。
方法：将第3代兔髓核细胞随机分为空白对照组(正常培养液)；高糖组(培养基中葡萄糖浓度为100 mmol/L)；抑制剂组(培养基中含有Caspase-12抑制剂Z-ATAD-FMK)；抑制剂+高糖组(培养基中含有Z-ATAD-FMK及100 mmol/L的葡萄糖)。分别处理6 h后，检测各组细胞的增殖活性、凋亡率、活性氧自由基、Caspase-12和葡萄糖调节蛋白78的变化情况。
结果与结论：①高糖组细胞增殖明显抑制，活性氧自由基、凋亡率、Caspase-12和葡萄糖调节蛋白78表达量较对照组明显增加；②Z-ATAD-FMK可以降低高糖诱导的细胞凋亡率以及Caspase-12和葡萄糖调节蛋白78表达的增加；③结果表明，内质网凋亡通路参与了高糖诱导兔髓核细胞的凋亡过程；高糖诱导的活性氧自由基过量产生及积累是引起内质网应激的主要因素。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-3080-2923(李咸周)

关键词: 细胞凋亡, 内质网应激, Caspase-12, Grp78, 葡萄糖调节蛋白78, 髓核细胞, 椎间盘, 退变, 糖尿病, 代谢障碍, 下腰痛, 组织构建

Abstract:

BACKGROUND: Intervertebral disc degeneration (IDD) is the main cause of low back pain, and nucleus pulposus cell apoptosis is an important risk factor for IDD. However, the underling mechanism at molecular level remains unknown.
OBJECTIVE: To investigate whether endoplasmic reticulum stress participates in the high glucose-induced apoptosis in nucleus pulposus cells.
METHODS: Passage 3 rabbit nucleus pulposus cells were randomized into four groups, and cultured in the normal culture medium (blank control group), culture medium containing 100 mmol/L glucose (high-glucose group), capspase inhibitor Z-ATAD-FMK (inhibitor group) or Z-ATAD-FMK and 100 mmol/L glucose (combination group). After 6 hours of culture, the viability, reactive oxygen species level, and apoptosis rate were examined in nucleus pulposus cells. The protein expression levels of Grp78 and Caspase-12 were assayed.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the blank control group, high glucose increased the nucleus pulposus cell apoptosis, reactive oxygen species accumulation, as well as expression of Grp78 and Caspase-12. Whereas, Z-ATAD-FMK (the inhibitor of Caspase-12) abrogated the cytotoxic effect caused by high glucose. Therefore, endoplasmic reticulum stress-mediated apoptosis is a new signaling pathway of high-glucose induced apoptosis in nucleus pulposus cells. The generation and accumulation of reactive oxygen species is the main contributor of endoplasmic reticulum stress.

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Key words: Apoptosis, Endoplasmic Reticulum, Intervertebral Disk, Diabetes Mellitus, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

李咸周，张存鑫. 内质网凋亡途径参与了高糖诱导髓核细胞凋亡的过程[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(36): 5778-5784.

Li Xianzhou, Zhang Cunxin. Endoplasmic reticulum stress participates in the process of high glucose-induced apoptosis in nucleus pulposus cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(36): 5778-5784.

图/表（结果） 2

2.1 髓核细胞形态学观察原代髓核细胞接种后，经倒置显微镜下观察，可见细胞呈球形，大小不等，有的吸附在培养瓶底，有的悬浮在培养液中。培养七八天后，可见有部分髓核细胞贴壁。贴壁后的髓核细胞呈圆形并且体积变大，伸出伪足后呈三角形、多角形或短梭形。细胞核较大，有时可见双核，核仁明显，胞浆中可见分泌颗粒，细胞折光性好。约2周后，髓核细胞完全贴壁，细胞伸出的伪足相互连接成片，细胞周围可见基质样物质沉淀。培养约3周时，原代髓核细胞汇合可达85%以上，见图1。

2.2 髓核细胞鉴定结果

2.2.1 髓核细胞经甲苯胺蓝染色可见细胞内的聚集蛋白多糖被染成天蓝色，越靠近细胞核，着色越深，见图2A。

2.2.2 苏木精-伊红染色可见髓核细胞呈三角形、多角形或短梭形等不规则形状，胞核位于细胞中央或偏向一侧胞壁，染成蓝色，胞浆染成粉红色，越靠近胞核，胞浆着色越深，见图2B。

2.2.3 细胞免疫组织化学染色可见胞质中Ⅱ型胶原蛋白染成黄褐色，越靠近细胞核着色越深，见图2C。

2.2.4 免疫荧光染色可见Ⅱ型胶原蛋白呈绿色荧光，大部分位于胞质中，且靠近胞核处荧光强度越强，胞核呈蓝色荧光，见图2D。

2.3 ATAD-FMK可使髓核细胞免于高葡萄糖引起的细胞毒害作用 CCK-8检测发现高浓度葡萄糖可显著抑制髓核细胞的增殖活性，使用Z-ATAD-FMK预处理2 h发现，Z-ATAD-FMK可显著拮抗高浓度葡萄糖所致的细胞毒性，见图3A。这种变化趋势同样发现在细胞内总活性氧的检测结果中，见图3B。流式细胞术检测发现，高糖组髓核细胞凋亡率显著增加，Z-ATAD-FMK预处理髓核细胞后，与对照组比较，虽然不能显著降低髓核细胞凋亡率，但与高糖组比较，其差异有显著性意义(P < 0.05) ，见图3C，D。
2.4 高浓度葡萄糖引起的内质网应激参与了髓核细胞的凋亡过程 Western blot技术用来分析Caspase-12和Grp78表达变化，使用β-actin作为内参。灰度分析发现，高浓度葡萄糖可显著增加Caspase-12和Grp78的表达，而Z-ATAD-FMK可抑制高糖引起的Caspase-12和Grp78的表达增加，见图4。

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引言

椎间盘是缓冲震荡、均匀分散脊柱应力、连接椎体及维持脊柱高度的重要结构，同时也是人体最容易发生退变的组织。引起椎间盘退变的因素众多，创伤、机械压力、免疫因素、缺血缺氧、细胞凋亡及炎性递质等均可引起椎间盘过早的退变。最近研究表明，内分泌因素也和椎间盘退变相关^[1]。Teraguchi等^[2]发现，代谢综合征和女性胸椎间盘退变密切相关。研究表明，葡萄糖的扩散、分布及利用对维持椎间盘的正常功能具有重要作用。而人体正常血糖水平维持的失衡，导致了糖尿病的形成。因此，糖尿病也是椎间盘退变的危险因素^[3-6]。糖尿病患者椎间盘中未硫酸化的糖胺聚糖含量远超正常水平，过量的未硫酸化的糖胺聚糖可以减少椎间盘髓核组织中的负电荷，使其维持水分的能力明显降低。最近研究表明，椎间盘的退变归因于髓核细胞的大量丢失及过度凋亡^[7-8]。虽然椎间盘髓核细胞凋亡的具体分子机制尚不十分明确，但高糖所致的氧化应激损伤在其中发挥了重要作用^[9]。

细胞凋亡存在于机体的整个生命过程，参与了各种生理及病理过程。细胞凋亡的增加或者减少是许多疾病的发病基础。现已发现内质网也参与构成细胞凋亡的途径，其主要机制是各种理化因素导致的内质网应激。内质网是细胞内的重要细胞器，在细胞的生命过程中发挥重要作用，其主要功能是参与膜蛋白、分泌蛋白、糖元、脂类、固醇类激素等的合成以及蛋白质的空间折叠、糖基化修饰等过程^[10]。在正常的生理条件下，内质网维持细胞内外蛋白代谢的平衡，当细胞受到各种理化因素刺激时，细胞内的稳态将会被打破，刺激损伤内质网的功能，进而引起内质网应激^[11]。当理化因素强烈、持续存在时，内质网凋亡途径就会激活，进而导致细胞凋亡。

研究发现，内质网凋亡途径参与多种细胞的代谢和凋亡。研究发现，喹酰胺醇可以通过激活内质网途径诱导肾小管上皮细胞凋亡增加^[12]，牛磺脱氧胆酸可以通过抑制内质网应激，阻断内质网凋亡途径，进而发挥保护肾小管细胞的作用^[13]。Ye等^[14]发现在大鼠椎间盘细胞中，自噬作用参与了内质网应激的相关过程，葡萄糖调节蛋白78 (glucoser egulatedp rotein，Grp78)和GADD153蛋白的上调和内质网应激密切相关。研究发现，内质网凋亡途径主要包括3条通路，即：CHOP/GADD153途径、IREI-TRAFZ- ASKI-JNK途径和Caspase-12途径，这3条途径可以单独诱导细胞凋亡，也可以协同诱导细胞凋亡。研究发现，Caspase家族中引起细胞凋亡的主要是Caspase-1、Caspase-3、Caspase-9和Caspase-12，其中Caspase-1和Caspase-3主要分布于细胞质中，Caspase-9主要分布于线粒体中，而Caspase-12主要分布于内质网中。因此，认为Caspase-12的表达意味着内质网凋亡途径的启动。高糖是否可以通过内质网凋亡途径诱导髓核细胞凋亡，以及通过内质网凋亡通路的哪条通路诱导髓核细胞凋亡，目前还不十分明确，此次研究旨在探讨这些问题。

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材料方法

1.1 设计分组对照细胞学实验观察。

1.2 时间及地点实验于2015年9月至2016年3月在青岛大学中心实验室完成。

1.3 材料 8周龄新西兰大白兔4只，体质量1.5-2.0 kg，雌雄不限。许可证号：SCXK(鲁)20120005，由山东青岛康大生物科技有限公司提供。

1.4 实验方法

1.4.1 兔髓核细胞体外分离培养取8周龄新西兰大白兔，麻醉后空气栓塞处死。无菌获取胸腰椎。将取下来的脊椎迅速转移至无菌工作台，刀片切开纤维环，无菌小刮匙刮下凝胶状髓核组织，置于含PBS(1%青-链霉素)溶液中清洗3遍，用无菌刀片将髓核组织切割成1 mm×1 mm× 1 mm的组织碎块，加入体积分数0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，37 ℃水浴锅中消化20 min，加入DMEM/F-12培养液(含体积分数10%FBS)终止消化，1 000 r/min，离心 5 min，弃上清，加入Ⅱ型胶原酶，置于37 ℃水浴锅中消化60 min，待消化液变均一、浑浊后，加入DMEM/F-12培养液(含体积分数10%FBS)终止消化。经过200目不锈钢滤网过滤后，将滤液移入离心管离心(1 000 r/min×5 min)，弃上清后加入适量DMEM/F-12培养液(含体积分数10%FBS、1%青-链霉素)重新混悬。细胞计数板计数，调整细胞浓度为(3-5)×10⁸ L^-1后，接种到25 cm²培养瓶中，每瓶接种5 mL。将接种后的细胞培养瓶置于CO₂培养箱中培养(95%空气，体积分数5%CO₂)。倒置显微镜观察细胞生长状态，接种后第4天首次半量换液，以后每隔三四天全量换液。待细胞汇合85%以后，胰酶消化传代。

1.4.2 髓核细胞鉴定及髓核细胞的形态学观察

(1)髓核细胞苏木精-伊红染色、髓核细胞甲苯胺蓝染色观察细胞的形态，运用细胞免疫组织化学染色检测Ⅱ型胶原蛋白。细胞爬片PBS洗涤3次×2 min。40 g/L多聚甲醛固定20 min，PBS洗涤，然后用0.1%Triton X-100覆盖细胞浸润15 min，PBS洗涤。体积分数3%H₂O₂去离子水，室温孵育5 min，PBS洗涤，Collagen II Antibody(1∶200)，4 ℃冰箱中过夜，PBS洗涤。PV-6002山羊抗小鼠IgG/HRP聚合物，37 ℃孵育20 min，PBS充分淋洗。加入适量的DAB显色工作液显色。镜下观察控制显色时间，当达到显色效果后，自来水轻轻冲洗终止显色，脱水、透明封固后倒置显微镜下观察、拍照。

(2)髓核细胞免疫荧光染色检测Ⅱ型胶原蛋白。细胞爬片PBS洗涤。40 g/L多聚甲醛固定20 min，PBS洗涤，0.1%Triton X-100覆盖细胞浸润15 min，PBS洗涤。5%DSA溶液，室温孵育30min，PBS洗涤。Collagen II Antibody(1∶200)，4 ℃冰箱中过夜，PBS洗涤。FITC标记山羊抗小鼠IgG(H+L)，37 ℃避光孵育30 min后，DAPI室温避光孵育5 min，PBS洗涤。抗荧光淬灭封片剂封固后倒置荧光显微镜下观察、拍照。

1.4.3 实验分组将第3代髓核细胞随机分为：①对照组：正常培养液组；②高糖组：培养基中葡萄糖浓度为 100 mmol/L；③抑制剂组：培养基中含有Caspase-12抑制剂Z-ATAD-FMK；④高糖+抑制剂组：培养基中含有Z-ATAD-FMK及100 mmol/L的葡萄糖。

每组细胞干预时间为6 h，其中高糖+抑制剂组干预方法为：先用含Z-ATAD-FMK的培养基预处理2 h后，再用含有Z-ATAD-FMK及100 mmol/L葡萄糖的培养基干预6 h。

1.4.4 细胞增殖活性检测取第2代指数增长期的髓核细胞，消化收集细胞后，重新混悬后，调整细胞浓度为 1.0×10⁸L^-1，接种到96孔板，每组8孔，每孔接种100 μL。置于二氧化碳培养箱中培养，待细胞汇合80%时，按照实验分组，更换不同的培养基。培养6 h后弃掉原培养基，用不含FBS的DMEM/F-12培养液洗涤2次×2 min，弃掉DMEM/F-12培养液后重新加入不含FBS的DMEM/F-12培养液，每孔100 μL。向每孔加入10 μL的CCK-8 溶液(注意避免产生气泡)，将培养板在培养箱(37 ℃，体积分数5% CO₂)内孵育2 h后，用多功能孔板测读仪测定各组细胞在450 nm处的吸光度A值。

髓核细胞增殖活力(%)=[A(实验组)-A(空白组)]/[A(对照组)-A(空白组)]×100%

A(实验组)：髓核细胞、CCK-8溶液和培养基的孔的A值；A(空白组)：培养基和CCK-8溶液，不含髓核细胞的孔的A值；A(对照组)：髓核细胞、CCK-8溶液的孔的A值。

1.4.5 细胞内总活性氧检测取第3代指数增长期的髓核细胞，随机分为对照组、高糖组、抑制剂组、高糖+抑制剂组和活性氧对照组(正常培养液组)。加入不同培养基干预 6 h后，弃掉原培养基，消化收集细胞。按照1∶1 000用不含血清DMEM/F-12培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为 10 μmol/L。将收集后的细胞悬浮于稀释好的DCFH-DA中，置于CO₂培养箱(37 ℃，体积分数5%CO₂)中培养20 min。每隔5 min摇匀1次，使DCFH-DA和细胞充分接触。用PBS洗涤细胞3次(注意尽量避光)，充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。Rosup(一种混合物，质量浓度为50 g/L) 组使活性氧阳性对照刺激髓核细胞，可以显著提高髓核细胞内活性氧自由基的水平。调整细胞浓度为1.0×10¹¹L^-1后，接种到黑色96孔酶标板中，每组5孔，每孔接种100 μL。调整多功能孔板测读仪激发波长488 nm、发射波长525 nm，检测各组细胞荧光强度。

1.4.6 细胞凋亡率检测取第3代指数增长期的髓核细胞，随机分为对照组、高糖组、抑制剂组和高糖+抑制剂组。弃去培养液，PBS洗涤3次×2 min；加入不含血清的DMEM/F-12培养12 h后，弃掉原培养液；PBS洗涤3次× 2 min，加入不同培养基干预6 h后；弃掉原培养基，消化收集细胞，室温离心1 000 r/min×5 min；4 ℃预冷PBS重悬细胞1次，离心1 000 r/min×5 min，弃掉上清液；加入 300 μL的1×Binding Buffer悬浮细胞；加入5 μL的Annexin V-FITC混匀后，避光室温孵育15 min；上机前5 min加入5 μL的PI染液，补加200 μL的1×Binding Buffer后，流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。每组设3个重复，取平均值。

细胞凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.4.7 Western-blot检测Caspase-12和Grp78蛋白表达各组细胞按不同实验条件处理后提取总蛋白。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)检测各组蛋白样品的浓度。将等量的蛋白样品加样后，调整电泳仪电压至80 V，电泳 30 min，待溴酸蓝刚好越过浓缩胶后，然后调整电压至 120 V，电泳60 min后进行转膜。将转膜槽置于冰块中进行转膜。调整电流至200 mA，转膜90 min。转膜结束后，取出PVDF膜加入按照一定比例稀释的一抗，置于4 ℃冰箱中过夜。清洗一抗后加入按照一定比例稀释的二抗，室温中孵育1.5 h。经Bio-rad 凝胶成像系统显影后采集图像。

1.5 主要观察指标 ①观察髓核细胞形态及Ⅱ型胶原蛋白在细胞内的表达及分布；②各组髓核细胞的增殖活性、活性氧(ROS)积累量、细胞凋亡率、Caspase-12及Grp78表达变化。

1.6 统计学分析实验结果采用SPSS 18.0统计学软件分析，计量资料以x(_)±s表示，两样本均数比较采用t 检验，设P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

该实验成功实现了兔髓核细胞的体外培养，发现高浓度葡萄糖培养基可显著抑制髓核细胞的增殖活性，增加细胞内活性氧自由基的积累以及髓核细胞的凋亡率。高糖诱导髓核细胞凋亡可能是通过内质网Casepac-12凋亡通路，活性氧的过量产生及积累是引起内质网应激的主要因素。

椎间盘内髓核细胞数量减少、功能减退，是引起椎间盘退变，导致脊柱退行性疾病的基础^[15-16]。髓核细胞作为髓核组织中合成和分泌Ⅱ型胶原蛋白、聚集蛋白多糖等成分的唯一细胞，其生存状态与椎间盘功能状态密切相关^[17]。因此研究髓核细胞凋亡的相关分子机制，对预防和治疗脊柱退行性疾病具有重要理论意义。

高浓度葡萄糖培养基可以显著抑制髓核细胞增殖活性，增加细胞的凋亡率及细胞内活性氧自由基的产生及积累，其对髓核细胞的损害作用不仅仅表现在高糖这一种损害因素，还可能与培养基中渗透压的改变有关。Buchmaier等^[18]发现，高渗透压可以通过抑制细胞骨架蛋白的表达来抑制细胞的正常生理功能，进而导致细胞凋亡。培养基中渗透压的改变与葡萄糖的浓度呈正比。因此，该实验研究过程中，葡萄糖不是唯一的干扰因素，培养基渗透压的改变也发挥一定的作用。但是有研究表明，当葡萄糖浓度小于100 mmol/L时，葡萄糖产生渗透压的差异对髓核细胞生长活性的影响差异无统计学意义，所以该研究的干扰因素理论上只有葡萄糖这一种因素。

细胞依靠线粒体的氧化还原反应，消耗葡萄糖，产生大量的ATP，给细胞的各项生命活性提供必需的能量。线粒体在生产ATP等供能物质的同时，也会产生一部分副产品，即活性氧自由基，主要包括超氧阴离子(O₂^-)、羟自由基(OH^-)和过氧化氢(H₂O₂)等。研究表明，这些具有氧化性的物质很容易夺取其他物质上的电子，使失去电子的物质丧失生物活性。比如，活性氧很容易和细胞膜性结构物质结合，夺取膜分子上的电子，破坏细胞膜性结构，使细胞膜的功能丧失。由于细胞膜通透性改变，细胞内外成分改变，Na⁺、K⁺、Ca²⁺等离子浓度梯度改变，引起细胞异常兴奋或极化，或者使胞膜水分子通道蛋白变性，引起细胞水肿^[19]。研究还发现，活性氧可以直接进入细胞核损伤DNA^[20]，产生大量的8-羟基脱氧鸟苷，8-羟基脱氧鸟苷是活性氧自由基如羟自由基、单线态氧等攻击DNA分子中的鸟嘌呤碱基第8位碳原子而产生的一种氧化性加合物，是公认的DNA氧化损伤的特异产物^[21-22]。通过上述机制，活性氧可以显著抑制细胞的增殖活性，乃至引起细胞程序性死亡。很多研究发现，葡萄糖可以通过多种途径诱导细胞内产生大量活性氧自由基。Liu等^[23]发现，葡萄糖可以通过PERK通路促进脊髓星形细胞产生过量的活性氧，同时抑制NF-kB的激活。Liu等^[24]研究发现，高浓度葡萄糖可以通过促使海马神经元细胞产生及积累大量的活性氧，进而损伤海马神经元细胞。该实验发现，在高糖组髓核细胞内活性氧的积累量远远超过了对照组细胞活性氧的积累量。且高糖组髓核细胞的增殖活性显著低于对照组，细胞凋亡率显著高于对照组。由此可以推断，引起上述差异的主要原因是细胞内活性氧水平的差异。因此推断，高浓度葡萄糖通过诱导髓核细胞产生及积累了大量活性氧，过量的活性氧通过直接损伤DNA或者细胞膜性结构等分子机制，抑制髓核细胞增殖活性，诱导髓核细胞凋亡。

Grp78又称免疫球蛋白重链结合蛋白，是内质网上一种特异性的应激蛋白^[25]。在内质网受到各种理化因素刺激时，可大量表达，以维持内质网的稳态，进而保障细胞内多种蛋白、脂质等大分子物质的正确转运及折叠^[26]。研究发现，在内质网受到低氧、低钙、高糖、低糖及酸或碱性刺激时，Grp78可以在早期迅速增加，转移、纠正或者消灭内质网中积聚的错误折叠的蛋白，保证应激条件下细胞内蛋白有序、稳定的合成；另外，Grp78还参与分泌性蛋白的合成及转运，它介导的蛋白构型变化，也参与了细胞信号的转到过程^[27]。因此Grp78对维持内质网稳态以及细胞的正常生理功能至关重要。但是，Grp78的表达与内质网应激的时间及程度呈非线性相关性，在内质网应激早期，Grp78迅速、大量的表达、合成，随着内质网应激的持续及程度的加重，其合成速度及数量却显著减少^[28]。这可能与Grp78的分布位置有关，Grp78锚定在内质网膜上，当刺激强度过大时，内质网应激加重，破坏了内质网的膜性结构，将Grp78释放到胞质当中，使Grp78失去其分子伴侣的作用，从而被灭活。这也构成了内质网应激的恶性循环：即刺激强度越强，内质网应激约严重，其自身的稳态功能损失越多，而其稳态功能的损失反过来又增加了蛋白的错误折叠与积累，进一步增加了内质网应激强度。因此，Grp78可以作为内质网应激的标志蛋白之一^[28]。

内质网凋亡途径是近年来新发现的细胞凋亡途径之一，其核心内容是内质网应激^[29]。研究发现，内质网凋亡途径主要包括3条通路，即：CHOP/GADD153途径、IREI-TRAFZ-ASKI-JNK途径和Caspase-12途径^[30]，这3条途径既可以单独诱导细胞凋亡，也可以协同诱导细胞凋亡。Caspase-12是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶家族成员之一，主要参与真核细胞的凋亡过程，也参与细胞的生长、分化与凋亡调节，主要分布于内质网中^[31-32]。因此，认为Caspase-12是内质网凋亡途径之一，Caspase-12的过表达意味着内质网凋亡途径的启动。

此次实验发现，在高糖组髓核细胞中，Caspase-12和Grp78的表达量均显著增加，而抑制剂组中Caspase-12和Grp78的表达未见明显增加。Grp78表达增加，表明高糖组髓核细胞发生了内质网应激，而Caspase-12表达增加则表明内质网凋亡通路中，Caspase-12通路被激活。由此推断，高浓度葡萄糖可以引起髓核细胞内质网应激，过度的内质网应激又导致了内质网凋亡通路中Caspase-12通路的激活。但是，髓核细胞凋亡是否一定是Caspase-12通路激活所致？是否还存在其他凋亡通路被高糖激活诱导髓核细胞凋亡呢？通过高糖+抑制剂组中各项检测结果显示，Z-ATAD-FMK可以显著抑制Caspase-12基因及蛋白的表达(同高糖组比较 P < 0.05)。同时，Caspase-12表达下降后，髓核细胞凋亡率及细胞内活性氧积累量也显著降低。虽然细胞增殖活性没有显著变化，但可以肯定的是Caspase-12的表达和髓核细胞凋亡密切相关。高糖+抑制剂组中细胞凋亡率较对照组中显著增高，说明抑制Caspase-12的表达后，并不能完全阻止髓核细胞凋亡，由此可以推断，在高糖诱导的髓核细胞凋亡过程中，内质网Caspase-12凋亡通路并不是唯一的凋亡通路，可能还存在其他凋亡通路与Caspase-12共同/协同诱导髓核细胞凋亡。高糖+抑制剂组髓核细胞内活性氧的积累量较高糖组也明显降低(P < 0.05)，其原因可能是内质网凋亡通路被阻断后，细胞内一些抗氧化酶，包括超氧化物歧化酶(SOD)^[33]、过氧化氢酶(CAT)^[34]、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等^[35]，能够正常的转运及合成，在一定程度上消耗了细胞内产生的活性氧。

椎间盘退变是脊柱退行性疾病的病理基础^[36]，可引起多种与之相关的疾病，如腰椎间盘突出症、腰椎管狭窄症、椎间盘源性腰痛等^[37]。影响椎间盘退变的因素众多，其中髓核细胞数量的减少及细胞外基质合成量下降及成分的改变被认为是影响椎间盘退变的主要因素^[38]。因此，研究这些引起椎间盘退变的因素对预防和治疗脊柱退行性疾病具有重大意义^[39]。椎间盘的主要结构包括内部的髓核、周围的纤维环以及髓核上下的软骨终板构成。在髓核组织中，髓核细胞为主要细胞。它的细胞数量及活性，以及细胞外产物的合成对椎间盘功能和结构的维持具有重要意义^[17]。因此研究髓核细胞的生长特性及衰老、凋亡、死亡机制，对研究椎间盘退变，乃至脊柱退行性疾病均具有重要意义。该实验结果显示高浓度葡萄糖培养基可显著抑制髓核细胞的增殖活性，增加细胞内活性氧自由基的积累以及髓核细胞的凋亡率。高糖诱导髓核细胞凋亡可能是通过内质网Casepac-12凋亡通路。活性氧的过量产生及积累是引起内质网应激的主要因素。这些发现或许可以为研究髓核细胞凋亡的分子机制提供一些理论基础。

此外，该研究存在一些不足之处：内质网凋亡途径主要包括CHOP/GADD153途径、IREI-TRAFZ-ASKI-JNK途径和Caspase-12途径3条通路，这3条途径可以单独诱导细胞凋亡，也可以协同诱导细胞凋亡，该研究没有进行逐一验证；高浓度葡萄糖会使细胞培养液的渗透压同时升高，高渗透压同样具有细胞毒害作用，该研究仅仅查找相关文献作为支撑，没有完善相关实验进一步说明此次实验中葡萄糖浓度是否为细胞凋亡的诱导因素之一，这也有待于后续的实验进行完善。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程