YAP蛋白对C6胶质瘤干细胞特性的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0523

摘要/Abstract

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文题释义：
YAP对C6胶质瘤细胞干细胞特性的影响：C6胶质瘤细胞YAP过表达后干细胞标志物表达升高，干细胞克隆球形成能力增强；C6胶质瘤干细胞YAP敲低后干细胞标志物表达下降，干细胞克隆球形成能力减弱。此结果验证了YAP与C6胶质瘤细胞干细胞特性密切相关。
YAP：即Yes相关性蛋白，在胞内起到连接和转录共激活的作用，是Hippo信号通路中的重要分子，Hippo-YAP信号通路是最新发现的可能与肿瘤干细胞相关的重要转导通路，YAP蛋白在干细胞分化和调控器官大小等方面发挥重要功能。此外，YAP蛋白还可以促进与干细胞干性相关蛋白基因的活化，说明其在维持干细胞干性中起到重要作用。

摘要
背景：YAP蛋白能够促进与干细胞特性相关蛋白基因的活化，因此推测YAP在维持C6胶质瘤干细胞特性中发挥重要作用，且暂无此方面研究报道。
目的：探讨YAP蛋白在胶质瘤干细胞干性维持中发挥的作用。
方法：使用无血清培养基培养C6胶质瘤细胞获取C6胶质瘤干细胞，细胞免疫荧光染色检测干细胞标志物CD133和Nestin蛋白表达；Western blot、qRT-PCR和细胞免疫荧光染色观察胶质瘤干细胞和胶质瘤细胞YAP表达差异。进一步使用慢病毒转染将C6胶质瘤细胞YAP蛋白过表达，使用shRNA慢病毒转染将C6胶质瘤干细胞YAP蛋白敲低，Western blot检测CD44、Nanog和Oct-4蛋白表达，干细胞克隆球形成实验鉴定细胞成球能力。
结果与结论：①C6胶质瘤干细胞同时表达CD133和Nestin；②C6胶质瘤干细胞与C6胶质瘤细胞相比，YAP蛋白和mRNA表达升高；③YAP过表达后C6胶质瘤细胞的干细胞标志物CD44、Nanog和Oct-4表达明显上调，肿瘤干细胞克隆球体积明显增大、数量明显增多；④YAP敲低后C6胶质瘤干细胞的干细胞标志物CD44、Nanog和Oct-4表达明显下调，肿瘤干细胞克隆球体积明显减小、数量明显减少；⑤结果表明，C6胶质瘤细胞中存在肿瘤干细胞，YAP蛋白在胶质瘤干细胞中高表达并且与胶质瘤干细胞特性的维持密切相关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID:0000-0002-6532-2268(马一鸣)

关键词: C6胶质瘤, 胶质瘤干细胞, YAP, CD44, Nanog, Oct-4, 肿瘤干细胞, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: YAP protein can promote the activation of stem cell-associated proteins. Therefore, it is speculated that YAP plays an important role in maintaining the stem cell characteristics of C6 glioma cells, but no studies have been reported in this regard.
OBJECTIVE: To explore the function of YAP protein in the maintenance of C6 glioma stemness.
METHODS: C6 glioma cells were cultured in serum-free medium to obtain C6 glioma stem cells, and immunofluorescence staining was used to detect CD133 and Nestin. Western blot, qRT-PCR and immunofluorescence staining were used to observe the differences of YAP expression between glioma stem cells and glioma cells. Lentiviral transfection was further used to transfect C6 glioma cells and glioma stem cells to make the cells overexpress or knock down the YAP protein. The protein levels of YAP, CD44, Nanog and Oct-4 were tested by western blot assay. The stem cell formation ability of tumor cells was determined in the cloning sphere test.
RESULTS AND CONCLUSION: C6 glioma stem cells expressed CD133 and Nestin. The protein and mRNA levels of YAP in C6 glioma stem cells were higher than those in C6 glioma cells. Overexpression of YAP in C6 glioma cells significantly up-regulated the expression of CD44, Nanog and Oct-4, enlarged and increased the tumor spheres of tumor stem cells. Conversely, knockdown of YAP in C6 glioma stem cells obviously decreased the stem cell properties. In conclusion, tumor stem cells exist in C6 glioma cells, and YAP overexpression in the glioma stem cells is highly associated with the maintenance of stem cell properties.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Neoplastic Stem Cells, Glioma, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

马一鸣，夏祥国. YAP蛋白对C6胶质瘤干细胞特性的影响[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(21): 3335-3340.

Ma Yi-ming, Xia Xiang-guo. YAP effect on C6 glioma stem cell properities[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(21): 3335-3340.

图/表（结果） 2

2.1 C6胶质瘤干细胞CD133和Nestin免疫荧光鉴定 C6胶质瘤干细胞球贴壁后使用CD133、Nestin免疫荧光染色，在激光共聚焦显微镜下可见C6胶质瘤干细胞CD133与Nestin强阳性表达，证实培养的肿瘤球是C6胶质瘤干细胞(C6 GSCs)，见图1。

2.2 C6胶质瘤干细胞相对C6胶质瘤细胞YAP表达上调 C6胶质瘤细胞和C6胶质瘤干细胞正常培养，蛋白提取后使用Western blot检测YAP蛋白表达差异，结果发现C6胶质瘤干细胞相对C6胶质瘤细胞YAP蛋白表达明显上调(图2A)，蛋白相对内参灰度值比值差异有显著性意义(P < 0.05，图2B)。提取mRNA使用qRT-PCR检测YAP mRNA表达差异，显示C6胶质瘤干细胞相对C6胶质瘤细胞YAP mRNA表达明显上调(图2C)，差异有显著性意义(P < 0.05)。使用免疫荧光检测YAP蛋白表达及分布差异，发现C6胶质瘤干细胞内YAP表达明显升高，且核内YAP蛋白量增多(图2D)。

2.3 YAP过表达C6胶质瘤细胞的干细胞特性增强 C6胶质瘤细胞正常培养，使用YAP过表达慢病毒构建YAP过表达细胞系，使用Western blot和qRT-PCR检测过表达细胞YAP表达情况，结果显示YAP蛋白(图3A)和YAP mRNA(图3B)均显著过表达，与转染前比较差异有显著性意义(P < 0.05)。检测过表达细胞系干细胞标志物CD44、Nanog和Oct-4表达情况，发现YAP过表达后干细胞标志物均明显上调(图3C)；过表达细胞系进行肿瘤干细胞肿瘤球形成实验，结果显示YAP过表达后干细胞肿瘤球体积增大、数量增多(图3D)，与转染前比较差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.4 YAP敲低C6胶质瘤干细胞的干细胞特性减弱 C6胶质瘤干细胞正常培养，用两种不同位点YAP shRNA慢病毒构建YAP敲低细胞系，采用Western blot和qRT-PCR检测敲低细胞YAP表达情况，结果显示YAP蛋白(图4A)和YAP mRNA(图4B)均显著降低，与转染前比较差异有显著性意义(P < 0.05)。检测干细胞标志物CD44、Nanog和Oct-4蛋白表达情况，发现YAP敲低后干细胞标志物显著下调(图4C)；肿瘤干细胞肿瘤球形成实验结果显示YAP敲低后干细胞肿瘤球体积减小、数量减少(图4D)，与转染前比较差异有显著性意义(P < 0.05)。

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学观察及探究性实验分析。

1.2 时间及地点 实验于2017年1至8月在西南医科大学实验室完成。

1.3 材料 大鼠胶质瘤C6细胞株(中国科学院昆明细胞库)；DMEM培养基、DMEM/F12、B27培养基(美国Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；表皮细胞生长因子和成纤维细胞生长因子(Sigma公司)；YAP过表达慢病毒和YAP shRNA慢病毒(上海吉玛公司)；CD133单克隆抗体和Nestin单克隆抗体(美国Santa Cruz公司)；YAP单克隆抗体和CD44单克隆抗体(CST公司)；Nanog抗体和Oct-4抗体(Abcam公司)；β-actin抗体(万类生物科技有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养 大鼠胶质瘤C6细胞培养于含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液中，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂的培养箱内培养，两三天更换培养液，待细胞生长至贴满培养皿，用0.25%胰酶消化传代。细胞生长至对数生长期，胰酶消化离心并计数，调整细胞密度，按照5×10⁴/孔接种于DMEM/F12无血清培养基(含20 μg/L表皮细胞生长因子，10 μg/L成纤维细胞生长因子，2%B27)，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂的培养箱内培养，5 d后换液，10 d后消化离心并重新接种于DMEM/F12无血清培养基(含20 μg/L表皮细胞生长因子，10 μg/L成纤维细胞生长因子，2%B27)。胶质瘤细胞克隆球传代3次后认为是胶质瘤干细胞^[9-10]。

1.4.2 慢病毒转染 大鼠胶质瘤C6细胞正常培养传代，YAP过表达慢病毒预实验感染确定胶质瘤C6细胞感染复数值。调整细胞密度将细胞接种于6孔板中，转染前用DMEM培养液清洗细胞，使用Complete Mdeium稀释polybrene至终质量浓度50 mg/L，向6孔板中加入5 mg/L的polybrene和相应体积病毒转染细胞48 h，使用2.0-3.0 mg/L嘌呤霉素进行细胞筛选两三周，荧光显微镜下观察荧光蛋白表达，qRT-PCR和Western blot检测YAP mRNA和蛋白表达情况。

第3代C6胶质瘤干细胞接种于96孔板，YAP shRNA慢病毒预实验感染确定感染复数值。细胞转染成功后使用荧光显微镜观察荧光蛋白表达，qRT-PCR和Western blot检测YAP mRNA和蛋白表达情况。

1.4.3 细胞免疫荧光 将胶质瘤细胞克隆球(3代以后)转移至24孔板内多聚赖氨酸处理的细胞爬片上，调整细胞数5.0×10³/孔，待细胞贴壁后取出使用PBS清洗3次，滴加40 g/L多聚甲醛固定15 min，PBS冲洗后加入抗CD133和抗Nestin一抗4 ℃孵育过夜，PBS冲洗后加入荧光二抗常温孵育1 h，封固后置于荧光显微镜下观察拍照。

C6胶质瘤细胞或C6胶质瘤干细胞(第3-6代)用胰酶消化、离心，调整细胞密度按1×10⁴/孔种于多聚赖氨酸处理的细胞爬片上，待细胞贴壁后取出使用PBS清洗3次，滴加40 g/L多聚甲醛固定15 min，PBS冲洗后加入抗YAP一抗4 ℃孵育过夜，PBS冲洗后加入荧光二抗常温孵育1 h，PBS冲洗后加入DAPI常温孵育5 min，封固后置于荧光显微镜下观察拍照。

1.4.4 qRT-PCR检测YAP的mRNA表达 收集C6胶质瘤细胞/C6胶质瘤干细胞(第3-6代)、YAP过表达C6胶质瘤细胞(第3-6代)、敲低YAP的C6胶质瘤干细胞(第3-6代)，使用胰酶消化离心，细胞传代接种于6孔板中，待细胞密度至60%-70%时按照飞捷RNAfast200试剂说明书提取RNA，通过RNA反转录获得cDNA模板，反转录体系参照TaKaRa PrimeScript^TM RT Master Mix试剂说明书。使用TaKaRa SYBR^@PrimixEx Taq^TM Ⅱ反应体系检测YAP的mRNA表达，上游引物序列为：5’-TAG CCC TGC GTA GCC AGT TA-3’，下游引物序列为：5’-TCA TGC TTA GTC CAC TGT CTG T-3’。使用β-actin作为内参，上游引物序列为：5’-CAT GTA CGT TGC TAT CCA GGC-3’，下游引物序列为：5’-CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT-3’。mRNA的表达水平采用2^-^??Ct计算方法进行分析。

1.4.5 Western blot检测相应蛋白表达 收集C6胶质瘤细胞/C6胶质瘤干细胞(第3-6代)、YAP过表达C6胶质瘤细胞(第3-6代)、敲低YAP的C6胶质瘤干细胞(第3-6代)，使用胰酶消化离心，制成细胞悬液并进行细胞计数，以每孔3×10⁵个细胞接种于6孔板，待细胞贴壁后取出并弃去上清，用4 ℃ PBS冲洗3次，加入150 μL细胞裂解液(含PMSF)裂解细胞，刮下细胞裂解物后使用漩涡混匀器混匀30 s，冰上静置10 min，于4 ℃离心机15 000 r/min离心15 min，收集上清总蛋白。留取5 µL上清液进行蛋白定量，其余上清加入6×Loading buffer后在沸水中煮沸5 min变性。取30 μg蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白分离后转膜至PVDF滤膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST封闭1 h；然后加入一抗(β-actin、YAP、CD44、Nanog、Oct-4)于4 ℃摇床过夜，次日TBST洗膜10 min×3次，加入对应二抗室温孵育1 h，再用TBST洗膜3次，使用ECL显影液进行显影，目的蛋白表达量通过与内参蛋白β-actin标准化后得到相对比值。

1.4.6 肿瘤干细胞肿瘤球形成实验 收集对数期C6胶质瘤细胞/C6胶质瘤干细胞(第3-6代)、YAP过表达C6胶质瘤细胞(第3-6代)、敲低YAP的C6胶质瘤干细胞(第3-6代)，消化离心，使用DMEM/F12无血清培养基(含20 μg/L表皮细胞生长因子，10 μg/L成纤维细胞生长因子，2%B27)制成细胞悬液，以每孔4 000个细胞的密度接种于低黏附性24孔板内培养，置于含体积分数为5%CO₂、37 ℃培养箱中培养1周，细胞离心并更换新鲜DMEM/F12无血清培养基(含20 μg/L表皮细胞生长因子，10 μg/L成纤维细胞生长因子，2%B27)继续培养1周，倒置显微镜下观察拍照，并计数肿瘤球个数，进行统计分析。

1.5 主要观察指标 ①免疫荧光检测C6胶质瘤干细胞表面标志物CD133和Nestin表达，确定培养的肿瘤球是C6胶质瘤干细胞；②C6胶质瘤细胞/C6胶质瘤干细胞的YAP表达；③C6胶质瘤细胞过表达YAP后干细胞表型标志物和干细胞克隆球形成能力；④C6胶质瘤干细胞YAP敲低后干细胞表型标志物和干细胞克隆球形成能力。

1.6 统计学分析 应用SPSS 18.0统计软件处理，数据以x(_)±s表示，组间差异采用t 检验，多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

神经胶质瘤根据来源不同主要分为室管膜瘤、少突神经胶质瘤、星形细胞瘤和混合神经胶质瘤，其中星形细胞瘤最常见^[11]。美国健康调查显示，胶质瘤年发病率达5/10 000，每年有18 000例新发病例和13 000例死亡患者，高级别的胶质细胞瘤如胶质母细胞瘤5年生存率小于3%^[12]。

研究发现影响儿童胶质瘤进展的危险因素包括胎儿期接触X射线或者急性淋巴细胞白血病辅助放疗^[13-14]。胶质瘤因生存期短，复发率及死亡率高，成为危害人类健康的重要杀手^[15-16]。胶质瘤高复发率是影响其预后的主要因素，近年来以肿瘤干细胞为研究对象，探寻肿瘤干细胞高复发及其发生发展的分子信号异常，有利于阐明胶质瘤发病机制和耐药原因。胶质瘤干细胞在某些生理学特性上类似于神经干细胞，是神经胶质瘤的起源细胞，具有干细胞表面标志物CD133和Nestin表达阳性的特征^[17]。

Hippo-YAP/TAZ信号通路作为重要的信号传导途径，具有调控组织大小、细胞凋亡，调节干细胞增殖和抑制肿瘤发生发展等重要生物学功能^[18]。Hippo信号通路核心组成包括调控激酶部分和转录部分^[19]：前者主要包括MST1和MST2、LATS1和LATS2、SAV1以及MOB1A和MOB1B；后者主要由YAP和TAZ组成。近年来研究发现Hippo信号通路在哺乳动物早期器官发育阶段，如心、肠或肝等中起到重要作用^[20-23]，而YAP/TAZ是Hippo通路发挥功能的重要转录辅助因子，用于调控下游靶基因的表达。Hippo信号通路与干细胞多潜能性越来越引起大家重视，如在胚胎干细胞发育阶段YAP/TAZ通过激活下游干性相关基因表达维持干细胞特性^[24-25]。此外，Hippo信号通路在维持肿瘤干细胞干性方面的作用越来越被大家所熟知，研究发现YAP是维持乳腺癌干细胞、肺癌干细胞干性的主要调节因子^[26-31]，此外YAP在髓母细胞瘤的肿瘤干细胞中高表达，当敲除YAP后髓母细胞瘤干性显著降低^[32]。Xia等^[33]研究发现YAP在卵巢癌干细胞调节中起到重要作用，在失去干性的卵巢癌干细胞中YAP表达下降。在胶质瘤中YAP对于干细胞干性的影响却缺乏报道。此外，在胶质瘤研究中发现通过将胶质瘤干细胞移植到非肥胖性糖尿病/重症联合免疫缺陷裸鼠中有很好的成瘤作用^[34]，然而影响胶质瘤干细胞特性的机制未知。因此，实验重点探究YAP在胶质瘤干细胞中发挥的作用。

采用添加生长因子的无血清培养基培养胶质瘤干细胞，在此培养基中，胶质瘤干细胞维持其干细胞特性，呈现干细胞样的克隆球生长^[35]。使用细胞免疫荧光检测胶质瘤干细胞CD133和Nestin蛋白表达，发现胶质瘤干细胞同时表达CD133和Nestin，证实克隆球为C6胶质瘤干细胞。为了研究YAP在胶质瘤维持干性中发挥的作用，首先比较胶质瘤干细胞和胶质瘤细胞YAP表达差异，Western blot、qRT-PCR和细胞免疫荧光结果发现胶质瘤干细胞YAP表达明显上调且核内增多，提示YAP很可能是胶质瘤干细胞干性维持的重要调节因子。为了进一步验证实验假设，实验通过使用慢病毒转染将C6胶质瘤细胞YAP蛋白过表达，显示YAP过表达后C6胶质瘤细胞干细胞标志物CD44、Nanog和Oct-4明显上调，肿瘤干细胞肿瘤球体积明显增大、数量明显增多；同时使用shRNA慢病毒转染将C6胶质瘤干细胞YAP敲低，显示YAP敲低后C6胶质瘤干细胞干细胞标志物CD44、Nanog和Oct-4明显下调，肿瘤干细胞肿瘤球体积明显减小、数量明显减少。

综上所述，YAP在胶质瘤干细胞中表达明显上调，且YAP对胶质瘤干细胞干性维持起到重要作用，为胶质瘤靶向治疗提供新靶点，提供新的治疗思路，为深入胶质瘤的整体认识和提高胶质瘤的总体治疗水平起到重要作用。

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