Wnt/β-catenin信号通路与脐带间充质干细胞向肝样细胞的分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0510

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (13): 2011-2019.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0510

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Wnt/β-catenin信号通路与脐带间充质干细胞向肝样细胞的分化

彭琴^1，2，尹燕峰²，管峥²，吕莎²，苏文君²，闪海燕^1，2，张蕾²

¹昆明医科大学，云南省昆明市 650500；²昆明医科大学附属甘美医院/昆明市第一人民医院，云南省昆明市 650011

修回日期:2018-01-07 出版日期:2018-05-08 发布日期:2018-05-08
通讯作者: 张蕾，博士，硕士生导师，研究员，昆明医科大学附属甘美医院/昆明市第一人民医院，云南省昆明市 650011
作者简介:彭琴，女，1989年生，江西省吉水县人，汉族，2017年昆明医科大学毕业，硕士，医师，主要从事干细胞肝向分化机制方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81660303)；云南省科技厅-昆明医科大学联合专项项目

Influence of Wnt/beta-catenin signal transduction pathway on the differentiation of umbilical cord mesenchymal stem cells into hepatocyte-like cells

Peng Qin^{1, 2}, Yin Yan-feng², Guan Zheng², Lv Sha², Su Wen-jun², Shan Hai-yan^{1, 2}, Zhang Lei²

¹Kunming Medical University, Kunming 650500, Yunnan Province, China; ²Af?liated Calmette Hospital of Kunming Medical University (First Hospital of Kunming), Kunming 650011, Yunnan Province, China

Revised:2018-01-07 Online:2018-05-08 Published:2018-05-08
Contact: Zhang Lei, M.D., Master’s supervisor, Researcher, Af?liated Calmette Hospital of Kunming Medical University (First Hospital of Kunming), Kunming 650011, Yunnan Province, China
About author:Peng Qin, Master, Physician, Kunming Medical University, Kunming 650500, Yunnan Province, China; Af?liated Calmette Hospital of Kunming Medical University (First Hospital of Kunming), Kunming 650011, Yunnan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81660303; the Yunnan Province-Kunming Medical University Joint Scientific Projects

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
肝细胞核因子4α(Hepatocyte nuclear factor 4 alpha，HNF4α)：是核激素受体超家族的一种转录因子，包括HNF1、HNF3、HNF4、HNF6和CCAAT/增强子结合蛋白(enhancer-binding protein，C/EBP)家族，在调控肝细胞分化和维持肝脏生物学功能中发挥重要作用。HNF4α通过与肝特异性基因的启动子区结合，促进肝特异性基因的表达，维持肝细胞正常形态结构，增强糖原合成，促进肝细胞发育成熟等。
Wnt/β-catenin信号通路：参与调控干细胞的增殖、分化以及凋亡，控制与细胞分化相关的生物化学过程，参与动物胚胎形成的多种事件包括干细胞增殖以及神经嵴的特定分化。经典Wnt/β-catenin信号通路的传导过程为：Wnt蛋白先与跨膜受体Frizzled结合，然后在低密度脂蛋白受体相关蛋白的辅助下，激活位于胞质中的散乱蛋白(dishevelled，Dvl/Dsh)，使GSK-3β磷酸化并抑制其对胞质内β-catenin的降解，促使胞浆内积聚的β-catenin最终转位进入胞核内，结合LEF-1、TCF等核内转录因子，启动下游靶基因的表达，从而调控细胞增殖分化。

摘要
背景：脐带间充质干细胞可在体内外诱导分化为肝样细胞，然而确切机制目前尚不清楚，研究表明Wnt/β-catenin信号通路与之密切相关。
目的：探讨Wnt/β-catenin信号通路对脐带间充质干细胞肝向分化的影响及其机制。
方法：采用组织块贴壁法分离培养人脐带间充质干细胞，将培养至第4-6代脐带间充质干细胞分成4组，分别为对照组，常规诱导肝向分化组，激活剂Wnt3a组(在常规诱导肝向分化基础上加入20 μg/L Wnt/β-catenin信号通路激活剂Wnt3a)，抑制剂Dkk-1组(在常规诱导肝向分化基础上加入20 μg/L Wnt/β-catenin信号通路抑制剂Dkk-1)。分别在诱导第7，14，21，28天收集细胞，采用荧光定量PCR和Western blot检测肝细胞分化相关基因的mRNA和蛋白表达。运用PAS染色、LDL摄取实验、ICG吸收实验在诱导第28天时进行肝样细胞功能检测。
结果与结论：①与对照组相比，常规诱导组、激活剂Wnt3a组、抑制剂Dkk-1组中除了CK-19 mRNA及蛋白表达均下调外(P < 0.01)，AFP、ALB、HNF4α mRNA和AFP、HNF4α蛋白表达均显著上调(P < 0.05)；②与常规诱导组相比，激活剂Wnt3a组AFP、ALB、HNF4α mRNA及AFP、HNF4α蛋白表达均显著下调(P < 0.05)；③与常规诱导组、激活剂Wnt3a组相比，抑制剂Dkk-1组AFP、ALB、HNF4α mRNA及AFP、HNF4α蛋白表达显著增高(P < 0.05)；④抑制剂Dkk-1组PAS染色、LDL摄取实验、ICG吸收实验中检测到的阳性细胞最多，常规诱导组其次，阳性细胞最少的是激活剂Wnt3a组；⑤以上结果表明，Wnt/β-catenin信号通路受抑制时可促进脐带间充质干细胞肝向分化，反之，则抑制脐带间充质干细胞肝向分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-1285-6773(彭琴)

关键词: 脐带间充质干细胞, 细胞分化, 肝样细胞, Wnt/β-catenin信号通路, 干细胞, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Umbilical cord mesenchymal stem cells can be induced to differentiate into hepatocyte-like cells in vitro and in vivo. However, the exact mechanism is still unknown. Existing studies have shown that the Wnt/β-catenin signaling pathway is closely related to this process.
OBJECTIVE: To explore the effect of Wnt/β-catenin signaling pathway on the differentiation of umbilical cord mesenchymal stem cells into hepatocyte-like cells and its potential molecular mechanism.
METHODS: Human umbilical cord mesenchymal stem cells were extracted from the neonatal umbilical cord by tissue adherent method. After being cultured and purified, the umbilical cord mesenchymal stem cells at passages 4-6 were divided into four groups: control group (DMEM culture group), hepatocyte-like differentiation group, activator Wnt3a group (adding 20 μg/L Wnt3a, an activator of Wnt/β-catenin signaling pathway, under the differentiation condition), and inhibitor Dkk-1 group (adding 20 μg/L Dkk-1, an inhibitor of Wnt/β-catenin signaling pathway, under the differentiation condition). Induced cells were collected respectively on days 7, 14, 21, 28. Their mRNA and protein expressions of α-fetoprotein (AFP), albumin (ALB), hepatocyte nuclear factor 4α (HNF4α) and Cytokeratin-19 (CK-19) in the cells were detected by real-time quantitative PCR and western blot respectively. Meanwhile, Periodic Acid-Schiff staining, low-density lipoprotein uptake test and indocyanine green absorption test were applied to detect the function of hepatocyte-like cells.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, expressions of AFP and HNF4α mRNA and protein as well as ALB mRNA were significantly up-regulated in the hepatocyte-like differentiation group, activator Wnt3a group and inhibitor Dkk-1 group (P < 0.05). Whereas, there was a decrease in the CK-19 expression at mRNA and protein levels (P < 0.01) in these three groups. Compared with the hepatocyte-like differentiation group, the mRNA and protein expressions of AFP and HNF4α, and the mRNA expression of ALB were significantly down-regulated in the activator Wnt3a group (P < 0.05). Compared with hepatocyte-like differentiation group and activator Wnt3a group, the inhibitor Dkk-1 group had higher expression of AFP, HNF4α mRNA and their proteins as well as the mRNA expression of ALB (P < 0.05). Findings from the Periodic Acid-Schiff staining, low-density lipoprotein uptake test and indocyanine green absorption test showed more positive cells in the inhibitor Dkk-1 group than in the hepatocyte-like differentiation group and least positive cells in the activator Wnt3a group. Overall, these findings suggest that the inhibition of Wnt/β-catenin signaling pathway promotes the differentiation of umbilical cord mesenchymal stem cells into hepatocyte-like cells; conversely, the cell differentiation can be inhibited via the Wnt/β-catenin pathway.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Umbilical Cord, Mesenchymal Stem Cells, Cell Differentiation, Hepatocytes, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

彭琴，尹燕峰，管峥，吕莎，苏文君，闪海燕，张蕾. Wnt/β-catenin信号通路与脐带间充质干细胞向肝样细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(13): 2011-2019.

Peng Qin, Yin Yan-feng, Guan Zheng, Lv Sha, Su Wen-jun, Shan Hai-yan, Zhang Lei. Influence of Wnt/beta-catenin signal transduction pathway on the differentiation of umbilical cord mesenchymal stem cells into hepatocyte-like cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(13): 2011-2019.

图/表（结果） 4

2.1 hUC-MSCs分离培养及流式鉴定结果 通过组织块贴壁法分离得到的hUC-MSCs在含有体积分数为10%胎牛血清的完全培养基中培养1周后开始有细胞爬出，经过第1次换液后，可见长梭形、纺锤形成纤维样贴壁生长的细胞(图2A)，培养至80%融合，按1︰3传代(图2B)。传至第4代，大部分细胞呈典型梭形、漩涡状生长，排列规则紧密(图2D)。用流式细胞术检测第4代细胞分子标志CD105、CD90、Oct4、CD45、CD34的表达情况，结果显示细胞阳性表达CD105(99.3±0.57)%、CD90(99.5±0.73)%、Oct4(47.16±1.32)%，不表达造血干细胞特异分子标志CD45(0.00±0.00)%、CD34(0.01±0.03)%，符合脐带间充质干细胞特征(图3A-F)。

2.2 hUC-MSCs体外成脂、成骨分化能力 见图4。hUC- MSCs成脂诱导21 d，细胞由长梭形逐渐变短、变圆，呈不规则形态，细胞内开始出现折光性很强透明的圆形脂肪粒，逐渐增多变大，油红O染色可见橘红色脂滴(图4C)。hUC-MSCs成骨诱导28 d，细胞质内颗粒样物质逐渐增多，细胞呈向心性生长，细胞间可见钙盐沉积，结节中心的细胞相互融合，细胞结构消失，经茜素红染色呈橘红色致密钙结节(图4D)。

2.3 Wnt3a和Dkk-1对hUC-MSCs肝向分化过程中肝细胞特异mRNA表达的影响 常规诱导组、激活剂Wnt-3a组、抑制剂Dkk-1组除CK-19随时间表达下调且表达低于对照组外(F组间、时间、交叉，P值分别为91.134，0.000；183.026，0.000；4.881，0.001)，AFP、ALB、HNF4α mRNA的表达水平整体高于对照组(F组间，P值分别为：48.698，0.000；150.976，0.000；121.262，0.000)，并且随分化时间的延长而上升(F时间，P值分别为：163.047，0.000；367.809，0.000；217.204，0.000)，上升幅度大于对照组(F交叉，P值分别为：29.395，0.000；45.675，0.000；4.778，0.001)。

对照组、常规诱导组、激活剂Wnt3a组和抑制剂Dkk-1组组间差异有显著性意义(P < 0.05)，组内不同时点差异有显著性意义(P < 0.025)，见表2-5。抑制剂Dkk-1组AFP、ALB、HNF4α mRNA的表达高于常规诱导组和激活剂Wnt-3a组，且差异有显著性意义(P < 0.05)。诱导后第21天常规诱导组、激活剂Wnt3a组、抑制剂Dkk-1组AFP mRNA的表达均达到最大值(P < 0.025)，与诱导第7天比，3组差异均有显著性意义(P < 0.025)，21 d后呈下调趋势，但仍高于第7，14天，且抑制剂Dkk-1组在第14，21，28天的表达均高于其他两组，其中第14，28天差异有显著性意义(P < 0.05)，而激活剂Wnt-3a组AFP mRNA的表达在3组中则为最低，尤其在第14，21天两者差异有显著性意义(P < 0.05)。对于ALB、HNF4α mRNA的表达，与第7天相比，3组均随时间延长表达上调，差异均有显著性意义(P < 0.025)，且抑制剂Dkk-1组ALB mRNA在4个时点上的表达均高于其他2组，尤其在诱导第28天，两者差异有显著性意义(P < 0.05)，且在4个时间点上均高于激活剂Wnt3a组，差异均有显著性意义(P < 0.05)，激活剂Wnt3a组表达则低于常规诱导组，诱导第14天，差异有显著性意义(P < 0.05)。抑制剂Dkk-1组HNF4α mRNA的表达在第14，21，28天均高于其他两组，其中除了第21天与常规诱导组差异不显著外，其他两个时间点均高于常规诱导组和激活剂组，差异有显著性意义(P < 0.05)。激活剂Wnt3a组HNF4α mRNA在第7，21，28天的表达低于常规诱导组，且在第7天时差异有显著性意义(P < 0.05)，见图5。
2.4 Wnt3a和Dkk1对hUC-MSCs肝向分化过程中肝细胞相关蛋白表达的影响 见表6-8。常规诱导组、激活剂Wnt-3a组、抑制剂Dkk-1组CK-19蛋白的表达低于对照组，且随时间延长表达下调(F组间、时间、交叉，P值分别为：14895.970，0.000；137.302，0.000；47.898，0.000)，AFP、HNF4α蛋白的表达水平整体高于对照组(F组间，P值分别为：103.047，0.000；826.541，0.000)，并且随分化时间的延长而上升(F时间，P值分别为：89.313；0.000；822.887)，上升幅度大于对照组(F交叉，P值分别为：18.124，0.000；100.785，0.000)。其中，常规诱导组、激活剂Wnt3a组、抑制剂Dkk-1组AFP在诱导第7，14，21，28天的表达均与对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，3组AFP的表达均由第7天开始上调，至21天为最高表达，随后开始下调，AFP表达量、上调幅度依次为Dkk-1组>常规诱导组>Wnt3a组(P < 0.05)，且在4个时间点上，Dkk-1组的表达均高于Wnt3a组(P < 0.05)。而对于HNF4α蛋白则在诱导第7，14天时无论是实验组还是对照组均不表达，在第21天后才开始表达(P < 0.05)，对照组则始终不表达HNF4α蛋白，常规诱导组、激活剂Wnt3a组、抑制剂Dkk-1组在诱导第21-28天呈上调趋势，上调幅度为Dkk-1组>常规诱导组> Wnt3a激活组(P < 0.05)，且不同时间点两两比较差异均有显著性意义(P < 0.05)，见图6，结果与qPCR基本一致。
2.5 诱导后细胞肝样功能检测结果 hUC-MSCs肝向分化诱导第28天进行PAS染色、LDL吞噬实验和ICG吸收实验，结果显示：Dkk-1抑制剂组细胞质中含有大量染成粉红色的糖原聚集(图7A4)，荧光显微镜下也可见到胞质内含有大量红色荧光物质(图7B4)，同时抑制剂Dkk-1组细胞质中也可见到大量绿色物质(图7C4)，说明抑制剂Dkk-1组肝样细胞更早成熟，而激活剂Wnt3a组阳性细胞(图7A3，B3，B3)则少于抑制剂Dkk-1组和常规诱导组(图7A2，B2，B2)，说明激活剂Wnt3a组肝样细胞功能相比正常诱导组细胞要更不成熟。对照组细胞几乎都为阴性(图7A1，B1，C1)。

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引言

人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)可在体外适当条件下向其他功能细胞分化，且来源广泛、免疫原性低、无伦理学争议，成为以干细胞治疗和组织工程为基础进行肝病治疗的理想细胞^[1]。Lee等^[2]首先报道了骨髓间充质干细胞在诱导因子作用下可分化成肝样细胞。随后有学者发现人脐血间充质干细胞在体外诱导培养条件下能够分化成具有功能的肝细胞^[3]。此后研究者还发现hUC-MSCs也可进一步分化成肝细胞^[4-6]。目前，已有一整套特殊的诱导机制保证了hUC-MSCs能转分化为肝细胞^[4^，^7-12]。虽然hUC-MSCs可以在体内外分化为有功能的肝样细胞，但是调控这一过程的确切机制还不很清楚。

研究表明，Wnt/β-catenin信号通路参与调控干细胞的增殖、分化以及凋亡，控制与细胞分化相关的生物化学过程^[13]，参与动物胚胎形成的多种事件包括干细胞增殖以及神经嵴的特定分化^[14]。经典Wnt/β-catenin信号通路的传导过程为：Wnt蛋白先与跨膜受体Frizzled结合，然后在低密度脂蛋白受体相关蛋白的辅助下，激活位于胞质中的散乱蛋白(dishevelled，Dvl/Dsh)，使糖原合成激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)磷酸化并抑制其对胞质内β-catenin的降解，促使胞浆内积聚的β-catenin最终转位进入胞核内，结合淋巴样增强因子(lymphoid enhancer factor-1，LEF-1)、T细胞转录因子(T-cell transcription factor，TCF)等核内转录因子，启动下游靶基因的表达，从而调控细胞增殖分化^[13^，^15](图1)。

实验通过观察Wnt/β-catenin信号通路激活剂Wnt3a与抑制剂Dkk-1对hUC-MSCs诱导分化为肝样细胞的影响，明确Wnt/β-catenin信号通路在细胞因子诱导hUC-MSCs分化中的作用，并进一步阐明其机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年2月至2017年2月在昆明医科大学附属甘美医院中心实验室完成。

1.3 材料 脐带均为健康足月产妇自愿捐献(n=6)，并签署捐献同意书，获伦理委员会批准，排除孕产妇传染病、遗传病以及胎儿先天性疾病。

1.4 方法

1.4.1 hUC-MSCs分离和培养 在无菌条件下收集剖腹产手术获取的新鲜脐带组织，采用组织块贴壁法进行分离培养。先用体积分数为75%乙醇消毒脐带，然后用无菌PBS (GIBCO，14190250)洗涤脐带，并用剪刀剪成3-5 cm小段，PBS洗涤，纵行剖开每段脐带，分离脐带中的血管。预冷PBS洗涤2次以除去红细胞及内皮细胞，留取华通胶组织，并剪成1.0-2.0 mm²的碎块，均匀平铺在6孔板(德国Greiner Bio-one)中，放入培养箱(美国Thermo Scientific公司)中孵育。30 min后，每孔滴加2 mL DMEM培养基(Hyclone，SH30021.01)并放入培养箱继续培养，1周后弃组织块并换液，倒置相差显微镜(日本Nikon公司)观察细胞生长情况，细胞生长至80%-90%融合时，用0.25% Trypsin/ EDTA(GIBCO，1836501)消化传代。

1.4.2 hUC-MSCs流式细胞仪鉴定 选取第4代生长处于对数期的hUC-MSCs，待细胞长至80%-90%融合状态时，经胰酶消化、离心，制成单细胞悬液(细胞浓度为1×10⁹ L^-1)，固定后，分别加入待测细胞标记物抗体CD45-FITC (Invitrogen公司)、CD34-FITC(Invitrogen公司)、CD105-PE (Invitrogen公司)、CD90-PE(美国eBioscience公司)、Oct4- PE(Invitrogen公司)，mouse IgG1 R-PE-conjugated或者mouse IgG1 FITC-conjugated作为对照，避光孵育30 min。经过PBS洗涤后，用流式细胞仪(Cytomics^TM FC500，Beckman Coulter，USA)检测各抗原标志物的表达。

1.4.3 hUC-MSCs体外多向分化能力检测 选取第4代生长状态良好的hUC-MSCs，分别在体外诱导成脂、成骨分化，以评估其多向分化潜能。以每孔8×10⁴细胞均匀接种于6孔板内，待细胞长至80%融合时开始分别添加成脂、成骨诱导液。成脂诱导液组成：DMEM-LG+体积分数为10%胎牛血清+0.5 mmol/L 3-isobutyl-1-methylxanthine(IBMX，MP公司)+0.2 mmol/L吲哚美辛(Sigma-Aldrich)+10 mg/L胰岛素+1 μmol/L地塞米松；成骨诱导液组成：DMEM-LG+体积分数为10%胎牛血清+10 mmol/L β-甘油磷酸钠(Sigma，G9422-10 g)+10^-⁷ mol/L地塞米松磷酸钠+50 μmol/L L-ascorbic acid-2-phosphate(Sigma，AB0021-100 g)+2 mmol/L谷氨酰胺(GBICO)。每3 d换液1次，诱导4周后分别进行油红O(Sigma-Aldrich)和茜素红(Sigma)染色，以检测成脂和成骨分化能力。

1.4.4 hUC-MSCs常规肝向诱导 选择第4-6代生长状态良好的hUC-MSCs，以每孔8×10⁴细胞均匀接种于6孔板中，待细胞长至80%融合时，按照以下流程依次添加肝样细胞分化诱导液。无血清培养液：DMEM-LG+20 μg/L表皮生长因子(R&D公司)+10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子(R&D公司)，培养2 d；分化培养基：DMEM-LG+体积分数为1%胎牛血清+20 μg/L肝细胞生长因子(R&D公司)+ 10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子+0.61 g/L烟酰胺(Sigma- Aldrich)，培养7 d，每3 d换液1次；成熟培养液：DMEM-LG+体积分数为1%胎牛血清+20 μg/L抑瘤素M(R&D公司)+1 μmol/L地塞米松+1×ITS-预混(Invitrogen公司)，诱导至 28 d，每3 d换液1次。

1.4.5 Wnt/β-catenin信号通路对hUC-MSCs体外肝向诱导分化的影响 将分离得到的第4代hUC-MSCs分成4组培养：①对照组：用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液培养hUC-MSCs；②常规肝向分化诱导组：单纯加入肝向诱导分化的细胞因子；③Wnt信号通路激活剂组：加入肝向诱导分化细胞因子及Wnt/β-catenin信号通路激活剂Wnt3a(R&D公司)至终质量浓度为20 μg/L；④Wnt信号通路抑制剂组：加入肝向诱导分化细胞因子及Wnt/β-catenin信号通路抑制剂Dkk-1(R&D公司)至终质量浓度为20 μg/L。每组以每孔8×10⁴细胞接种于6孔板内，待细胞长至70%-80%融合时，按照上述培养液条件培养。通过倒置相差显微镜观察各组细胞形态学变化，分别于7，14，21，28 d收集细胞进行qRT-PCR检测AFP、ALB、HNF4α、CK-19 mRNA的表达水平，Western blot技术检测AFP、HNF4α、CK-19蛋白表达水平。

1.4.6 RT-PCR和qRT-PCR 在诱导第7，14，21，28天分别用0.25%胰蛋白酶消化并收集细胞，试剂盒提取总RNA(Promega公司LS1040)，DNA酶Ⅰ纯化RNA样品。然后利用Primer Premier 5.0设计或者文献查找引物(各引物序列见表1)，用反转录试剂盒合成cDNA(天根公司，KR104)。选用SYBR Slect Master Mix(美国ABI公司，4472908)用于荧光定量PCR(美国ABI公司)检测，取1 μL cDNA模板，加入各引物0.5 μL，采用10 μL的反应体系，同时选择GAPDH基因作为内参，实验条件如下：95 ℃ 10 min，60 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，共循环40次。

1.4.7 Western blot 用裂解液(碧云天生物技术公司，P0013B)分别提取诱导第7，14，21，28天的细胞总蛋白，BCA法(碧云天生物技术公司，P0010)测定蛋白浓度。SDS聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，转移至硝酸纤维膜上。加入用抗体稀释液(含5%脱脂奶粉的TBST)按1︰4 000稀释兔抗人AFP抗体(武汉三鹰公司，14550-1-AP)，1︰2 000稀释兔抗人HNF4α抗体(Abcam，ab92378)，1︰4 000稀释兔抗人CK-19抗体(武汉三鹰公司，10712-1-AP)，1︰4 000稀释兔抗人GAPDH抗体(武汉三鹰，10494-1-AP)，4 ℃孵育附着蛋白的硝酸纤维膜过夜。然后TBST洗3次，每次10 min，再用1︰5 000倍稀释的标记辣根过氧化物酶山羊抗兔IgG(Millipore，AP307P)室温孵育2 h，TBST洗3次，每次10 min。用化学发光剂ECL(碧云天生物技术公司，P0018A)对结果进行显影，定影。

1.4.8 PAS染色 诱导第28天对各组细胞用PAS试剂盒(Sigma，395B-1KT)进行糖原染色。体积分数为95%乙醇固定5 min，高碘酸溶液浸染5 min，蒸馏水洗多次，Schiff试剂浸染15 min，蒸馏水洗5 min，苏木精复染细胞核90 s，蒸馏水洗5 min，自然晾干并高倍镜下观察，拍照。

1.4.9 LDL摄取 诱导第28天检测各组细胞LDL摄取能力，弃分化培养液后，PBS洗涤2遍，将Dil-Ac-LDL(生物医学技术公司，BT-902)加入到不含血清的培养基中至终质量浓度为5 g/L，放入CO₂孵箱中孵育24 h；次日弃去含有染料的培养液，无菌PBS洗涤，40 g/L多聚甲醛固定30 min，荧光显微镜下拍照。

1.4.10 ICG吲哚菁绿吸收 诱导第28天检测各组细胞ICG(Sigma公司，21980-100MG)吲哚菁绿吸收情况。弃培养基后，PBS洗涤2遍，加含ICG 1 g/L的无血清DMEM培养基，并放入CO₂培养箱内孵育1 h，弃培养基，无菌双蒸水洗涤两三遍，高倍镜下观察细胞浆内ICG含量。

1.5 主要观察指标 ①hUC-MSCs形态特征、表面标志物的表达及成脂成骨多向分化能力；②qRT-PCR检测肝细胞标志AFP、ALB、CK-19、HNF4α mRNA的表达；③Western blot检测AFP、CK-19及HNF4α蛋白的表达；④PAS染色、LDL摄取实验及ICG吸收实验检测各组诱导后肝样细胞功能。

1.6 统计学分析 采用SPSS 23.0统计学软件包进行数据处理分析，数据均以x(_)±s表示，采用重复测量方差分析，多个样本均数之间两两比较采用LSD-t 检验和配对t 检验分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

间充质干细胞首次发现于骨髓^[16]，其后在脂肪、脐带、胎盘等多种组织中发现，是一种成体干细胞，具有广泛的可塑性，能在体内外分化为不同类型的细胞。脐带来源的间充质干细胞具有免疫原性低、不存在伦理学问题、体外培养扩增能力强等诸多优点而成为干细胞移植、再生医学和组织工程的理想种子细胞。

目前体外分离hUC-MSCs的方法主要有酶消化法和组织块贴壁法，实验采用组织块贴壁法分离培养hUC-MSCs。对hUC-MSCs纯度和性质鉴定主要从细胞形态及增殖能力、细胞表面标志物表达，多向分化能力等3个方面进行检测，其鉴定标准为^[17]：①在标准培养条件下，间充质干细胞具备对塑料底物的贴壁性；②间充质干细胞群体表达CD105、CD73、CD90等细胞标志物，而不表达造血细胞标志物CD45、CD14、CD34等，部分表达Oct4、Sox2、Nanog等胚胎干细胞特征性分子；③经体外诱导，间充质干细胞能向成骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞分化。作者从人脐带Wharton’s胶中分离培养的细胞，具有成纤维细胞的形态，阳性表达CD105和CD90间充质干细胞分子标志^[18]，不表达CD34、CD45等造血干细胞分子标志，表达Oct4高达47.8%，且能被诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞，符合脐带间充质干细胞的特性。

众多研究表明，间充质干细胞可在适宜条件下向各胚层细胞分化^[19-23]，也可在体内外分化为有功能的肝样细胞^[24]，其分化机制及受影响因素尚不清楚。Wnt/β-catenin信号通路是一条相对保守的信号通路，在胚胎形成过程中决定细胞特定发育命运，调控成体干细胞增殖和分化。当Wnt信号通路被激活后，Wnt配体与Frizzled受体和LRP5/6辅助受体结合，触发一系列信号级联反应导致胞质内非磷酸化的β-catenin聚集，并易位于细胞核内与淋巴细胞增强因子/T细胞因子(lymphoid enhancer factor/T cell factor， LEF/TCL)的N端结合，形成异二聚体激活下游靶基因转录，从而激活Wnt/β-catenin信号通路，调控和决定细胞命运与分化。因此，作者设想，Wnt/β-catenin通路是否也会参与或影响hUC-MSCs肝向分化的过程？为证明这一想法，用Wnt3a激活或Dkk-1抑制Wnt通路后，再诱导hUC-MSCs肝向分化，观察该通路对分化结果和速度的影响。

首先，用肝细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子等细胞因子在体外诱导hUC-MSCs肝向分化，qRT-PCR和Western blot结果均显示，诱导后除CK-19 mRNA和蛋白下调外(P < 0.01)，AFP、ALB、HNF4α mRNA及AFP、HNF4α蛋白均表达上调，与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05)。随着分化时间延长，ALB、HNF4α的表达呈上调趋势(P < 0.05)，而AFP则先上调到21 d最高表达，随后再逐渐下调，说明诱导早期不成熟的肝样细胞高表达AFP，在肝样细胞逐渐成熟的过程中AFP表达逐渐减少，因此在诱导后期高表达ALB、HNF4α，低表达CK-19，说明该诱导方法能够将hUC-MSC诱导分化成肝样细胞。

然后，采用qRT-PCR和Western blot方法检测Wnt3a激活和Dkk-1抑制同时肝向诱导的hUC-MSCs，结果显示用Wnt3a激活hUC-MSCs后AFP、HNF4α、ALB mRNA和AFP、HNF4α蛋白的表达均低于常规诱导组，差异有显著性意义(P < 0.05)，这说明Wnt/β-catenin信号通路的上调或激活将会抑制肝样细胞分化的进程，尤其在诱导后期更明显。有研究表明，在胚胎干细胞中过表达Wnt1从而激活Wnt/β-catenin信号通路下游基因，包括cyclins和c-myc，将会抑制神经的发育^[25-26]。因而，作者推测在组织分化过程中，Wnt/β-catenin信号通路的主要作用可能是保持细胞的干性，阻止它们进一步分化。作者的研究结果与上述结果相吻合，激活Wnt/β-catenin信号通路可抑制hUC-MSCs肝样分化^[27-28]。

Dkk-1通过竞争性结合LRP5/6，从而减少LRP5/6与Wnt配体的结合^[29-30]，导致胞质内β-catenin被泛素化而降解，从而减少β-catenin进入核内激活下游靶基因的转录，抑制了Wnt/β-catenin通路。因此，采用Dkk-1竞争性抑制Wnt/β-catenin信号通路后，对hUC-MSCs进行肝向诱导，结果显示，抑制该通路后，细胞AFP、HNF4α、ALB的表达上调，说明下调或抑制Wnt/β-catenin信号通路可促进hUC-MSCs向肝样细胞分化、成熟。以上激活和抑制Wnt/β- catenin信号通路对hUC-MSCs肝向分化的影响，可以归纳为激活Wnt/β-catenin信号通路利于维持细胞的干性，而抑制该通路会促进细胞更多的向功能细胞分化。

根据实验结果，可以推测Wnt/β-catenin信号通路将会影响hUC-MSCs肝样细胞分化过程，阻断Wnt信号通路可能促进hUC-MSCs肝向分化，反之，则抑制hUC-MSCs肝向分化。然而这一过程到底是通过什么机制影响肝样细胞分化还有待于进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Wnt/β-catenin信号通路与脐带间充质干细胞向肝样细胞的分化

Influence of Wnt/beta-catenin signal transduction pathway on the differentiation of umbilical cord mesenchymal stem cells into hepatocyte-like cells

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