小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化中的核受体Rev-erbα及Rorα

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0484

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (17): 2625-2630.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0484

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小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化中的核受体Rev-erbα及Rorα

林富伟¹，徐晓梅¹，崔琰²，谢乙加¹，赵青³

¹西南医科大学附属口腔医院正畸科，口颌面修复重建与再生实验室，四川省泸州市 646000；²西南医科大学公共卫生学院，四川省泸州市 646000；³口腔疾病研究国家重点实验室，国家口腔疾病临床研究中心，四川大学华西口腔医院正畸科，四川省成都市 610041

修回日期:2017-12-07 出版日期:2018-06-18 发布日期:2018-06-18
通讯作者: 赵青，博士，副教授，口腔疾病研究国家重点实验室，国家口腔疾病临床研究中心，四川大学华西口腔医院正畸科，四川省成都市 610041
作者简介:林富伟，男，1988年生，四川省泸州市人，汉族，2014年四川大学华西口腔医学院毕业，硕士，医师，主要从事错牙合畸形的矫治及相关机制研究。
基金资助:
泸州市科技局基金资助计划(2015-S-50(2/3))；西南医科大学青年基金(2014QN-052)；西南医科大学附属口腔医院院级课题(201402)

Roles of Rev-erb alphya and Ror alpha in osteoblastogenesis of mouse bone marrow mesenchymal stem cells

Lin Fu-wei¹, Xu Xiao-mei¹, Cui Yan², Xie Yi-jia¹, Zhao Qing³

¹Orofacial Reconstruction and Regeneration Laboratory, Department of Orthodontics, the Affiliated Stomatological Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China;²School of Public Health, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China;³State Key Laboratory of Oral Diseases, National Clinical Research Center for Oral Diseases, Department of Orthodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China

Revised:2017-12-07 Online:2018-06-18 Published:2018-06-18
Contact: Zhao Qing, M.D., Associate professor, State Key Laboratory of Oral Diseases, National Clinical Research Center for Oral Diseases, Department of Orthodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China
About author:Lin Fu-wei, Master, Physician, Orofacial Reconstruction and Regeneration Laboratory, Department of Orthodontics, the Affiliated Stomatological Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
Supported by:
the Fund of Luzhou Municipal Department of Science and Technology, No. 2015-S-50(2/3); the Youth Foundation of Southwest Medical University, No. 2014QN-052, the Funded Project by the Affiliated Stomatological Hospital of Southwest Medical University, No. 201402

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
Rev-erbα：又名Nr1D1，是孤儿核受体超家族中的一员，Rev-erbα基因位于人类第17号染色体上。Rev-erbα在人体多种组织中表达，且在脂肪、骨骼肌、心脏、肝脏和大脑组织中高表达。现已证实，Rev-erbα是重要的近日钟基因，在近日钟调节反馈环路中有重要作用。Rev-erbα还参与了脂肪细胞的分化，并与代谢障碍、炎症、心血管等系统疾病的发病等有关。
Rorα：是维甲酸相关孤儿核受体超家族的一员，Rorα基因位于人类第15号染色体上。Rorα在机体各个组织中广泛分布，能够直接进入细胞核调控靶基因的转录，参与多种重要生理功能的调节，在形态发育、细胞增殖分化方面起着重要作用。

摘要
背景：孤儿核受体Rev-erbα及Rorα已经被广泛证实与糖代谢、脂肪代谢等密切相关，但与骨代谢的关系尚不明确。
目的：探讨孤儿核受体Rev-erbα及Rorα在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的作用。
方法：采用全骨髓贴壁法分离培养C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞，进行形态学观察和成脂、成骨诱导分化，采用油红O染色，茜素红染色对其分化能力进行鉴定。在骨髓间充质干细胞成骨诱导分化第0，7，14天，采用Real Time PCR及Western Blot分别检测孤儿核受体Rev-erbα及Rorα的mRNA及蛋白表达变化。
结果与结论：①骨髓间充质干细胞形态以梭形为主，呈典型的漩涡样生长。油红O染色及茜素红染色呈阳性；②在成骨诱导的第0，7，14天，Rev-erbα的mRNA及蛋白表达均呈下降趋势，而Rorα的mRNA及蛋白表达均呈上升趋势，提示Rev-erbα及Rorα在骨髓间充质干细胞成骨诱导过程中可能发挥了一定的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-5227-1476(林富伟)

关键词: 干细胞, 骨髓间充质干细胞, 成骨分化, 核受体, Rev-erbα, Rorα

Abstract:

BACKGROUND: The orphan nuclear receptors Rev-erbα and Rorα play important roles in lipid metabolism and glucose metabolism. But it is unclear whether they are involved in bone metabolism.
OBJECTIVE: To observe the expression of Rev-erbα and Rorα during the osteoblastogenesis process of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs).
METHODS: BMSCs were isolated and purified from C57BL/6 mice by the whole bone marrow adherence method followed by morphology observations and then BMSCs were induced to differentiate into osteoblasts and adipocytes. We detected their differentiation abilities using oil red O staining and alizarin red staining, respectively. Real-time PCR and western blot assay were conducted to detect the mRNA and protein levels of Rev-erbα and Rorα in BMSCs cultured in the osteogenic medium for 0, 7, 14 days.
RESULTS AND CONCLUSION: BMSCs from C57BL/6 mice were mainly spindle-shaped and exhibited the swirl-like pattern of growth. Following induction, oil red O staining and alizarin red staining produced a positive reaction in these cells. Rev-erbα expression at both gene and protein levels decreased at 0, 7, 14 days after osteogenic induction, while Rorα expression increased at both gene and protein levels. These findings indicate that Rev-erbα and Rorα may participate in the osteoblastogenesis of BMSCs.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Orphan Nuclear Receptors, Cell Differentiation, Osteoblasts, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

林富伟，徐晓梅，崔琰，谢乙加，赵青. 小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化中的核受体Rev-erbα及Rorα[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(17): 2625-2630.

Lin Fu-wei, Xu Xiao-mei, Cui Yan, Xie Yi-jia, Zhao Qing. Roles of Rev-erb alphya and Ror alpha in osteoblastogenesis of mouse bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(17): 2625-2630.

图/表（结果） 1

2.1 骨髓间充质干细胞形态 骨髓细胞刚接种时，悬浮于培养基中呈高亮圆形，大小不一，细胞核不能辨认。24 h后大部分细胞贴壁，形态不一，以小圆形为主，部分细胞贴壁伸展，呈泪滴状。4 d左右培养瓶细胞贴附面可见形态相对均一的折光性较强纺锤形细胞，部分贴壁细胞呈克隆样生长。7 d左右细胞呈现多种形态，细胞呈漩涡状排列，克隆交界处出现重叠、融合，细胞融合达80%。传代接种的骨髓间充质干细胞在24-72 h快速增殖，为细胞增殖高峰期，细胞逐渐呈漩涡状、网状或辐射状排列，胞浆丰富，核大，呈椭圆形，5 d左右即可达到80%融合。传代后的细胞体积均较前变大，形态上更加趋于一致，增殖快，胞核明显，呈放射状向周边生长，即典型的漩涡样生长，见图1。

2.2 骨髓间充质干细胞成骨诱导及茜素红染色鉴定结果 经成骨诱导液持续培养后，细胞呈复层生长，由梭形变为立方形，细胞体积增大。细胞外基质分泌增多，部分细胞重叠生长。21 d后茜素红染色可见大量红色矿化结节(图2A)。

2.3 骨髓间充质干细胞成脂诱导及油红O染色鉴定结果 经成脂诱导液培养至第7天左右，细胞形态由梭形变为圆形，体积增大，细胞胞浆内含有大量脂滴。至14 d时大量的间充质干细胞转变为脂肪细胞。油红O染色可见胞浆内有较多橙红色折光性强的脂滴(图2B)。

2.4 骨髓间充质干细胞成骨诱导后Rev-erbα及Rorα表达的变化 在骨髓间充质干细胞成骨诱导的第0，7，14天分别行Real Time PCR检测Rev-erbα及Rorα基因mRNA水平，Western Blot检测Rev-erbα及Rorα蛋白表达水平。

PCR结果显示：Rev-erbα基因mRNA水平呈下降趋势，见图3A。Rorα基因mRNA表达水平呈上升趋势，见图3B。

Western Blot结果显示：Rev-erbα蛋白表达呈下降趋势，见图3C。而Rorα蛋白表达呈上升趋势，见图3D。

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引言

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一种多能干细胞，具有多向分化潜能、自我更新及高度增殖能力。作为成骨细胞的主要来源，骨髓间充质干细胞同时具有成软骨、成骨、成脂等多向分化潜能^[1]。骨髓间充质干细胞成骨分化能力降低是导致骨质疏松、骨量下降的重要原因^[2-6]。而骨密度降低或牙槽骨骨量减少是降低成人正畸治疗目标和限制中老年患者进行正畸治疗的一个重要影响因素。骨代谢和改建速度下降直接导致成人患者牙槽骨丧失和正畸治疗周期的延长。有研究显示当骨吸收大于骨形成时，机体便会出现骨量的减少。骨髓间充质干细胞成骨分化能力的下降将直接导致机体成骨能力的下降，骨形成减少。因此，研究骨髓间充质干细胞成骨分化过程，对预防骨质疏松等疾病的发生具有重要意义，同时也可以为成人正畸患者提供更好的治疗，是目前值得口腔正畸医生及科研人员探索的一个课题。

核受体是一类在生物体内分布广泛、成员众多的转录因子，核受体通过与其相应的配体相互作用，调控众多靶基因的表达，从而在骨改建中发挥着重要作用。如类固醇激素通过与其相应的核受体结合可以影响成骨相关标志物Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶等的合成^[7-8]。研究报道雌激素核受体等位基因突变将导致骨质疏松的发生^[9]。有研究发现Rorα基因敲除小鼠骨量及骨密度均显著降低，进一步证实核受体在骨代谢中的重要作用^[10-11]。孤儿核受体Rev-erbα和Rorα可竞争性地与Bmal1基因启动子序列的反应元件RORE/RevRE相结合，从而调节近日钟基因核心成分Bmal1的表达^[12-13]。大量的研究证实Bmal1基因敲除小鼠出现骨组织减少、骨量下降等现象^[14-16]。但作者在前期研究中发现单独过表达Bmal1基因并不能使成骨作用增强^[17]。由此推测Rev-erbα及Rorα可能参与了骨髓间充质干细胞的成骨分化过程。本实验主要探讨孤儿核受体Rev-erbα及Rorα在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞对照观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2013年1月至2016年10月在四川大学华西口腔医院国家重点实验室及西南医科大学口颌面修复重建与再生实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 4周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠10只，体质量(20±5) g，由西南医科大学动物实验中心提供，合格证号：SYXK(川)2013-065。

1.3.2 实验用主要试剂及仪器 α-MEM、胎牛血清(美国Hyclone公司)；β-磷酸甘油酸钠、地塞米松(美国Gibco公司)；吲哚美辛、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素、维生素C(美国Sigma公司)；油红O、茜素红(中山金桥生物技术公司)；转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒(日本TAKARA公司)；Rev-erbα和Rorα单克隆抗体(美国Abcom公司)；冷冻离心机(德国EPPENDORF公司)；倒置相差显微镜(日本OLYMPUS 公司)；PCR仪、SDS-PAGE及Western blot相关仪器(Bio-Rad公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞的分离培养 将C57BL/6小鼠断颈脱臼处死，置于体积分数为75%乙醇中浸泡5 min，在经紫外线照射消毒的超净工作台内，分离出股骨和胫骨，放入盛有双抗(100 mg/L链霉素、100 U/mL青霉素)的培养皿中浸泡两三分钟。无菌条件下剪开干骺端暴露骨髓腔。用5 mL无菌注射器，抽吸5 mL含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养基，反复冲洗骨髓腔，制成细胞悬液。置于37 ℃、体积分数为5%CO₂、饱和湿度的培养箱内常规培养。4 h后全量更换培养基，去除未贴壁细胞。第3天，PBS清洗细胞2次，全量换液，以后每3 d换液1次。相差显微镜下观察细胞融合度达70%-80%时，传代培养，以此为第1代骨髓间充质干细胞，待细胞长满至培养瓶底90%左右时，可再次传代培养。传代培养具体方法如下：弃去原代培养液，PBS清洗3次，去除死细胞，然后用0.25%胰蛋白酶消化。37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱内消化5-10 min，倒置显微镜下观察，当细胞突起回缩，形态由梭形或三角形变为圆形，脱壁，立即加入2倍含血清的培养基终止消化。巴氏吸管轻轻吹打瓶底，制成细胞悬液后将其移入离心管，1 000 r/min离心8 min，倒掉培养基。重新加入新鲜培养基，等量移入2个25 cm²的培养瓶，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱内继续培养，进行传代扩增纯化。

1.4.2 骨髓间充质干细胞成骨诱导及茜素红染色鉴定 取体外培养的第3代骨髓间充质干细胞制成细胞悬液，调整细胞密度至3×10³/cm²接种于6孔板，以含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养基培养。24 h后更换为成骨诱导培养液(α-MEM完全培养基+10 mmol/L β-甘油磷酸钠+50 mg/L维生素C+10^-7 mol/L地塞米松)，每2 d换液1次。成骨诱导3周后，吸弃培养液，PBS清洗2次，体积分数为95%乙醇固定30 min，PBS清洗3次，加入0.1%茜素红(Alizarin Red-S)室温染色30 min，双蒸水清洗数次，倒置显微镜下观察。
1.4.3 骨髓间充质干细胞成脂诱导及油红O染色鉴定 取体外培养的第3代骨髓间充质干细胞制成细胞悬液，调整细胞密度至5×10³/cm²接种于6孔板，以含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养。24 h后更换为成脂诱导培养液(α-MEM完全培养基+5 μg/L胰岛素+1 μmol/L地塞米松+ 100 mmol/L吲哚美辛)，每2 d换液1次。成脂诱导2周后，吸弃培养液，PBS洗涤2次，体积分数为10%中性甲醛固定30 min，体积分数为70%乙醇漂洗1次，1%油红O室温染色15 min，体积分数为70%乙醇清洗1次，双蒸水清洗数次，倒置显微镜下观察。

1.4.4 骨髓间充质干细胞成骨诱导后检测Rev-erbα及Rorα mRNA表达 第3代骨髓间充质干细胞成骨诱导第0，7，14天，采用Real Time PCR检测Rev-erbα及Rorα mRNA的表达。每孔加入500 μL Trizol，按Invitrogen说明书方法提取总RNA后加入20 μL无RNase水溶解成RNA溶液，在紫外分光光度计上以吸光度检测RNA浓度与纯度，A_260/A₂₈₀> 1.8，说明RNA较纯。提取的总RNA可冻存于-80 ℃或反转录为cDNA进入后续的Real Time PCR实验。

1.4.5 骨髓间充质干细胞成骨诱导后检测Rev-erbα及Rorα蛋白表达 第3代骨髓间充质干细胞成骨诱导第0，7，14天，Western Blot检测Rev-erbα及Rorα的蛋白表达，采用全蛋白提取试剂盒提取贴壁细胞全蛋白溶液，留3 μL用灭菌蒸馏水ddH₂O稀释10倍后用BCA试剂盒测定蛋白含量，其余总蛋白加入适当体积的5×SDS-PAGE变性蛋白上样缓冲液中，于100 ℃水中煮沸3 min，冻存于-20 ℃备用。SDS-PAGE聚丙烯酸凝胶电泳采用5%的浓缩胶及8%的分离胶。用半干转膜仪转膜30 min或60 min于硝酸纤维膜上，5%脱脂牛奶37 ℃封闭1 h后加入一抗4 ℃过夜(一抗浓度为Rev-erbα—1︰200；GAPDH—1︰2 000)，TBS洗涤后加入1︰5 000的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗37 ℃孵育 1 h，TBS洗涤后采用Thermo的AB曝光液曝光。

1.5 主要观察指标 ①骨髓间充质干细胞形态；②骨髓间充质干细胞成骨分化及成脂分化诱导鉴定结果；③骨髓间充质干细胞成骨诱导过程中Rev-erbα及Rorα表达的变化。

1.6 统计学分析 采用SPSS 17.0对相关数据进行方差分析，进一步采用SNK法进行两两比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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间充质干细胞是一种来源于中胚层的成体干细胞。自20世纪70年代 Friedenstein等^[18]利用骨髓间充质干细胞体外培养的贴附性，将其从骨髓细胞中分离出来，并证明其具有成骨、成软骨、成脂潜能，之后越来越多的研究证明其具有分化程度低，体外易扩增、富集，多向分化潜能，免疫原性低等优点^[19-24]。为更好的研究间充质干细胞的生物学性能和将间充质干细胞进一步应用于治疗人类疾病，大量哺乳动物来源间充质干细胞被分离培养^[25-26]。C57小鼠的基因与人的基因同源性较高，达90%以上，同时易于获取，是研究人类正常生理、疾病病理机制及相关治疗的理想动物模型。

间充质干细胞分布于全身各结缔组织中，其中尤以骨髓中含量最高。尽管如此，骨髓中间充质干细胞含量仍较少，每10⁵-10⁶个单核细胞中含一两个间充质干细胞^[²⁷^]。实验选择以C57BL/6J小鼠为实验对象，应用全骨髓贴壁法，获得了活性较好的骨髓间充质干细胞。全骨髓贴壁法根据细胞不同的贴壁时间以及是否贴壁的性能，通过控制首次换液时间，后续的反复换液和传代清除杂细胞，从而获得相对较纯的间充质干细胞。分离纯化的骨髓间充质干细胞形态特异性较高，呈长梭形、纺锤形，漩涡状生长，与Colter等^[2⁸^-3¹^]对骨髓间充质干细胞形态的描述相似。经成骨、成脂诱导后能分化为成骨细胞、成脂细胞，具有多向分化潜能。

众所周知，核受体在骨代谢中扮演着重要角色。越来越多的证据显示孤儿核受体Rev-erbα及Rorα在机体代谢过程如脂肪代谢、糖代谢中发挥着重要作用^[32-34]。而Rev-erbα及Rorα是否与骨代谢有关目前报道较少。研究表明，Bmal1基因敲除小鼠出现骨组织减少，骨量下降的现象^[14-15]。而作者在前期研究中通过慢病毒载体单独过表达Bmal1基因并不能使成骨作用增强^[17]。作为重要的近日节律基因之一，Rev-erbα和Rorα可竞争性地与Bmal1基因启动子序列的反应元件RORE/RevRE相结合，从而调节近日钟基因核心成分Bmal1的表达^[12-13]。作者认为单独过表达Bmal1基因并不能使成骨作用增强可能是由于Rev-erbα及Rorα参与成骨过程。为了验证Rev-erbα及Rorα是否与骨髓间充质干细胞成骨分化相关，在成骨诱导不同时间点检测了Rev-erbα及Rorα表达的变化。研究结果显示无论基因水平还是蛋白水平，Rev-erbα在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中表达均呈下降趋势，提示核受体Rev-erbα可能在骨代谢过程中发挥着重要作用，并且Rev-erbα在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中可能为负性调控作用。而Rorα在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中表达呈上升趋势，提示核受体Rorα可能在骨代谢过程中发挥着正性调控作用，但它们在成骨分化过程中的具体调节机制尚有待进一步的研究。Rev-erbα、Rorα及Bmal1三者共同作用可能在成骨过程中发挥重要作用。Rev-erbα、Rorα基因敲除或者过表达是否会影响骨髓间充质干细胞成骨分化能力尚未见相关报道，这也是下一步需要继续深入研究的问题。另一方面，经典Wnt通路与成骨分化的关系也是研究较多的一个方面^[35-41]。有研究证实Wnt3a会导致骨髓间充质干细胞成骨分化中骨基质矿化减少及碱性磷酸酶活性下降，从而抑制成骨作用^[42]。而经典Wnt通路通过增加Runx2的表达促进成骨^[43]。作者前期研究显示Bmal1基因过表达将导致经典Wnt通路核心成分β-catenin基因表达增加，而Rev-erbα及Rorα表达的改变是否引起经典Wnt通路的改变有待下一步的研究证实。

综上所述，实验通过全骨髓贴壁法获得了活性较好的小鼠骨髓间充质干细胞，可用于后续的体外实验研究。骨髓间充质干细胞成骨诱导分化过程中Rev-erbα及Rorα的表达变化提示其成骨过程中可能具有重要作用，该研究结果为深入研究成骨作用提供了新的切入点，为寻找骨代谢失衡相关疾病的发病机制提供了新的线索。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化中的核受体Rev-erbα及Rorα

Roles of Rev-erb alphya and Ror alpha in osteoblastogenesis of mouse bone marrow mesenchymal stem cells

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