脂肪干细胞-脱钙骨的玻璃化冻存及复苏

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0464

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (9): 1357-1363.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0464

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脂肪干细胞-脱钙骨的玻璃化冻存及复苏

刘磊¹，庸奇²，李娜¹，杨朵¹，张国英¹，崔磊¹

¹首都医科大学附属北京世纪坛医院，北京市 100038；²新乡医学院第三附属医院整形外科，河南省新乡市 453000

修回日期:2018-02-10 出版日期:2018-03-28 发布日期:2018-03-28
通讯作者: 崔磊，博士，主任医师，教授，首都医科大学附属北京世纪坛医院，北京市 100038
作者简介:刘磊，男，1989年生，河南省正阳县人，汉族，首都医科大学在读硕士，主要从事组织工程骨玻璃化冻存的基础研究。
基金资助:
北京市医院管理局临床医学发展专项“杨帆计划”(XMLX2 01611)

Vitreous cryopreservation and thawing of adipose-derived stem cells/demineralized bone matri

Liu Lei¹, Yong Qi², Li Na¹, Yang Duo¹, Zhang Guo-ying¹, Cui Lei¹

¹Beijing Shijitan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100038, China; ²Department of Plastic Surgery, Third Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University, Xinxiang 453000, Henan Province, China

Revised:2018-02-10 Online:2018-03-28 Published:2018-03-28
Contact: Cui Lei, M.D., Chief physician, Professor, Beijing Shijitan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100038, China
About author:Liu Lei, Master candidate, Beijing Shijitan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100038, China
Supported by:
the Special Fund for the Clinical Medicine Development in Beijing Municipal Administration of Hospitals, No. XMLX2 01611

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
抗冷冻保护剂：根据能否渗透到细胞内，可将其分为渗透性和非渗透性两种。渗透性保护剂多属于低分子中性物质，在溶液中易结合水分子发生水合作用，使溶液的黏性增加，从而弱化了水的结晶过程，达到保护的目的。非渗透性保护剂一般是大分子物质，能溶于水，但不能进入细胞，它使溶液呈过冷状态，即可以在特定温度下降低溶质的浓度，通过改变渗透压引起细胞脱水，从而起到保护作用。
玻璃化冻存：通过特殊的冷冻保护剂，液氮快速冷冻达到一种类似玻璃的非晶体状态。这种非晶体的玻璃化状态是由液体的极度黏稠形成，避免冰晶形成，阻止冰晶刺破细胞膜和细胞器，保证了细胞结构和功能的完整性。玻璃化冻存已经应用到组织工程组织的冻存包括组织工程骨、组织工程胰腺、组织工程软骨，是一种理想的冻存组织的方法。

摘要
背景：前期研究应用玻璃化冻存脂肪干细胞-脱钙骨支架复合物1周，得到玻璃化冻存液合适的配比成分。延长玻璃化冻存时间至12周，是否仍能保持细胞活力以及成骨能力值得进一步研究。
目的：探讨短时(1周)、长时(12周)玻璃化冻存对组织工程骨中脂肪干细胞增殖活性和成骨能力的影响。
方法：分离新西兰大白兔脂肪干细胞，扩增至第3代，接种于猪松质骨来源的脱钙骨，成骨诱导1周。将构建的组织工程骨，转移至含有玻璃化冻存液(30%二甲基亚砜，70%LG-DMEM，0.8 mol/L海藻糖)的2 mL冻存管中，将冻存管投入液氮冻存。分别于冻存后1周和12周，复苏1，3，7，11，13 d，用活死双染试剂染色，共聚焦显微镜观察脂肪干细胞在脱钙骨上的生长情况。复苏1，3，5，7，9，11，13 d，用Hochest33258法检测支架材料上的细胞数目。复苏1，4，7，10，14，21 d，用PNP微板法检测碱性磷酸酶活力，Real-time PCR检测成骨基因Runx2，OCN，COL-1，ALP的表达。
结果与结论：①细胞活死双染结果显示，冻存1周或12周后，复苏1 d时红染的死细胞较冻存前红染的死细胞多，复苏3 d后绿染的活细胞逐渐增多；②Hochest33258结果表明，与冻存前的细胞数相比，冻存1周或者12周后，复苏第1，3天的细胞数目有所降低，复苏3 d后细胞数目开始持续增加，复苏第5天细胞数目恢复至冻存前水平；③复苏后1，4 d，碱性磷酸酶活力降低但是与冻存前比较差异无显著性意义，复苏4 d后碱性磷酸酶活力持续升高；④复苏后1，4 d，成骨基因Runx2，Col-1，ALP，OCN表达降低但是与冻存前相比差异无显著性意义，复苏4 d后成骨基因表达持续升高；⑤玻璃化冻存1周与12周比较，复苏后的细胞活力和成骨活性差异均无显著性意义；⑥实验初步证实，玻璃化冻存可以保持组织工程骨的细胞活力与成骨活性；冻存时间(1，12周)对复苏后组织工程骨的成骨能力没有显著影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-3352-5685(刘磊)

关键词: 玻璃化冻存, 脂肪干细胞, 脱钙骨基质, 组织工程骨, 成骨活性, 细胞活力, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: Short-term (1 week) vitreous cryopreservation avoiding the formation of ice crystals has been achieved in preserving tissue-engineered bone composed of adipose-derived stem cells (ADSCs)/demineralized bone matrix (DBM) compound through adjusting particular composition of cryopreservation fluid. However, whether vitreous cryopreservation can be utilized to cryopreserve tissue-engineered bone for long term (12 weeks) and maintain cellular viability and osteogenic function after rewarming remains unclear.
OBJECTIVE: To investigate the effects of vitreous cryopreservation on viability and osteogenic function of ADSCs for short-term (1 week) and long-term (12 weeks) cryopreservation.
METHODS: ADSCs were isolated from New Zealand rabbits and expended to passage 3. Cells at passage 3 were seeded onto DBM derived from porcine trabecular bone and followed by 1 week osteogenic induction. The tissue-engineered bone was transferred to freezing vials of 2 mL containing vitreous cryopreservation fluid and then directly quenched into liquid nitrogen. The composition of cryopreservation fluid was 30% dimethyl sulfoxide, 70% low glucose-Dulbecco’s modified Eagle medium (L-DMEM), 0.8 mol/L trehalose. Following vitrification for 1 week or 12 weeks, the composite of ADSCs/DBM was removed and thawed. After rewarming, ADSCs viability were viewed under confocal laser microscope by staining viable cells with the green fluorescent dye Calcein AM and the red fluorescent dye Propidium iodide at days 1, 3, 7, 11 and 13. The number of cells seeded onto the DBM was assayed by Hochest33258 at days 1, 3, 5, 7, 9, 11 and 13. Meanwhile, alkaline phosphatase (ALP) activity was also assayed by PNP microplate method at days 1, 4, 7, 10, 14 and 21. Osteogenic gene expression including Runx2, OCN, ALP, COL-1 was detected by real- time PCR at days 1, 4, 7, 10, 14 and 21.
RESULTS AND CONCLUSION: After cryopreservation of 1 week or 12 weeks, it was found that more red-staining live cells was observed at 1 day post-rewarming by live/dead double staining, and the green-staining live cells increased at 3 days. By Hoechst 33258 assay, it was found that the cell number decreased at 1 and 3 days post-rewarming, compared with pre-cryopreservation. However, a constant increase in the cell number was observed beginning at 3 days, reaching the pre-cryopreservation level at 5 days post-rewarming. By PNP microplate method, it was found that ALP activity reduced at 1 and 4days post-rewarming, but compared with the level of pre-cryopreservation there were no significant difference. However, a constant increase in ALP activity was detected since 4 days. By real-time PCR, osteogenic gene expression including Runx2, OCN, ALP, COL-1 reduced at days 1 and 4, but compared with the level of pre-cryopreservation there was no significant difference. However, a constant increase in the osteogenic gene expression was since 4 days. The cell viability and osteogenic function were observed without significant difference at each time point after rewarming of cells that had undergone vitreous cryopreservation for 1 or 12 weeks. Preliminary findings indicate that vitreous cryopreservation can maintain cellular viability and osteogenic function of tissue-engineered bone. Cryopreservation time (1 and 12 weeks) has no significant effect on the cell viability and osteogenic function of the tissue-engineered bone after rewarming.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Adipose Tissue, Mesenchymal Stem Cells, Decalcification Technique, Femur, Cryopreservation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

刘磊，庸奇，李娜，杨朵，张国英，崔磊. 脂肪干细胞-脱钙骨的玻璃化冻存及复苏[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(9): 1357-1363.

Liu Lei, Yong Qi, Li Na, Yang Duo, Zhang Guo-ying, Cui Lei. Vitreous cryopreservation and thawing of adipose-derived stem cells/demineralized bone matri[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(9): 1357-1363.

图/表（结果） 2

2.1 脂肪干细胞形态以及成骨、成脂分化能力 原代培养24 h后，少量细胞贴壁生长，可见较多红细胞悬浮，培养3 d半量换液，可见大量细胞贴壁生长(图1A)。传代培养第3代后，细胞仍呈梭形，放射状排列，呈成纤维细胞样特征，增殖能力旺盛(图1B)。第3代脂肪干细胞成骨诱导2周后行碱性磷酸酶染色和茜素红染色，诱导组细胞内可见蓝染的碱性磷酸酶颗粒(图1C)，以及橘黄色的钙结节沉积(图1D)；成脂诱导2周后行油红O染色，结果显示细胞内有红染的脂滴形成(图1E)。

2.2 玻璃化冻存前细胞在脱钙骨上的增殖情况 共聚焦显微镜观察，第3天时有大量的绿染活细胞黏附于支架材料上，第7天时细胞增殖明显，绿染的活细胞形态清晰可见，几乎无红染的死细胞。Hochest33258检测结果发现成骨诱导组和非成骨诱导组细胞数目均在第7天达到高峰随后进入平台期，诱导组和非诱导组保持相似的生长规律。结果证明脱钙骨有很好的组织相容性，可以保证细胞在支架材料上存活，由于第7天细胞数目达到高峰，选择诱导7 d后进行玻璃化冻存，见图2。

2.3 冻存前碱性磷酸酶活力 细胞支架材料复合物经成骨诱导后随着时间延长碱性磷酸酶表达逐渐升高，14 d达到高峰随后逐渐降低，而非诱导组碱性磷酸酶活力无明显变化，第4天以后诱导组碱性磷酸酶活力与非诱导组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图3。

2.4 复苏后细胞在支架材料的增殖情况 玻璃化冻存1周或者12周，共聚焦显微镜观察，复苏后第1天仍然可见较多绿染的活细胞，红染的死细胞数目较冻存前多，随着时间延长红染的死细胞逐渐减少，绿染的活细胞逐渐增多。Hochest33258细胞定量结果表明，与冻存前(成骨诱导1周)的细胞数相比，复苏后第1天细胞数目降低12.8%和13.3%，复苏后第3天细胞数目分别降低30.2%和31.2%，复苏3 d后细胞数目开始持续增加，第5天细胞数目到达冻存前的83.3%和82.2%，达到冻存前水平。玻璃化冻存1周与12周比较，复苏后在各个检测时间点的细胞数目无明显差异，见图4。

2.5 复苏后碱性磷酸酶活力 玻璃化冻存1周或者12周，复苏后1，4 d，碱性磷酸酶活力较冻存前降低，但是与冻存前差异无显著性意义(P > 0.05)，4 d后碱性磷酸酶活力持续升高。玻璃化冻存1周与12周比较，碱性磷酸酶活力差异无显著性意义(P > 0.05)，见图5。

2.6 复苏后成骨相关基因ALP、Runx-2、Col-1、OCN表达 玻璃化冻存1周或者12周，复苏后1 d和4 d各成骨基因表达量较冻存前降低，但是与冻存前相比差异无显著性意义(P > 0.05)，4 d后各成骨基因表达量持续升高。冻存1周与12周比较，各个检测时间点成骨基因表达量差异无显著性意义(P > 0.05)，见图6。

参考文献

[1] Sundararaj GD, Amritanand R, Venkatesh K, et al. The use of titanium mesh cages in the reconstruction of anterior column defects in active spinal infections: can we rest the crest. Asian Spine J. 2011;5(3): 155-161.

[2] Sahoo NG, Pan YZ, Li L, et al. Nanocomposites for bone tissue regeneration. Nanomedicine (Lond). 2013;8(4):639-653.

[3] Blokhuis TJ, Arts JJ. Bioactive and osteoinductive bone graft substitutes: definitions, facts and myths. Injury. 2011;42 Suppl 2:S26-29.

[4] Zimmermann G, Moghaddam A. Allograft bone matrix versus synthetic bone graft substitutes. Injury. 2011;42 Suppl 2:S16-21.

[5] Strioga M, Viswanathan S, Darinskas A, et al. Same or not the same? Comparison of adipose tissue-derived versus bone marrow-derived mesenchymal stem and stromal cells. Stem Cells Dev. 2012;21(14): 2724-2752.

[6] Zuk PA, Zhu M, Ashjian P, et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol Biol Cell. 2002;13(12):4279-4295.

[7] Dimarino AM, Caplan AI, Bonfield TL. Mesenchymal stem cells in tissue repair. Front Immunol. 2013;4:201.

[8] Obata A, Kasuga T. Stimulation of human mesenchymal stem cells and osteoblasts activities in vitro on silicon-releasable scaffolds. J Biomed Mater Res A. 2009;91(1):11-17.

[9] Sheykhhasan M, Qomi RT, Ghiasi M. Fibrin Scaffolds Designing in order to Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells Differentiation to Chondrocytes in the Presence of TGF-β3. Int J Stem Cells. 2015;8(2):219-227.

[10] Sheykhhasan M, Qomi RT, Kalhor N, et al. Evaluation of the ability of natural and synthetic scaffolds in providing an appropriate environment for growth and chondrogenic differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells. Indian J Orthop. 2015;49(5):561-568.

[11] Wu L, Cai X, Zhang S, et al. Regeneration of articular cartilage by adipose tissue derived mesenchymal stem cells: perspectives from stem cell biology and molecular medicine. J Cell Physiol. 2013;228(5):938-944.

[12] Filardo G, Madry H, Jelic M, et al. Mesenchymal stem cells for the treatment of cartilage lesions: from preclinical findings to clinical application in orthopaedics. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 2013;21(8):1717-1729.

[13] Holt DJ, Grainger DW. Demineralized bone matrix as a vehicle for delivering endogenous and exogenous therapeutics in bone repair. Adv Drug Deliv Rev. 2012;64(12):1123-1128.

[14] Pabaney AH, Reinard KA, Asmaro K, et al. Novel technique for cranial reconstruction following retrosigmoid craniectomy using demineralized bone matrix. Clin Neurol Neurosurg. 2015;136:66-70.

[15] Schwartz Z, Hyzy SL, Moore MA, et al. Osteoinductivity of demineralized bone matrix is independent of donor bisphosphonate use. J Bone Joint Surg Am. 2011;93(24):2278-2286.

[16] Mandawala AA, Harvey SC, Roy TK, et al. Cryopreservation of animal oocytes and embryos: Current progress and future prospects. Theriogenology. 2016;86(7):1637-1644.

[17] Yong KW, Wan Safwani WK, Xu F, et al. Cryopreservation of Human Mesenchymal Stem Cells for Clinical Applications: Current Methods and Challenges. Biopreserv Biobank. 2015;13(4):231-239.

[18] Rall WF, Fahy GM. Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196 degrees C by vitrification. Nature. 1985;313(6003):573-575.

[19] Slichter SJ, Jones M, Ransom J, et al. Review of in vivo studies of dimethyl sulfoxide cryopreserved platelets. Transfus Med Rev. 2014; 28(4):212-225.

[20] Yong KW, Pingguan-Murphy B, Xu F, et al. Phenotypic and functional characterization of long-term cryopreserved human adipose-derived stem cells. Sci Rep. 2015;5:9596.

[21] Miyagi-Shiohira C, Kurima K, Kobayashi N, et al. Cryopreservation of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells. Cell Med. 2015;8(1-2):3-7.

[22] Schulz M, Risopatrón J, Matus G, et al. Trehalose sustains a higher post-thaw sperm motility than sucrose in vitrified human sperm. Andrologia. 2017;49(9). doi: 10.1111/and.12757. Epub 2017 May 25.

[23] Zhang Z, Wang T, Hao Y, et al. Effects of trehalose vitrification and artificial oocyte activation on the development competence of human immature oocytes. Cryobiology. 2017;74:43-49.

[24] 邢琼,王田娟,章志国,等.海藻糖应用于人类成熟卵母细胞玻璃化冷冻研究[J].安徽医药,2013,17(12):2134-2137.

[25] Matsuo K, Takahashi T, Igarashi H, et al. Effects of different trehalose concentrations in a warming medium on embryo survival and clinical outcomes in vitrified human embryos. Gynecol Obstet Invest. 2013; 76(4):214-220.

[26] 符雪,王凌峰,陈吉,等. 海藻糖在低温保存组织中的应用研究现状[J].中国医疗前沿,2013,8(14):12-13.

[27] Chen F, Zhang W, Wu W, et al. Cryopreservation of tissue-engineered epithelial sheets in trehalose. Biomaterials. 2011;32(33):8426-8435.

[28] Yin H, Cui L, Liu G, et al. Vitreous cryopreservation of tissue engineered bone composed of bone marrow mesenchymal stem cells and partially demineralized bone matrix. Cryobiology. 2009;59(2):180-187.

[29] 庸奇.脂肪干细胞-脱钙骨复合物玻璃化冻存的初步研究[D].乌鲁木齐:新疆医科大学,2014.

[30] Drosse I, Volkmer E, Capanna R, et al. Tissue engineering for bone defect healing: an update on a multi-component approach. Injury. 2008;39 Suppl 2:S9-20.

[31] Kofron MD, Opsitnick NC, Attawia MA, et al. Cryopreservation of tissue engineered constructs for bone. J Orthop Res. 2003;21(6):1005-1010.

[32] Liu BL, McGrath JJ. Vitrification Solutions for the Cryopreservation of Tissue-Engineered Bone. Cell Preservation Technology. 2002; 2(2): 133-143.

[33] Loutradi KE, Kolibianakis EM, Venetis CA, et al. Cryopreservation of human embryos by vitrification or slow freezing: a systematic review and meta-analysis. Fertil Steril. 2008;90(1):186-193.

[34] James AW, Levi B, Nelson ER, et al. Deleterious effects of freezing on osteogenic differentiation of human adipose-derived stromal cells in vitro and in vivo. Stem Cells Dev. 2011;20(3):427-439.

[35] Elder E, Chen Z, Ensley A, et al. Enhanced tissue strength in cryopreserved, collagen-based blood vessel constructs. Transplant Proc. 2005;37(10):4625-4629.

[36] Song YC, Chen ZZ, Mukherjee N, et al. Vitrification of tissue engineered pancreatic substitute. Transplant Proc. 2005;37(1):253-255.

[37] Song YC, An YH, Kang QK, et al. Vitreous preservation of articular cartilage grafts. J Invest Surg. 2004;17(2):65-70.

[38] Kuleshova LL, Gouk SS, Hutmacher DW. Vitrification as a prospect for cryopreservation of tissue-engineered constructs. Biomaterials. 2007; 28(9):1585-1596.

引言

由于感染、创伤、肿瘤切除导致的大块骨缺损，发病率高，治疗困难^[1]。目前临床治疗方法主要有自体骨移植、同种异体骨移植和生物替代材料等。自体骨移植保留了骨传导和骨诱导功能，并且具有成骨细胞，避免了疾病传播的风险，被视为骨缺损修复的金标准，但是其取材有限，并且存在供区损伤以及术后感染、疼痛、休克等并发症^[2-3]。同种异体骨移植会出现移植骨存活率低、易导致免疫排斥或传染性疾病等缺陷^[4]。人工替代材料由于可塑形性差，体内降解缓慢，限制了其作为组织工程支架的应用。组织工程骨的出现为骨缺损治疗开辟了新的途径。

组织工程骨构建的关键要素包括种子细胞、支架材料。理想种子细胞具有易取材、易扩增、更重要的是具有成骨分化潜能等特点。目前骨髓来源间充质干细胞由于具有向成骨、软骨、脂肪、心肌等多种组织细胞分化的潜能成为理想的种子细胞^[5]。但是取骨髓对机体损伤大，而且体外扩增能力较慢，短期内不能获得治疗所需要的细胞剂量。2001年Zuk等^[6]首次从抽脂手术患者的脂肪组织中提取大量的脂肪干细胞，并证明其与骨髓间充质干细胞一样表达部分干细胞标志物如CD29，CD166，CD109等。后续的大量基础研究证实脂肪干细胞同样具有成骨、成软骨、成脂、成肌等组织细胞分化的潜能^[7-9]。与骨髓间充质干细胞相比，脂肪干细胞除了具有多向分化的潜能，还具有取材方便、扩增能力强、培养条件要求低等优点^[10-12]。支架材料要具有良好的组织相容性、可降解性、一定的机械强度、低免疫原性等特点。目前用于组织工程骨构建的生物材料包括两大类：一类是天然生物材料，一类是人工合成材料。脱钙骨基质制备方法简单，具有低免疫原性、一定的机械强度、良好的三维空间结构^[13-14]。有研究报道同种异体脂肪干细胞复合脱钙骨材料成功修复了大鼠尺骨缺^[15]，证实了其构建组织工程骨的可行性。但是体外构建组织工程骨需要一段时间，不能满足临床急救的要求。因此有效保存技术对组织工程产品开发和临床应用至关重要。

研究者们不断探寻着各种细胞组织的深低温冻存方法，取得了一定的成果，根据深低温冻存细胞的速度可以分为快速冻存和慢速冻存两种。慢速冻存通过梯度降温，实现缓慢脱水从而阻止细胞内冰晶的形成，然而该方法不仅需要精确的降温控制设备、价格昂贵，而且冻存过程中细胞外易形成冰晶，不利于细胞存活^[16-17]。玻璃化冻存是一项新的深低温冷冻保存方法，已成功地冻存了多种细胞和组织。玻璃化冻存是指利用一种或多种冷冻保护剂保护待冷冻的生物材料，直接投入到液氮中快速冷冻达到一种类似玻璃的非晶体状态。这种非晶体的玻璃化状态是由液体的极度黏稠形成，阻止形成冰晶刺破细胞膜和细胞器，保证了细胞结构和功能的完整性^[18]。玻璃化冻存通常需要高浓度的冻存保护剂，这会给细胞带来渗透性损伤和毒性损伤。为了降低冻存液本身给细胞带来的损伤，玻璃化冻存液的成分选择以及合理的配比对玻璃化冻存成功与否至关重要。

冻存保护剂的成分可分为两大类：渗透性成分和非渗透性成分。目前常用的渗透性成分是二甲基亚砜，由于其穿透力强，在细胞膜内干扰水分子排列阻止冰晶的形成，在细胞以及组织冻存中应用广泛^[19-21]。海藻糖是近年来研究较多的非渗透性保护剂，其性质稳定，可以耐受剧烈环境温度变化，稳定核酸、蛋白大分子结构。目前已利用海藻糖玻璃化冻存成熟卵母细胞、精子、胸骨等细胞及组织，并获得初步成效^[22-26]。还有研究利用海藻糖以及二甲基亚砜玻璃化冻存组织工程皮肤，复苏后回植到裸鼠创面，仍具有修复皮肤缺损的能力^[27]。课题组前期研究证实玻璃化冻存脱钙骨复合骨髓间充质干细胞构建的组织工程骨，与冻存前相比，复苏后细胞仍能保持良好增殖和成骨能力，但是该冻存液成分含有动物来源的血清，可能具有病原体和病毒传染的可能性^[28]。庸奇^[29]探索出无血清配比的玻璃化冻存液(30%二甲基亚砜，70% DMEM，0.8 mol/L海藻糖)，用其玻璃化冻存脂肪干细胞-脱钙骨复合物，冻存7 d后发现复苏后细胞存活率达到冻存前的62%-85%。本实验将冻存时间延长至12周，探讨冻存时间是否影响细胞的存活率以及成骨能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 随机分组对照细胞实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年7月至2017年7月在首都医科大学附属北京世纪坛医院中心实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 6周龄新西兰大白兔6只，体质量3.5-3.0 kg，雌雄不拘，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.3.2 实验用主要试剂及仪器 LG-DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、青-链霉素(P-S)、PBS(美国Hyclone公司)；Ⅰ型胶原酶(美国Washington Biochemical公司)；地塞米松、1,25-(OH)₂VitD₃、抗坏血酸、β-磷酸甘油钠、二甲基亚砜、TrixionX-100、碱性磷酸酶试剂盒、细胞活死双染试剂盒(美国Sigma公司)；CO₂培养箱(美国Forma公司)；普通离心机(德国Biofuge公司)；TE300型倒置相差显微镜、共聚焦显微镜(日本Nikon公司)；液氮罐(成都金凤液氮容器公司)；超净工作台(上海医疗器械公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 兔脂肪干细胞的分离与培养 选取6周龄新西兰大白兔6只，耳缘静脉注射空气栓塞处死。常规消毒，备皮，取颈背部皮下新鲜脂肪，PBS冲洗3遍，剔除肉眼可见的筋膜和血管并用眼科剪将脂肪组织剪碎至浆糊状，置于预先配置的0.15%Ⅰ型胶原酶中，37 ℃摇床消化1 h，1 200 r/min离心10 min，弃上清，留取细胞沉淀；用LG-DMEM完全培养基(含体积分数为10%胎牛血清、1%青-链霉素)重悬细胞，按细胞密度为4×10⁴/cm²接种到直径为10 cm的培养皿中，在37 ℃，体积分数为5%的CO₂培养箱中培养。倒置显微镜下观察细胞生长状态，待细胞融合至75%-85%时，用0.25%胰酶消化，并按1︰3进行传代。选取第3代生长状态良好的脂肪干细胞用于实验研究。

1.4.2 脂肪干细胞成脂诱导 第3代脂肪干细胞以3×10⁴/cm²接种在6孔板中，每孔加入LG-DMEM完全培养基2.5 mL，待细胞贴壁24 h后，诱导组更换成脂诱导培养液(LG-DMEM完全培养基、0.5 mmol/L IBMX、1 μmol/L地塞米松、10 μmol/L胰岛素、200 μmol/L吲哚美辛)，未诱导组继续以LG-DMEM完全培养基进行培养，每3 d换液1次。成脂诱导2周后，弃培养液，以PBS清洗2遍，40 g/L多聚甲醛固定30 min，以0.6%的油红染液室温孵育15 min，倾去染液，三蒸水清洗2遍，倒置相差显微镜观察、拍照。

1.4.3 脂肪干细胞成骨诱导 将第3代脂肪干细胞以3×10⁴/cm²密度接种于6孔板中，细胞贴壁24 h后，诱导组更换成骨诱导培养液(LG-DMEM完全培养基，0.01 μmol/L 1，25-(OH)₂VitD₃，50 μmol/L抗坏血酸，10 mmol/L β-磷酸甘油钠)，未诱导组继续以LG-DMEM完全培养基进行培养，每3 d换液1次。成骨诱导2周后，倾去培养液，以PBS清洗2遍，分别行碱性磷酸酶染色和茜素红染色。碱性磷酸酶染色依照碱性磷酸酶试剂盒说明书。茜素红染色方法：体积分数为95%乙醇固定10 min，PBS清洗2遍，1%茜素红-Tris-HCl溶液(pH 4.2)室温染色30 min，PBS彻底清洗，倒置相差显微镜观察、拍照。

1.4.4 脱钙骨制备 取成年上海白猪股骨头松质骨，剔除股骨头上的软骨组织及肌肉，自来水清洗，烘干。用骨锯将股骨头切割成片状，厚度为1.5 cm；清水清洗3遍洗去骨髓和骨残渣；浸泡于1% TrixionX-100，摇床振荡48 h，脱去骨组织细胞；待细胞脱至完全，用无水乙醇脱脂处理后浸泡于三蒸水中4 ℃过夜，空气干燥24 h；将其置于0.5 mol/L HCl中脱钙至微软有弹性备用；将脱钙好的脱钙骨切割成需要的形状和大小，超声清洗后，体积分数为75%乙醇消毒24 h，PBS清洗，完全培养基浸泡24 h，吸干材料上培养液即可准备接种脂肪干细胞。

1.4.5 冻存前脂肪干细胞在脱钙骨上的增殖 将第3代脂肪干细胞用完全培养基重悬制成细胞浓度为5×10¹⁰ L^-1的细胞悬液，每块脱钙骨材料(长0.6 cm，宽0.6 cm，厚0.3 cm)滴加20 μL细胞悬液，反复抽吸至细胞充分渗透，置于37 ℃，体积分数5%的CO₂培养箱中静置4 h，将材料转至新的24孔板中，诱导组加入成骨诱导液，对照组加入LG-DMEM完全培养基，每3 d更换1次各自培养液。在1，3，5，7，9，11，13 d分别用0.5 mL蛋白酶K(0.5 g/L)裂解材料上的细胞，离心收集上清，采用hochest33258 DNA定量计数法检测细胞数目，每个时间点各组随机选择3块细胞支架复合物。诱导组在诱导第3天和第7天时，细胞支架复合物用活死双染试剂染色，共聚焦显微镜观察细胞在脱钙骨上的生长情况。

1.4.6 冻存前碱性磷酸酶活力检测 将上述构建好的组织工程骨，分为诱导组和非诱导组，每组3个复孔。诱导组加入成骨诱导液，非诱导组加入完全培养基，分别在培养1，4，7，10，14，21 d各个时间点收集细胞支架材料复合物于含有1 mL Tris-Hcl(pH 7.4)缓冲液的1.5 mL EP管中，液氮反复冻融3次，离心收集上清，一部分用于碱性磷酸酶活力检测，一部分检测细胞总DNA含量。碱性磷酸酶活力采用对硝基苯酚微板法，410 nm读取吸光度值，根据对硝基苯酚标准品制备的曲线，对比得出样品中对硝基苯酚含量，最后结果以其总DNA含量进行归一。

1.4.7 玻璃化冻存1周或者12周，复苏后细胞在支架材料上的增殖 将诱导1周的细胞支架材料复合物置于含有预先配置的玻璃化冻存液(70%DMEM，30%二甲基亚砜，0.8 mol/L海藻糖)的冻存管中，冰上孵育15 min，立即投入液氮冻存，冻存1，12周，37 ℃水浴快速复温。用预冷的PBS冲洗3次，洗去残留冻存液，材料置于24孔板中，每孔加1 mL成骨诱导液，诱导1，3，5，7，9，11，14 d，每个时间点各组分别随机选择3块细胞支架材料复合物，用hochest33258 DNA定量计数法检测细胞数目。细胞支架材料复合物用活死双染试剂染色，共聚焦显微镜观察玻璃化冻存1周和12周，复苏后1，3，7，11，13 d时细胞在脱钙骨上的生长情况。

1.4.8 玻璃化冻存1周或者12周，复苏后碱性磷酸酶活力检测 取玻璃化冻存1周或者12周的支架材料复合物，常规复苏后，继续成骨诱导培养。分别在培养1，4，7，10，14 d行碱性磷酸酶活力检测，每个时间点选取3块材料，检测方法同冻存前。

1.4.9 玻璃化冻存1周或者12周，复苏后成骨相关基因Runx2，ALP，OCN，COL-1的表达 取玻璃化冻存1周或者12周的支架材料复合物常规复苏后，继续成骨诱导培养，在培养1，4，7，10，14 d时，检测成骨相关基因表达情况。

具体步骤：将各个时间点的细胞材料复合物收集于 1.5 mL EP管中加入1 mL Trizol进行总RNA抽提，反转录为cDNA，实时定量PCR检测成骨相关基因表达，以GAPDH为内参，冻存前(成骨诱导1周)为参照。ALP上、下游引物分别为5’-CGC AGG CAA TGC TTT TCG-3’和5’-CGG GGT CAC TGG TAT CGT TCT-3’；COL-1的上、下游引物分别为5’-GCT TCT CAT TCT CAT GGA TG-3’和5’-GCA GCA ATG ACA ACA AGA C-3’；OCN的上、下游引物分别为5’-GAC ACC ATG AGG ACC ATG CTC TC-3’和5’-GCC TGG TAG TTG TTG TGA GC-3’；Runx2 的上、下游引物分别为5’-GCA GTT CCC AAG CAT TTC AT-3’ 和 5’-GGT GTA AGT AAA GGT GGC TGG A-3’；管家基因GAPDH的上、下游引物分别为 5’-GTT GCT GTC GCC CGT TCG-3’和5’-TGC CGT GGG TGG AAT CAT AC-3’。

1.5 主要观察指标 冻存前脂肪干细胞在脱钙骨中的增殖活性以及碱性磷酸酶活力，复苏后脂肪干细胞在脱钙骨上的增殖活性，碱性磷酸酶活力以及成骨基因OCN、COL-1、Runx2、ALP的表达。

1.6 统计学分析 数据采用Graph Pad Prism软件处理，两独立样本比较用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

大面积骨缺损临床常见，但是由于骨组织难修复、难再生，其临床治疗困难，自体骨移植虽然是临床治疗的金标准，但是存在供区并发症和供体不足的缺陷^[1^，^30]。组织工程出现克服了这一困难。脂肪干细胞相对骨髓间充质干细胞具有易取材、易扩增等特点，且具有多向分化的潜能。原代培养第3天发现，脂肪干细胞大量贴壁呈蜂窝状排列，细胞传代过程中也保持了良好细胞形态。脂肪干细胞体外成骨诱导14 d后出现钙结节，胞浆内出现碱性磷酸酶颗粒，证明脂肪干细胞可以向成骨分化，成脂诱导14 d后胞浆内出现大小不一的脂滴，证明脂肪干细胞可以向成脂肪分化，脂肪干细胞具有多向分化的潜能，可以作为一种理想的种子细胞构建组织工程骨。

脱钙骨具有良好的三维空间结构保证细胞生长的足够空间，共聚焦显微镜观察可见冻存前有大量的绿染活细胞在支架材料上生长，证明脱钙骨毒性低，是一种理想的组织工程支架材料。实验应用脱钙骨复合脂肪干细胞构建的组织工程骨进行相关研究。冻存前碱性磷酸酶活力检测结果表明，脂肪干细胞在脱钙骨上仍具有良好的成骨能力，第4天后与非诱导组有显著性差异，证实脂肪干细胞和脱钙骨基质体外构建组织工程骨可行。但是由于组织工程骨的体外构建需要一段时间不能满足临床急救的需求，因而寻找一种合适的保存方法成为解决问题的关键。在骨组织的冻存中，虽然有自体骨冻存的颅骨骨瓣修复应用于临床的报道^[31]。但是组织工程骨的保存报道较少，而且效果存在很大的差异^[32-33]。玻璃化冻存相对于慢速冻存而言，由于无冰晶形成，可以阻止冰晶破坏细胞膜和细胞器，保证细胞存活^[34]。目前玻璃化冻存冻存组织工程血管、卵巢组织、胰腺组织中取得了初步成效^[35-37]。

理想的玻璃化冻存液进行合理的配比是冻存成功的关键^[38]。庸奇^[29]在前期工作中，玻璃化冻存脂肪干细胞-脱钙骨支架复合物1周，得到玻璃化冻存液合适的配比成分：30%二甲基亚砜，70% DMEM，0.8 mol/L海藻糖。延长玻璃化冻存时间至12周，能否保持细胞活力以及成骨能力，本实验进行了进一步探讨。在玻璃化冻存1周或者12周，复苏后第7天共聚焦显微镜观察显示，大量的绿染活细胞在脱钙骨支架材料上聚集生长，几乎无红染的死细胞，这与冻存前绿染的活细胞结果相似。Hochest33258细胞定量结果表明，冻存1周或者12周，复苏后第5天细胞数目分别为冻存前的83.3%和82.2%，与冻存前细胞数目相比无明显差异，并且在各个检测时间点，两组细胞数目无明显差异，证明该玻璃化冻存液能够保持细胞活力并快速达到冻存前的水平。冻存1周或者12周，复苏后第1，4天碱性磷酸酶活力与冻存前无明显差异，基本恢复冻存前水平，在各个检测时间点碱性磷酸酶活力无明显差异。成骨相关基因 Runx2、OCN、ALP、COL-1表达量，第1，4天与冻存前相比无明显差异，基本达到冻存前水平，复苏4 d后逐渐升高，冻存1周与12周比较，各个检测时间点成骨基因表达量无明显差异。实验初步证实，玻璃化冻存可以保持组织工程骨的细胞活性与成骨活性；冻存复苏后培养5 d，脂肪干细胞细胞数目恢复至冻存前水平，冻存复苏后培养第1天，脂肪干细胞成骨活性与冻存前相比无明显差异。冻存时间(1周、12周)对复苏后组织工程骨的细胞活力以及成骨能力没有显著影响。玻璃化冻存后的组织工程骨能否进行骨缺损的修复，这些问题还需要进一步探讨。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

脂肪干细胞-脱钙骨的玻璃化冻存及复苏

Vitreous cryopreservation and thawing of adipose-derived stem cells/demineralized bone matri

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[1]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[2]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[3]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[4]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[5]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[6]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[7]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[8]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[9]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[10]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[11]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[12]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[13]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[14]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[15]	史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.