人羊膜间充质干细胞与人脱细胞羊膜支架的生物相容性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0445

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (5): 742-747.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0445

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

人羊膜间充质干细胞与人脱细胞羊膜支架的生物相容性

杨继滨，朱喜忠，熊华章，李豫皖，金瑛，刘毅

遵义医学院附属医院关节外科，贵州省遵义市 563000

修回日期:2017-12-10 出版日期:2018-02-18 发布日期:2018-02-18
通讯作者: 刘毅，教授，硕士生导师，遵义医学院附属医院关节外科，贵州省遵义市 563000
作者简介:杨继滨，男，1987年生，贵州省遵义市人，汉族，遵义医学院在读硕士，主要从事运动医学、干细胞及组织工程研究。
基金资助:
贵州省科技厅联合基金(黔科合LH字[2016]7477号)

Biocompatibility of human amniotic mesenchymal stem cells with human acellular amniotic membrane scaffold

Yang Ji-bin, Zhu Xi-zhong, Xiong Hua-zhang, Li Yu-wan, Jin Ying, Liu Yi

Department of Joint Surgery, Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China

Revised:2017-12-10 Online:2018-02-18 Published:2018-02-18
Contact: Liu Yi, Professor, Master’s supervisor, Department of Joint Surgery, Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China
About author:Yang Ji-bin, Studying for master’s degree, Department of Joint Surgery, Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China
Supported by:
the Joint Fund of Guizhou Provincial Department of Science and Technology, No. [2016]7477

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
人羊膜与人脱细胞羊膜：人羊膜位于胎盘的最内层，是厚度为20-500 μm的半透明膜。它不仅能为组织工程研究提供种子细胞，还具有性能优异的细胞外基质成分而被广泛运用于组织工程中。人脱细胞羊膜是一种脱细胞材料，已被广泛应用于各部位损伤修复，如角膜移植、皮肤缺损、软骨损伤及外周神经再生等领域，并获得良好的治疗效果。人脱细胞羊膜可以作为一种三维支架为细胞提供黏附生长的微环境。
人脱细胞羊膜支架：相较于其他高分子聚合物支架具有良好的生物相容性、生物可降解性和低免疫原性等众多优点，可以作为保持干细胞多能分化特性的培养环境。目前，人脱细胞羊膜作为支架已应用于不同的组织工程，包括骨组织工程、角膜组织工程以及血管组织工程等，但是用于韧带组织工程目前暂未发现有相关研究。

摘要
背景：前交叉韧带损伤越来越多见，传统治疗方式主要是前交叉韧带重建，随着组织工程研究在临床广泛运用，韧带组织工程治疗前交叉韧带损伤已成为目前研究的热点。
目的：探讨人羊膜间充质干细胞和人脱细胞羊膜支架的体外生物相容性。
方法：采用酶消化法获得人羊膜间充质干细胞并对其进行鉴定。采用酶消化法和化学去污法对新鲜人羊膜进行脱细胞处理，以苏木精-伊红染色以及免疫荧光染色检测细胞成分移除情况以及细胞外基质破坏情况。取第3代人羊膜间充质干细胞，分别使用人脱细胞羊膜浸提液(实验组)与普通L-DMEM/F12培养基(对照组)培养，CCK-8法检测两组细胞增殖能力。人羊膜间充质干细胞与人脱细胞羊膜共培养14 d后，扫描电镜与倒置显微镜观察人脱细胞羊膜上的细胞黏附及生长情况。
结果与结论：①倒置相差显微镜观察显示人羊膜间充质干细胞呈漩涡状、贴壁生长，高表达波形蛋白，低表达CK-19，具有成骨、成脂、成软骨诱导分化能力；②苏木精-伊红染色显示人脱细胞羊膜上皮细胞及间充质干细胞已完全移除，细胞外基质成分无明显破坏；免疫荧光染色显示Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原均呈阳性表达；③人脱细胞羊膜浸提液对人羊膜间充质干细胞无细胞毒性，不影响其增殖活性；④倒置相差显微镜及扫描电镜均显示人脱细胞羊膜可以促进人羊膜间充质干细胞增殖及黏附，二者具有良好的生物相容性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-3074-0053(杨继滨)

关键词: 人羊膜间充质干细胞, 人脱细胞羊膜, 支架, 干细胞, 组织工程, 生物相容性, 韧带损伤, 前交叉韧带

Abstract:

BACKGROUND: Anterior cruciate ligament (ACL) injury is commonly seen, and mainly treated with ACL reconstruction. Ligament tissue engineering treatment for ACL injury has become the current focus due to the extensive use of tissue engineering techniques in clinical practice.
OBJECTIVE: To investigate the biocompatibility of human amniotic mesenchymal stem cells (hAMSCs) and human acellular amniotic membrane (HAAM) scaffolds in vitro.
METHODS: hAMSCs were isolated using enzyme digestion and then identified. The fresh human amniotic membrane was subjected to decellularization using enzymatic digestion and chemical decontamination. Hematoxylin-eosin staining and immunofluorescence were used to detect the removal of cell components and destruction of the extracellular matrix. hAMSCs were cultured with HAAM extract (experimental group) and normal L-DMEM/F12 medium (control group). Cell proliferation was detected by cell counting kit-8. Cell adhesion and growth were observed by scanning electron microscope and inverted microscope at 14 days after co-culture with HAAM.
RESULTS AND CONCLUSION: hAMSCs exhibited a spiral, adherent growth under the inverted phase contrast microscope; and the cells highly expressed vimentin and lowly expressed CK-19, with osteogenic, adipogenic, and chondrogenic potential. Hematoxylin-eosin staining showed that human acellular amniotic epithelial cells and mesenchymal stem cells were completely removed and the extracellular matrix had no obvious damage. Immunofluorescence staining showed positive expression of type I collagen and type III collagen. The HAAM extract had no cytotoxicity to hAMSCs and exerted no effect on its proliferative activity. HAAM could promote the proliferation and adhesion of hAMSCs after incubation under the inverted microscope and scanning electron microscope. These findings indicate that HAAM has good biocompatibility and is favorable for the proliferation of hAMSCs.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Amnion, Mesenchymal Stem Cells, Biocompatible Materials, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

杨继滨，朱喜忠，熊华章，李豫皖，金瑛，刘毅. 人羊膜间充质干细胞与人脱细胞羊膜支架的生物相容性[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(5): 742-747.

Yang Ji-bin, Zhu Xi-zhong, Xiong Hua-zhang, Li Yu-wan, Jin Ying, Liu Yi. Biocompatibility of human amniotic mesenchymal stem cells with human acellular amniotic membrane scaffold[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(5): 742-747.

图/表（结果） 2

2.1 倒置相差显微镜下hAMSCs的形态及鉴定 采用酶消化法进行hAMSCs原代培养，镜下可见原代hAMSCs多呈类圆形，部分纺锤形或多角状，贴壁生长；经过传代培养后，细胞逐渐变为长梭形，漩涡状贴壁生长，见图1。

第3代hAMSCs经成骨诱导分化21 d后行茜素红染色，细胞透光性变弱，细胞密度增加，可见斑块状褐色物质，部分细胞变成小圆形矿化结节；成脂诱导21 d后行油红O染色，可见细胞排列散乱，细胞形状改变，类圆形细胞中出现脂滴样物质；成软骨诱导21 d后行甲苯胺蓝染色，可见细胞部分消失，细胞核增大，偏心，见图2。第3代hAMSCs免疫荧光结果显示波形蛋白呈阳性表达，CK-19呈阴性表达，见图3。

2.2 倒置相差显微镜下HAAM组织结构变化 苏木精-伊红染色示新鲜人羊膜具有明显的分层结构，主要包括单独的上皮层、基底膜以及基质部分。经过脱细胞处理后，可见上皮层的细胞成分以及基质中的hAMSCs全部被移除，并且羊膜基质部分无明显破坏，见图4。

2.3 倒置荧光显微镜下人羊膜及人脱细胞羊膜的组织学观察结果 免疫荧光染色显示Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原在新鲜人羊膜以及人脱细胞羊膜中均呈阳性表达(红色)，DAPI染色可见人脱细胞羊膜呈阴性表达，人羊膜呈阳性(蓝色)表达，见图5。

2.4 CCK-8检测细胞活性 第3代细胞在经过7 d的培养过程中，两组细胞均生长良好，分别在每天同一时间测定A₄₅₀值，实验组与阴性对照组相比在第3-7天时出现显著差异，见图6。

2.5 hAMSCs在HAAM上的黏附及生长情况 在体外将第3代hAMSCs与HAAM共培养14 d后可见hAMSCs与HAAM黏附良好，广泛分布于HAAM中，hAMSCs呈长梭状，排列整齐，与HAAM具有良好的生物相容性，见图7。

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引言

前交叉韧带损伤多见于进行剧烈运动的年轻患者，主要损伤机制包括膝关节旋转及过伸。前交叉韧带血供不良，损伤后自行修复较难^[1]。最新统计结果显示，美国每年有30万名新增膝关节前交叉韧带损伤患者，且绝大部分患者需要手术重建治疗^[2]。目前针对前交叉韧带断裂的主要治疗方式为关节镜下重建前交叉韧带。用于前交叉韧带重建的移植物包括自体肌腱、异体肌腱、人工韧带等。然而，移植物断裂、供区并发症以及愈合缓慢所引起的关节僵硬、肌力下降，已成为前交叉韧带重建急需解决的问题^[3]。

近年来，干细胞因具有增殖、再生以及多项分化等功能被广泛用于组织工程。许多研究已经证明干细胞治疗能够有效提高前交叉韧带重建的成功率^[4-5]。人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells，hAMSCs)因其容易获取，具有高丰度、高增殖能力、低免疫原性和多向分化潜能等特点逐渐成为研究热点^[6]。但是单纯注射干细胞的治疗效果不理想，因此，支架成为干细胞治疗的重要载体^[7]。细胞外基质支架因其能够为细胞增殖、迁移、黏附及分化提供天然环境而被广泛应用于组织工程^[6-12]。人脱细胞羊膜(human acellular amniotic membrane，HAAM)作为细胞外基质支架具有容易获取、免疫原性低、不存在伦理争议等优点，有研究将其应用于皮肤、角膜、软骨以及骨组织工程效果良好^[13-17]。目前暂无研究将HAAM支架用于韧带组织工程。为此，实验初步评估HAAM与hAMSCs的生物相容性，为后期体内研究以及构建组织工程韧带奠定基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞-支架体外实验观察。

1.2 时间及地点 于2017年3至8月在遵义医学院附属医院细胞工程实验室完成。

1.3 材料 实验所收集的6个胎盘均为遵义妇幼保健院产科足月产产妇自愿捐赠，无其他基础疾病，术前均签署知情同意书，符合遵义医学院附属医院伦理委员会要求。

实验用主要试剂及仪器：L-DMEM/F12培养液(Gibco公司，美国)；胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶、胎牛血清(HyClone公司，美国)；Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原抗体(Abcam公司，美国)；成骨培养基、成脂培养基、成软骨培养基(Gibco公司，美国)；细胞角蛋白19(cytokeratin-19，CK-19)、波形蛋白抗体(北京索莱宝科技有限公司，中国)；通用二抗试剂盒、倒置相差显微镜(Nikon公司，日本)；倒置荧光显微镜(Olympus公司，日本)；扫描电镜、冷冻干燥机(Thermo公司，美国)；Triton X-100(索莱宝公司，中国)。

1.4 实验方法

1.4.1 hAMSCs 分离、培养及鉴定 参照前期实验^[18]，将胎盘于无菌条件下轻轻剥离后带入实验室。用钝物小心刮除难以清洗的血渍，将羊膜用无菌剪刀剪成大小为0.5 mm× 0.5 mm的碎片放入离心管，随后将羊膜体积2倍的0.05% EDTA-胰蛋白酶加入离心管，分别消化40 min和30 min；弃上清后将未消化完的羊膜组织放入另一离心管，加入等体积的Ⅱ型胶原酶，置入37 ℃水浴箱中振荡消化1.5 h；将滤液用300目滤网过滤，收集细胞滤液，以离心半径25 cm、1 500 r/min离心10 min；弃上清液，加入完全培养基重悬细胞，以4×10¹⁰ L^-1细胞浓度接种于75 cm²培养瓶中，37 ℃、体积分数为5% CO₂及饱和湿度培养箱培养。

将已种瓶细胞每2 d或3 d更换1次培养基。待细胞融合约90%时用0.125%胰蛋白酶在37℃、体积分数为5% CO₂及饱和湿度细胞培养箱中消化三四分钟，显微镜下可见贴壁细胞脱落、变圆，立即加入等体积含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM/F12培养液终止消化，离心5 min；弃上清液，加入1 mL的L-DMEM/F12培养液吹打重悬细胞；最后以2×10¹⁰ L^-1细胞浓度接种于75 cm²培养瓶中，使用传至第3代的细胞进行后期实验。倒置相差显微镜下观察细胞生长、融合程度，判断细胞活性和增殖情况。

待第3代hAMSCs融合约60%时，PBS清洗3次，细胞培养液更换为成骨、成脂、成软骨诱导培养基，每3 d换液1次；待细胞培养至21 d时，分别予以茜素红染色、油红O染色、甲苯胺蓝染色，倒置相差显微镜观察染色结果。

将第3代hAMSCs以2×10⁸ L^-1细胞浓度接种于24孔板中，培养7 d后弃去培养基，PBS清洗3次，每次约10 min；每孔加入40 g/L多聚甲醛1 mL于37 ℃下固定30 min，PBS清洗3次，每次约10 min；0.1%Trition X-100于37 ℃下破膜15 min，PBS清洗3次，每次10 min；体积分数为5%胎牛血清37 ℃下封闭30 min。加入一抗鼠抗人CK-19 (1︰150)和波形蛋白单克隆抗体100 μL(1︰200)，4 ℃孵育过夜；PBS清洗3次，每次10 min；DAPI复染细胞核5 min，PBST清洗3次，每次10 min。倒置荧光显微镜观察蛋白表达情况。

1.4.2 HAAM的制备及组织学观察 同上方法将人羊膜分离后，浸泡于用0.01 mol/L PBS稀释的1%Triton X-100中，反复振荡摇晃24 h；然后置于2.5 g/L胰蛋白酶+0.02% EDTA中振荡摇晃3 h取出，PBS冲洗后于冷冻干燥机中冷冻干燥，剪成长1 cm，宽1 cm的方形小块，分装密封，环氧乙烷消毒备用。将所取新鲜人羊膜及人脱细胞羊膜浸泡于40 g/L多聚甲醛固定，乙醇脱水，石蜡包埋并切片，切片厚度为4 μm，行苏木精-伊红染色。经过脱蜡、再水化、抗原修复后加入兔抗人Ⅰ型胶原(1︰1 000)、兔抗人Ⅲ型胶原(1︰200)抗体一抗于4 ℃下过夜孵育，加入羊抗兔二抗室温孵育60 min，PBS清洗5 min 3次。DAPI复染5 min，PBS清洗10 min 3次。荧光显微镜下观察染色组织结构变化。

1.4.3 HAAM与hAMSCs共培养 在6孔板中加入100 μL DMEM，然后将已消毒HAAM支架放入其中使之紧贴板底，放入孵箱中孵育30 min。然后将第3代hAMSCs消化后加于支架上，细胞浓度为5×10⁹ L^-1，每孔200 μL，将6孔板放入37 ℃、体积分数为5%CO₂及饱和湿度培养箱培养，每2 d更换1次培养基。

1.5 主要观察指标

1.5.1 hAMSCs与HAAM的生物相容性 将培养基与制备好的HAAM按6 mL/cm²于培养箱中静置72 h制成浸提液。取对数生长期的hAMSCs以2 000个/孔种植于96孔培养板(每孔100 μL)，每组5孔，培养24 h待细胞贴壁后弃去原培养液，加入浸提液作为实验组，37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中静置培养。以不含细胞的培养基作为空白对照组，以普通培养基培养作为阴性对照组，每隔24 h向各孔中加入10 μL CCK-8溶液，于细胞培养箱中培养4 h，酶标仪测定波长为450 nm处吸光度(A)值，连续测定7 d。

1.5.2 hAMSCs在HAAM上的黏附及生长情况 将6孔板中共培养14 d的HAAM-hAMSCs用PBS清洗干净，于倒置相差显微镜下观察hAMSCs形态及与HAAM黏附情况。将另一6孔板中共培养14 d的HAAM-hAMSCs用4%戊二醛固定，乙醇梯度脱水，临界点干燥，喷金，于扫描电镜下观察HAAM表面hAMSCs生长情况。

1.6 统计学分析 将所得数据应用SPSS 19.0统计学软件进行数据处理。实验结果的比较采用独立样本t 检验， P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

目前用于肌腱组织工程的种子细胞多为骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞以及肌腱干细胞。而hAMSCs作为一种新的种子细胞具有与其他种子细胞相近的生物学特性。有研究显示hAMSCs的增殖能力较骨髓间充质干细胞更高^[19]。目前hAMSCs已普遍用于骨、软骨、肌腱、神经等组织的体内外研究^[20-23]，作者前期实验也发现hAMSCs具有向韧带细胞分化的特点^[18^，^21]。本实验采用酶消化法获取hAMSCs，可能会掺杂部分上皮细胞，CK-19和波形蛋白分别作为人羊膜上皮细胞和hAMSCs的特异性表达分子，通过检测CK-19和波形蛋白的表达可判断hAMSCs的纯度。结果显示，第3代hAMSCs高表达波形蛋白，低表达CK-19，说明培养的hAMSCs符合实验对细胞的纯度要求。另外，结果显示hAMSCs呈贴壁生长，具有成骨、成脂、成软骨诱导分化能力。

支架材料作为组织工程研究中另一重要组成应具备良好的生物相容性、稳定性以及低免疫原性，同时能够促进细胞的黏附和增殖，使细胞能够向所需组织分化^[24]。天然生物支架因其良好的生物相容性、低免疫原性近年来备受关注，而HAAM具有容易获取，价格便宜等优势成为新的研究热点。脱细胞化可以进一步去除人羊膜的免疫原性，还能够充分暴露具有生物活性的细胞外基质^[25]。许多研究已经发明了不同的脱细胞方法，其中大部分都是以酶、化学试剂和物理方法联合达到去细胞的目的^[16^，^26]。实验利用去污剂和酶消化法制备HAAM，该方法能够有效去除人羊膜的上皮细胞以及间充质干细胞，同时保留大部分细胞外基质成分。

理想中的组织工程支架需要有一个可供细胞增殖和黏附的微环境^[27-29]。实验将HAAM浸提液用于细胞活性和毒力测定，结果显示，其能够有效促进hAMSCs增殖，而且无毒性。在组织工程中，支架与细胞的黏附是最重要的，只有细胞在支架上生长并且分泌相应的细胞外基质才能有效应用于组织工程。实验将hAMSCs与HAAM复合后进行倒置显微镜观察、扫描电镜观察以及免疫荧光检测，结果均显示hAMSCs不仅能够良好的黏附于HAAM支架，而且仍表现出hAMSCs长梭状形态。此外，HAAM的这些特点同样被一些研究通过其他细胞所证实^[16^，^30]。HAAM以及hAMSCs被广泛应用于组织工程研究，特别是角膜缺损、骨缺损、韧带损伤、皮肤损伤以及创面愈合。

实验证明了HAAM可以作为一种三维支架为细胞提供黏附生长的微环境。同时还发现hAMSCs与HAAM共培养后，细胞形态并未出现明显改变，仍保留其自身长梭状，这可能说明诱导hAMSCs向韧带细胞分化有一定的优势。

综上所述，HAAM能够有效促进hAMSCs黏附，并且未发现排斥反应及毒性。所有结果均说明HAAM可以作为负载细胞的载体为组织工程研究提供新型支架。但是作为天然支架材料也必定有其缺点，如重复性不高，强度与加工性相对较差，可能出现免疫排斥反应等。下一步的实验研究需围绕上述缺点进行改进，同时进一步进行体内研究以及构建组织工程韧带。

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本文评价

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