治疗用脐带间充质干细胞冷藏保存时间对细胞活性的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0446

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
冷藏保存温度：生物样本在较低温度下可以保持低代谢状态，而在没有冻存保护剂的情况下溶液结冰又会刺破细胞膜，0-4 ℃的冷藏条件为目前常用低温运输箱所能保持的温度，因此实验首选0-4 ℃作为冷藏保存温度，初步探索了脐带间充质干细胞在冷藏保存条件下储存时长对细胞活性的影响。
细胞克隆形成率：即细胞接种存活率，表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。

摘要
背景：随着对间充质干细胞基础研究和临床研究的不断深入，其应用范围越来越广。但在间充质干细胞的临床应用中，缺乏暂时储存条件及回输时间的相关研究报道。
目的：探索脐带间充质干细胞制备完成后暂存时间对于细胞质量和细胞活性的影响。
方法：取冷冻复苏的脐带间充质干细胞和未冷冻的脐带间充质干细胞，放置0-4 ℃储存0，6，12，24 h后分别检测活细胞率、细胞倍增时间、细胞克隆形成率。
结果与结论：①未经过冻存的脐带间充质干细胞能在0-4 ℃条件下储存时间较长，储存12 h后细胞开始死亡，细胞活力开始下降；②冷冻复苏的脐带间充质干细胞在0-4 ℃储存时间较短，储存6 h后细胞即开始死亡，细胞活力减弱；③结果表明，脐带间充质干细胞制备完成后应保证在6 h或12 h之内回输，以确保最佳的治疗效果。如果运输距离较长，应优先选用未冻存的间充质干细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-7666-0270(闫姗姗)

关键词: 干细胞, 细胞治疗, 间充质干细胞, 脐带, 存储时间, 细胞活性

Abstract:

BACKGROUND: With the in-depth basic research and clinical research on mesenchymal stem cells, mesenchymal stem cells have wide clinical prospects. However, little is reported on the temporary storage conditions and refusion time of mesenchymal stem cells.
OBJECTIVE: To explore the effect of cold storage time on the cell mass and viability of umbilical cord mesenchymal stem cells.
METHODS: Frozen-thawed and unfrozen umbilical cord mesenchymal stem cells were prepared and stored at 0-4 ℃. The cell viable cell rate, cell doubling time and colony forming efficiency were detected after 0, 6, 12, and 24 hours.
RESULTS AND CONCLUSION: Unfrozen cells could maintain the cell biological activity at 0-4 ℃ until dead cells appeared with the presence of decreased cell viability at 12 hours after storage. Frozen-thawed cells were unable to be stored at 0-4 ℃ for a long time, and cells began to die and the cell viability was weakened at 6 hours after storage. These findings indicate that umbilical cord mesenchymal stem cells should be injected into patients within 6 or 12 hours after preparation, to ensure the best therapeutic effects. If there is a longer transport distance, it is preferred to use unfrozen mesenchymal stem cells.

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Key words: Stem Cells, Mesenchymal Stem Cells, Cryopreservation, Tissue Engineering

中图分类号:

R349.2

闫姗姗，李一佳，陈曦，刘丽君. 治疗用脐带间充质干细胞冷藏保存时间对细胞活性的影响[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(5): 748-753.

Yan Shan-shan, Li Yi-jia, Chen Xi, Liu Li-jun. Effect of cold storage time on cellular viability of umbilical cord mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(5): 748-753.

图/表（结果） 2

2.1 细胞形态 未经过冻存的脐带间充质干细胞于 0-4 ℃保存12 h之内，细胞贴壁效率无明显差别，大部分细胞都能够正常贴壁，未贴壁的悬浮细胞很少，保存24 h后的贴壁效率明显下降，可以观察到较多未贴壁的悬浮细胞，但贴壁后的增殖能力均较好(图1)。

冻存复苏的脐带间充质干细胞于0-4℃保存6 h之内，细胞贴壁效率无明显差别，大部分细胞都能较好的贴壁，悬浮细胞不多，保存12 h后细胞贴壁效率明显下降，能够看到大量未贴壁的死细胞；保存24 h后细胞不仅贴壁效果差，只能看到很少的细胞贴壁，增殖能力也明显降低(图2)。

2.2 活细胞率 未冻存的脐带间充质干细胞在0-4 ℃储存0，6，12，24，36，48 h后的活细胞率分别为96%，94%，91%，77%，73%，59%，储存12 h后活细胞率明显降低；冻存复苏的脐带间充质干细胞在0-4 ℃储存0，6，12，24 h后的活细胞率分别为94%，92%，69%，64%，储存6 h后活细胞率明显降低(图3)。

2.3 倍增时间 两种细胞生长曲线见图4，5。未冻存的脐带间充质干细胞在0-4 ℃储存0，6，12，24 h后细胞倍增时间分别为20.2，25.92，30.35，31.4 h；冻存复苏的脐带间充质干细胞在0-4 ℃储存0，6，12，24 h后细胞倍增时间分别为21.31，32.02，43.94，46.87 h，随着储存时间的延长，间充质干细胞倍增时间不断增加，冻存复苏的间充质干细胞与未冻存的间充质干细胞相比，倍增时间均较长。

2.4 细胞克隆率 Giemsa染色后能够清晰看到形成的细胞克隆团，随着存储时间的延长，克隆团数量随之减少。未冻存的脐带间充质干细胞0-4 ℃储存12 h内克隆形成率在89%以上，储存12 h后细胞克隆团数量明显减少，储存24 h后只能看到少量着色较深的克隆团(图6)。冻存复苏的脐带间充质干细胞0-4 ℃储存6 h内克隆形成率在80%以上，与未冻存的间充质干细胞形成的克隆相比，克隆团也较小，储存6 h后细胞克隆团数量明显减少，24 h后仍具有克隆形成能力的细胞更少(图7)。

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引言

干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，在适宜的体外培养条件下能够稳定增殖并保持干性^[1-2]，且便于体外操作，是用于细胞替代治疗的理想种子细胞^[3-4]。围产期脐带、胎盘来源间充质干细胞因其取材方便，操作简单，对供者无伤害，细胞比较原始，增殖分化能力强等优点^[5]，越来越受研究者的青睐，并且大量的基础研究表明，这类间充质干细胞相对于其他来源的间充质干细胞免疫原性更低^[6-7]，具有免疫调节作用，在临床应用中没有明显的免疫排斥反应和不良反应，证明了其在疾病治疗中的安全性和有效性^[8-10]。随着对干细胞基础和临床研究的不断深入，间充质干细胞在疾病治疗中的优势越来越显著，应用范围越来越广。

目前，全国多家医院都在积极开展间充质干细胞临床治疗研究，2015年，国家卫生计生委和食品药品监督总局共同制定并发布了《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则》^[11-12]、《干细胞临床研究管理办法》等文件^[13-14]，政府的大力支持和监管部门监管力度的加强，将极大的促进干细胞治疗的临床研究，推动干细胞产业发展。未来，间充质干细胞在疾病治疗中的应用不断增多，干细胞治疗方法将成为医院常用的治疗措施^[15-17]。干细胞疗法与常规药物不同，细胞在体外存活时间有限，并且对运输方式也有较严格的要求，目前尚未见关于运输、储存时间对间充质干细胞活性影响的相关研究报道。

现在用于临床的间充质干细胞都是制备完成后尽快回输给患者，并没有明确的暂存条件和时间限制，无法保证细胞的最佳质量和治疗效果，甚至不能确保治疗的安全性和一致性。为此，实验主要探索脐带间充质干细胞制备后低温储存时间对细胞活性的影响，以及脐带间充质干细胞的最佳回输时间。

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材料方法

1.1 设计 间充质干细胞的培养、复苏及细胞活性鉴定。

1.2 时间及地点 实验于2016年6月至2017年5月在云南舜喜再生医学工程有限公司云南省干细胞库完成。

1.3 材料 脐带间充质干细胞(云南省干细胞库提供)；间充质干细胞培养基(北京百乐通公司)；DPBS(BI公司)；重组胰酶(Gibco公司)；锥虫蓝、姬姆萨染液、甲醇等均为国产试剂。

1.4 方法

1.4.1 脐带间充质干细胞的培养与复苏 ①取生长状态良好的第3代脐带间充质干细胞，胰酶消化后用生理盐水重悬，1 200 r/min离心5 min去上清，加入40 mL生理盐水重悬细胞，100 μm滤网过滤后计数，再次离心去除上清，加入适量生理盐水重悬细胞，调整细胞浓度为3×10⁸ L^-1，置于0-4 ℃冰箱保存；②取冻存于-196 ℃的细胞冻存管于37 ℃水浴，不断晃动使管中溶液迅速融化，此步骤应在3 min内完成，将溶液倒至生理盐水中，混匀，离心弃上清后用生理盐水重悬，100 μm滤膜过滤后计数，再次离心去除上清，加入适量生理盐水重悬细胞，调整细胞浓度为3×10⁸ L^-1，置于0-4 ℃冰箱保存。

1.4.2 观察细胞形态 分别于0，6，12，24 h从0-4 ℃冰箱取出细胞样品，接种于24孔板中，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂、饱和湿度培养箱静置培养，以后每24 h用普通光学显微镜观察并拍照。

1.4.3 检测活细胞率 分别于0，6，12，24，36，48 h从0-4 ℃冰箱取出两种细胞悬液，取50 μL于1.5 mL离心管中，加入5 μL 0.4%锥虫蓝，混匀后取20 μL加入细胞计数板，用全自动细胞计数仪计算活细胞率，绘制柱状图，分析活细胞率与储存时间的关系。

1.4.4 检测倍增时间 分别于0，6，12，24 h从0-4 ℃冰箱取出两种细胞悬液，以每孔2×10⁴个细胞接种至24孔板中，每孔加1 mL间充质干细胞培养基，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂、饱和湿度培养箱中培养，24 h后开始计数，以后每隔24 h计数1次，每次取3个孔，连续计数10 d，根据细胞计数结果，绘制生长曲线，计算细胞倍增时间。

倍增时间(Td)=T×[lg2/lg(Nt2/Nt1)]。T=t2-t1，Nt1是对数增殖期起始时间点的细胞数；Nt2是对数增殖末期的细胞数。

1.4.5 检测细胞克隆率 分别于0，6，12，24 h从0-4 ℃冰箱取出两种细胞悬液，梯度稀释调整细胞浓度接种至10 cm细胞培养皿中，每皿接种200个细胞，每皿加入10 mL间充质干细胞培养基，“十”字形缓慢晃动培养皿，使细胞均匀分布，将培养皿置于37 ℃、体积分数为5%CO₂、饱和湿度培养箱中培养，培养过程中在显微镜下观察，根据细胞克隆团的形成情况应在3周内取出，去培养基，DPBS清洗3次，加入5 mL甲醇固定15 min，去固定液，加入1 mL Giemsa染色1，混匀，1 min后加入2 mL Giemsa染色2，混匀后室温染色10 min，然后用流水缓慢洗去染色液，晾干，计数大于10个细胞的克隆数，计算克隆形成率。克隆形成率=(克隆数/接种细胞数)×100%。

1.5 主要观察指标 各时间点脐带间充质干细胞的细胞形态、细胞数量、活细胞比率、倍增时间及细胞克隆率。

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讨论

社会的竞争越来越激烈和人们的生活压力越来越大，加之社会人口老龄化不断加重，代谢性疾病、消化性疾病、退行性病变、肿瘤等慢性病的发病率不断升高，现有的医疗技术针对这些疾病缺少有效的治疗方案，干细胞具备的自我复制能力和多向分化潜能为这些疾病的治疗带来了希望^[18-20]。近几年利用干细胞特别是间充质干细胞治疗疾病的研究越来越多，治疗的疾病种类不断增加，极大的鼓舞了医生对于多种疾病治疗的信心，同时也为许多患者带来了希望^[21-23。目前研究证明干细胞能治疗的疾病种类繁多，包括心肌梗死、脊髓损伤、肝硬化、糖尿病等多种疾病，甚至有望治疗目前不可治愈的疾病、疑难杂症及神经退行性疾病^[24-26]，干细胞除了在疾病的治疗方面具有巨大作用外，其在抗衰老、调节免疫力、缓解亚健康、美容等方面也表现出了巨大的优势^[27-30]。

干细胞治疗产品不比药物产品能够长期保存，必须保证干细胞的存活状态才能在体内发挥治疗作用，而且目前并不是全国各地都建立了干细胞制备机构，为了使干细胞治疗技术造福更多患者，干细胞产品不可避免的需要长途运输，因此，保障干细胞产品在运输过程的细胞活性十分重要。

生物样本在较低温度下可以保持低代谢状态，而在没有冻存保护剂的情况下溶液结冰又会刺破细胞膜^[31]，0-4℃的冷藏条件为目前常用低温运输箱所能保持的温度，因此实验首选0-4 ℃作为冷藏保存温度，初步探索了脐带间充质干细胞在冷藏保存条件下储存时长对细胞活性的影响。实验结果显示，细胞悬液在0-4 ℃的环境下保存，最好在6 h或12 h内完成细胞回输，如果运输距离较长，应优先选用未冻存的间充质干细胞。为保证更长距离的运输要求，应进一步探索其他保存条件，人血白蛋白、复合氨基酸、维生素等添加剂都具有较好的细胞保护作用或能够为细胞提供营养，在后续实验中会继续探索细胞保存和运输的方式，延长保存时间，提高细胞活性。

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