巴戟天糖链对血管内皮祖细胞增殖分化和旁分泌的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0444

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (5): 736-741.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0444

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巴戟天糖链对血管内皮祖细胞增殖分化和旁分泌的作用

封亚丽，何红涛，苗华为，段慧杰，董燕平，耿彬，张铁军

河北省中医院心血管科，河北省石家庄市 050011

修回日期:2017-10-14 出版日期:2018-02-18 发布日期:2018-02-18
通讯作者: 何红涛，硕士，主任医师，河北省中医院心血管科，河北省石家庄市 050011
作者简介:封亚丽，女，1982年生，河北省鹿泉市人，硕士，主治医师，主要从事中医内科心血管方向研究。
基金资助:
河北省中医药类科研计划课题(2014024)

Effects of morinda officinalis oligosaccharide on the proliferation, differentiation and paracrine of vascular endothelial progenitor cells

Feng Ya-li, He Hong-tao, Miao Hua-wei, Duan Hui-jie, Dong Yan-ping, Geng Bin, Zhang Tie-jun

Department of Cardiovascular Medicine, Hebei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Shijiazhuang 050011, Hebei Province, China

Revised:2017-10-14 Online:2018-02-18 Published:2018-02-18
Contact: He Hong-tao, Master, Chief physician, Department of Cardiovascular Medicine, Hebei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Shijiazhuang 050011, Hebei Province, China
About author:Feng Ya-li, Master, Attending physician, Department of Cardiovascular Medicine, Hebei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Shijiazhuang 050011, Hebei Province, China
Supported by:
the Scientific Research Plan for Traditional Chinese Medicine in Hebei Province, No. 2014024

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
血管内皮祖细胞：是一类能增殖、迁移并直接分化为成熟血管内皮细胞的前体细胞，它与造血干细胞同起源于胚外中胚层卵黄囊的血岛，由血液/血管母细胞发育而来。在成人体内主要分布于外周血、骨髓和脾等。机体在需要时能在血管内皮生长因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子等细胞因子的作用下从骨髓增殖、迁移、归巢到血管受损部位参与修复活动。
巴戟天糖链：是巴戟天醇提物的主要有效成分，它能增加缺血心肌血管内皮生长因子的表达、促进鸡胚绒毛尿囊膜毛细血管生成等，血管生成基因芯片结果显示巴戟天糖链可显著上调多种促血管生成基因mRNA的表达，下调多种抑制血管生成基因mRNA的表达，对缺血区组织的血管新生能产生促进作用。

摘要
背景：巴戟天糖链是巴戟天醇提物的主要有效成分，其促进缺血区组织的血管生成作用十分明确，而机制不明。目前认为血管内皮的修复主有两种方式：血管内皮细胞分裂而来或者是由末梢血液中具有分化功能的血管内皮祖细胞分化而来。实验通过研究巴戟天糖链与血管内皮祖细胞生物学功能是否存在联系，解释巴戟天糖链促进血管生成机制，为研发药物提供实验证据。
目的：探讨巴戟天糖链对血管内皮祖细胞增殖分化和旁分泌的影响。
方法：从健康人的外周血中分离培养血管内皮祖细胞，将血管内皮祖细胞分为对照组(不含巴戟天糖链)和实验组(含质量浓度为0.15 g/L巴戟天糖链)，在体外培养48 h，通过荧光染料染色检测血管内皮祖细胞的增殖情况，流式细胞仪检测血管内皮祖细胞中CD31阳性表达比例，酶联免疫吸附法检测培养基中血管内皮生长因子、基质细胞衍生因子1和白细胞介素8水平。
结果与结论：①血管内皮祖细胞表面标志物CD34、CD133和VEGFR-2均为阳性的比例为(84.72±4.34)%；②经过质量浓度为0.15 g/L巴戟天糖链培养48 h后，实验组中血管内皮组细胞增殖率和CD31阳性表达比例明显高于对照组(P < 0.05)；③实验组中血管内皮生长因子、基质细胞衍生因子1和白细胞介素8水平明显高于对照组(P < 0.05)；④结果表明，巴戟天糖链可以促进血管内皮祖细胞的增殖和分化，同时还可以诱导血管内皮祖细胞通过旁分泌途径释放血管内皮生长因子、基质细胞衍生因子1和白细胞介素8等细胞活性因子，对于心肌缺血性疾病具有潜在的治疗价值。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-9617-3456(封亚丽)

关键词: 巴戟天, 血管内皮祖细胞, 增殖, 分化, 旁分泌, 血管内皮生长因子, 干细胞, 培养, 基质细胞衍生因子1

Abstract:

BACKGROUND: Morinda officinalis oligosaccharide is the main active ingredient of morinda officinalis extract, which can promote the angiogenesis of ischemic tissue, but the mechanism is unknown. At present, there are two ways for endothelial repair: vascular endothelial cell division or differentiation from vascular endothelial progenitor cells in the peripheral blood. Here, we attempted to explain the pro-angiogenesis mechanism of morinda officinalis oligosaccharide by exploring whether there is a correlation between morinda officinalis oligosaccharide and the biological function of vascular endothelial progenitor cells, thereby providing experimental reference for new drug development.
OBJECTIVE: To observe the effect of morindae officinalis oligosaccharide on the proliferation, differentiation and paracrine of vascular endothelial progenitor cells.
METHODS: Vascular endothelial progenitor cells were isolated from healthy human peripheral blood, and divided into two groups: control group (without morindae officinalis oligosaccharide) and experimental group (with 0.15 g/L morindae officinalis oligosaccharide), followed by 48 hours of in vitro culture. The proliferation of vascular endothelial progenitor cells was tested by fluorescent staining; the ratio of vascular endothelial progenitor cells expressing CD31 was detected by flow cytometry; and the levels of vascular endothelial growth factor, stromal cell-derived factor 1 and interleukin 8 were analyzed by enzyme-linked immunosorbent method.
RESULTS AND CONCLUSION: The percentage of vascular endothelial cells expressing CD34, CD133 or VEGFR- 2 was (84.72±4.34)%. After 48 hours of culture by 0.15 g/L morindae officinalis oligosaccharide, the proliferation rate and the positive expression of CD31 in the experimental group were significantly higher than those in the control group (P < 0.05). The levels of vascular endothelial growth factor, stromal cell-derived factor 1 and interleukin 8 in the experimental group were also higher than those in the control group (P < 0.05). To conclude, morindae officinalis oligosaccharide can promote the proliferation and differentiation of vascular endothelial progenitor cells, and meanwhile, it can stimulate the release of vascular endothelial growth factor, stromal cell-derived factor 1 and interleukin 8 from vascular endothelial progenitor cells through the paracrine pathway. Consequently, it is a potential drug for myocardial ischemic diseases.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Morinda, Endothelial Cells, Cell Proliferation, Cell Differentiation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

封亚丽，何红涛，苗华为，段慧杰，董燕平，耿彬，张铁军. 巴戟天糖链对血管内皮祖细胞增殖分化和旁分泌的作用[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(5): 736-741.

Feng Ya-li, He Hong-tao, Miao Hua-wei, Duan Hui-jie, Dong Yan-ping, Geng Bin, Zhang Tie-jun. Effects of morinda officinalis oligosaccharide on the proliferation, differentiation and paracrine of vascular endothelial progenitor cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(5): 736-741.

图/表（结果） 1

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引言

心肌缺血是中老年的常见病和多发病，其病因复杂，临床表现多样，其中包括心肌梗死、心绞痛和冠状动脉痉挛等^[1-2]。心肌缺血导致心肌细胞无法有效的进行血-氧交换并最终造成心肌细胞的不可逆性损伤^[3]。近年来的研究表明，存在于体循环中的血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)可以有效减轻急性缺血再灌注损伤这一病理生理过程对心肌细胞的损伤^[4]。血管内皮祖细胞属于分化能力较弱的一种成体干细胞，现已证明是来源于骨髓的成熟血管内皮细胞前体，具有干细胞的特性即自我更新能力和分化能力，可以在血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等信号和缺血缺氧等条件刺激下分化为血管内皮细胞，并通过旁分泌作用释放细胞因子以减轻缺氧/复氧对心肌细胞造成的损伤^[5-7]。

巴戟天是一种茜草科植物，主要出产于中国的广东、广西和部分东南亚国家，是中国的“四大南药”之一。该药最早记载出现在《神农本草经》中，其后的多部典籍如《本草经集注》等均有记载，其根部入药，具有治疗阳痿遗精、肾虚兼有风湿之证、宫冷不孕和益气养血等功效，并列为上品^[8]。有研究表明巴戟天能增加缺血心肌血管内皮生长因子的表达、促进鸡胚绒毛尿囊膜毛细血管生成等，对缺血区组织的血管新生能产生促进作用，对脐静脉缺氧/复氧模型具有明确的保护作用，而巴戟天发挥作用的有效成分被认为是一类寡糖类化合物——巴戟天糖链^[9-11]。这种寡糖类化合物具有促进男性精子发育成熟、调节人体免疫功能、促进血管生长和减轻氧化应激对心肌损伤的作用^[12-13]。

实验通过研究巴戟天糖链在体外对血管内皮祖细胞的作用，分析巴戟天糖链发挥生物学活性的可能机制和途径，为研发新的抗心肌缺血药物提供细胞学实验基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞学实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年6至12月在河北医科大学分子生物学研究室完成。

1.3 材料

1.3.1 样本 经河北省中医院伦理委员会批准后，征得健康自愿者本人同意的情况下，取得健康自愿者血液20 mL。

1.3.2 实验药品、试剂及仪器 巴戟天(一等品)购买于北京安国药材市场；胎牛血清购买于美国Hyclone公司；M199培养基和PBS购买于美国GE公司；血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、甘氨酸、胰酶和TritonX-100购买于美国Sigma-Aldrich公司；5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2’-deoxyuridine，EdU)和4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)购买于碧云天公司；血管内皮生长因子、基质细胞衍生因子1(stromal cell-derived factor-1，SDF-1)和白细胞介素8 (Interleukin-8， IL-8)酶联免疫吸附检测试剂盒购买于美国ebioscience公司；Percoll分离液购买于美国GE公司；CD31-FITC、CD34-PE、CD133-APC和VEGFR-2-FITC购买于美国BD公司；培养瓶和细胞培养板购买于美国Corning公司；多聚甲醛购买于国药集团北京分公司；倒置相差显微镜CX51购买于日本Olympus公司；离心机购买于湘仪公司；FACSCalibur流式细胞仪购买于美国BD公司；550酶标仪和脱色摇床购买于美国Bio-Rad公司；CO₂培养箱购买于美国Thermo公司。

1.4 实验方法

1.4.1 巴戟天糖链的制备 巴戟天糖链制备过程参照文献[14-15]进行，取250 g巴戟天在1 L蒸馏水中煮沸2 h，将上清过滤后采用低压干燥法获得干燥粉末约40 g。取15 g粉末，分次用体积分数为70%乙醇在90 ℃水浴中煮60 min，通过旋蒸仪回收乙醇后，获取浓缩液。用适量的蒸馏水稀释后，分别用乙醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，弃去上述溶剂中可溶性部分，将剩余的水溶部分用层析柱方法分离收集巴戟天糖链，经鉴定纯度为98.2%。将提纯的巴戟天糖链用M199溶解后配置成质量浓度为0.15 g/L的巴戟天糖链溶液，经0.22 μm滤膜过滤除菌后备用。

1.4.2 血管内皮祖细胞原代培养及鉴定 无菌条件下，在20 mL健康人末梢血中加入等体积的Percoll分离液，放入50 mL离心管中进行1 500 r/min离心20 min，吸取液面交界处的有核细胞，使用PBS稀释后1 500 r/min离心5 min。弃去上清液，将离心后的细胞在含体积分数为10%胎牛血清、10 μg/L血管内皮生长因子和3 μg/L碱性成纤维细胞生长因子的M199培养基中培养24 h后去除未贴壁的细胞，对贴壁细胞继续培养7 d。将细胞消化后，1 500 r/min离心5 min，弃去上清液，使用PBS清洗2次，重悬细胞制备单细胞悬液并调整细胞浓度为1×10⁹ L^-1，取200 μL细胞悬液，分别加入CD34-PE、CD133-APC和VEGFR-2-FITC流式抗体各5 μL，避光室温孵育20 min后上流式细胞仪检测。

1.4.3 巴戟天糖链促进血管内皮祖细胞的增殖 将培养 7 d的血管内皮祖细胞用胰酶消化后，按照4×10³个/孔的细胞量接种到96孔板中，加入含体积分数为10%胎牛血清、10 μg/L血管内皮生长因子和3 μg/L碱性成纤维细胞生长因子的M199培养基培养8 h，待细胞完全贴壁后，将细胞分为2组，对照组继续使用含体积分数为10%胎牛血清、10 μg/L血管内皮生长因子和3 μg/L碱性成纤维细胞生长因子的M199培养基，实验组在对照组培养基中加入巴戟天糖链，质量浓度为0.15 g/L，培养48 h，每组均设置5个复孔。在上述2组中加入EDU染色反应液并培养6 h，弃培养液，PBS清洗细胞1次或2次，每次5 min。每孔加入40 g/L多聚甲醛固定30 min，然后用2 g/L甘氨酸孵育5 min。PBS清洗3次后，加入含0.5% TritonX-100的PBS，脱色摇床孵育10 min。两组加入EdU染色反应液，避光，室温脱色摇床孵育30 min。用含0.5% TritonX-100的PBS清洗3次，进行DAPI染色封固，在荧光显微镜下观察细胞增殖的状态。随机选取5个高倍镜视野，计算增殖比例=EDU染色细胞数/细胞总数×100%。

1.4.4 巴戟天糖链促进血管内皮祖细胞的分化 将培养7 d的血管内皮祖细胞接种于6孔板内，加入含体积分数为10%胎牛血清、10 μg/L血管内皮生长因子和3 μg/L碱性成纤维细胞生长因子的M199培养基，待细胞完全贴壁后，将细胞分为2组，对照组使用单纯的M199培养基，实验组在对照组培养基中加入巴戟天糖链，质量浓度为0.15 g/L，每组均设置5个复孔。留取各孔中上清液用于检测细胞因子水平。在对照组和实验组分组培养48 h后，胰酶消化，1 500 r/min离心5 min后弃去上清液，使用PBS清洗2次，重悬细胞制备单细胞悬液并调整细胞浓度为1×10⁹ L^-1，取200 μL细胞悬液，加入CD31-FITC流式抗体各5 μL，避光室温孵育20 min后上流式细胞仪检测。

1.4.5 巴戟天糖链促进血管内皮祖细胞旁分泌血管内皮生长因子、基质细胞衍生因子1和白细胞介素8 取血管内皮祖细胞贴壁后和分组培养48 h后的培养基各200 μL，通过酶联免疫吸附法检测培养基中血管内皮生长因子、基质细胞衍生因子1和白细胞介素8水平，方法参照试剂盒说明书进行。

1.5 主要观察指标 ①流式细胞仪检测血管内皮祖细胞表面抗原CD34、CD133和VEGFR-2表达；②EDU染色检测血管内皮祖细胞的增殖能力；③流式细胞仪检测血管内皮细胞成熟标记物CD31的表达；④ELISA法检测培养基中血管内皮生长因子、基质细胞衍生因子1和白细胞介素8水平。

1.6 统计学分析 采用SPSS 16.5统计软件。计量资料以 x(_)±s表示，多组间的比较采用单因素方差分析，两组间比较采用SNK检验(q检验），P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

血管内皮祖细胞是一种具备分化潜能的前体细胞，在一定条件下可以诱导分化为血管内皮细胞。最早发现血管内皮祖细胞的是日本学者Asahara^[16]，此后的研究证明血管内皮祖细胞在心肌缺血的情况下可以被迅速的动员，从骨髓进入到外周末梢血中，归巢至缺血损伤的心肌组织，并可以分化为成熟的血管内皮细胞，参与缺血组织的修复。

有研究显示，如果将体外培养的血管内皮祖细胞回输入患者体内或者通过注射方式接种于受损组织可以取得满意的临床治疗效果^[17]，但是由于人体内的血管内皮祖细胞数量有限，即使被从骨髓动员到外周血循环中，其转移、迁徙、进入受损组织的数量远远不能满足治疗的需求。因此，寻找促进血管内皮祖细胞增殖和分化的有效方法对于心肌缺血等疾病具有重要的治疗意义^[18-20]。

巴戟天出产于中国东南沿海的热带地区，属于茜草科巴戟属植物，其有效成分主要来自于肉根部，《中国药典》也从1963年开始收录巴戟天并沿用至今^[8^，¹¹^，^21-23]。巴戟天的化学成分复杂，主要包括了蒽醌类、寡糖类、多糖类、环烯醚萜类和有机酸类等，目前认为其发挥药理学作用的主要成分为寡糖类物质^[24-25]。巴戟天糖链具有多种重要的生理学和药理学活性：细胞识别、信息传递、免疫功能调节、促进双歧杆菌生长、抗疲劳、抗自由基、影响内分泌、抗抑郁、抗应激及提高免疫功能、抗抑郁、抗骨质疏松、促进男性精子发育成熟、增强学习记忆与抗衰老等。而近期研究发现，巴戟天寡糖还可以增加缺血心肌血管内皮生长因子的表达，抑制低氧性损伤造成的心肌细胞和血管内皮细胞凋亡，促进鸡胚绒毛尿囊膜毛细血管生成等，血管生成基因芯片结果显示巴戟天糖链可显著上调多种促血管生成基因mRNA的表达，下调多种抑制血管生成基因mRNA的表达，对缺血区组织的血管新生能产生促进作用^[26-29]。在成熟的血管中，血管内皮细胞保持一种静止、非增殖状态，但在缺血缺氧、炎症、肿瘤等病理状态下，内皮细胞可以迁移并分裂^[30-31]。除了这种方式之外，血管内皮细胞还可以由末梢血中的内皮祖细胞分化而来，但由于内皮祖细胞数量较少，因此并不是修复受损血管内皮的主要方式。巴戟天寡糖对心血管的保护作用机制与其干预凋亡通路中的主要调节蛋白如Bcl-2，Bax和Caspase-3等低表达有关，而其对血管内皮细胞再生的作用仍不明确^[32-33]。

实验首先从成人末梢血中分离培养了血管内皮祖细胞，经过质量浓度为0.15 g/L的巴戟天糖链培养48 h后，血管内皮祖细胞增殖速度明显加快，而且血管内皮祖细胞中表达成熟血管内皮细胞表面标志物CD31的比例可达(42.2±3.1)%，这点充分说明巴戟天糖链可以促进血管内皮祖细胞增殖的同时诱导血管内皮祖细胞向成熟的血管内皮细胞分化，由此可见巴戟天糖链促进血管内皮再生及迁徙功能可能是通过诱导血管内皮祖细胞增殖和分化实现的。此外，有大量研究报道当心肌发生急性缺血再灌注损伤的过程中，外周血中的血管内皮祖细胞数量较正常人相比明显降低，同时也伴有血管内皮生长因子、基质细胞衍生因子1和白细胞介素8水平下降，而当心肌缺血症状得到缓解后，外周血中血管内皮生长因子、基质细胞衍生因子1和白细胞介素8水平有所回升^[34-36]。血管内皮祖细胞具有旁分泌功能早已得到证实，可以释放血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、基质细胞衍生因子1、粒细胞集落刺激因子和白细胞介素8等活性细胞因子，这些细胞因子不仅可以动员血管内皮祖细胞从骨髓中进入外周血，还可以促进血管内皮祖细胞增殖、分化、趋化和归巢^[37]。

血管内皮生长因子是目前已知的诱导血管内皮祖细胞向成熟血管内皮细胞分化的最重要细胞因子，血管内皮生长因子含量对于血管内皮祖细胞表达CD31起到重要促进作用，实验使用质量浓度为0.15 g/L巴戟天糖链培养48 h后，在培养基中血管内皮生长因子水平可达(65.9±1.9) ng/L，这一点说明巴戟天糖可以通过促进血管内皮祖细胞旁分泌途径释放血管内皮生长因子，并且促进血管内皮祖细胞向成熟血管内皮细胞的分化。

基质细胞衍生因子1是一种趋化因子，对于血管内皮祖细胞的趋化作用是其他细胞因子的10倍以上，血液中基质细胞衍生因子1水平升高有利于血管内皮祖细胞归巢，诱发血管内皮祖细胞与受损内皮黏附和血小板聚集，并抑制血管内皮祖细胞凋亡，在诊断和治疗心肌缺血性疾病中有着重要的临床意义。有研究报道心肌梗死后该区域基质细胞衍生因子1水平明显上升，这可能与其趋化血管内皮祖细胞至受损的心肌组织有关^[38]。实验发现巴戟天糖链可以有效促进血管内皮祖细胞分泌基质细胞衍生因子1，这一点对于诱导血管内皮祖细胞的迁徙和归巢有着重要的价值。

白细胞介素8也是一种趋化性细胞因子，可以通过激活CXCR2受体，磷酸化Ras和MAPK信号通路中的下游蛋白而介导血管内皮祖细胞的迁徙和增殖。实验组中白细胞介素8在培养基中的水平可达(38.3±0.6) ng/L，证明巴戟天糖链可以有效促进血管内皮祖细胞分泌白细胞介素8，而高水平的白细胞介素8又可以增强血管内皮祖细胞增殖、分化和趋化，对于修复受损的心肌组织发挥更强的作用。

虽然巴戟天糖链分离过程较为复杂，市场上也很难得到巴戟天糖链的成品，其远期的毒理和药理学作用也有待于观察，但在体外环境下巴戟天糖链促进血管内皮祖细胞增殖和分化作用十分明确，还可以刺激血管内皮祖细胞通过旁分泌作用释放血管内皮生长因子、基质细胞衍生因子1和白细胞介素8等细胞活性因子，对于心肌缺血性疾病有着潜在的治疗价值。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

巴戟天糖链对血管内皮祖细胞增殖分化和旁分泌的作用

Effects of morinda officinalis oligosaccharide on the proliferation, differentiation and paracrine of vascular endothelial progenitor cells

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