胚胎肝前体细胞与转化生长因子β1信号介导的肝星状细胞联合移植治疗急性肝损伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0440

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (5): 710-716.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0440

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胚胎肝前体细胞与转化生长因子β1信号介导的肝星状细胞联合移植治疗急性肝损伤

艾麦提•牙森，金鑫，陈梓昕，李德卫

重庆医科大学附属第一医院肝胆外科，重庆市 40001

修回日期:2018-01-02 出版日期:2018-02-18 发布日期:2018-02-18
通讯作者: 李德卫，博士，教授，研究生导师，重庆医科大学第一附属医院肝胆外科，重庆市 400016
作者简介:艾麦提?牙森，男，1990年生，新疆维吾尔自治区喀什人，维吾尔族，重庆医科大学在读硕士，主要从事普通外科、肝胆外科研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81470898)

Intrasplenic co-transplantation of fetal hepatic progenitor cells and transforming growth factor beta 1 induced hepatic stellate cells ameliorates acute liver injury

Aimaiti Yasen, Jin Xin, Chen Zi-xin, Li De-wei

Department of Hepatobiliary Surgery, First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China

Revised:2018-01-02 Online:2018-02-18 Published:2018-02-18
Contact: Li De-wei, M.D., Professor, Master’s supervisor, Department of Hepatobiliary Surgery, First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China
About author:Aimaiti Yasen, Studying for master’s degree, Department of Hepatobiliary Surgery, First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81470898

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
胚胎肝前体细胞：又称胚胎肝祖细胞，是早期胚胎(原肠胚期之前)或原始性腺中分离出来的一类细胞，可分化为机体各种类型细胞，具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能而成为组织工程和细胞替补治疗的主要来源细胞。
肝星状细胞：是肝脏内的一种间质细胞，占整个肝脏的8%-13%，定居在窦间隙，一般处于静止状态。在各种因素刺激下，表型发生改变，从静态细胞表型转化为具有增殖性、成纤维性和收缩性的肌成纤维细胞表型，参与肝纤维化、肝硬化、门静脉高压形成以及胚胎肝细胞的发育、增殖分化等病理生理过程。

摘要
背景：研究表明，移植的胚胎肝前体细胞在受体内大量增殖及长期存活困难，与转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)介导的肝星状细胞联合移植有望解决这一科学难题。
目的：观察TGF-β1介导的小鼠肝星状细胞与小鼠胚胎肝前体细胞联合移植对急性肝损伤的治疗作用。
方法：①建立慢病毒介导的稳定过表达TGF-β1基因的小鼠肝星状细胞株，通过细胞免疫荧光、qRT-PCR、western blotting法检测肝星状细胞转染目的基因情况；②体外培养小鼠胚胎肝前体细胞株mHPCs-E_14.5并以细胞免疫荧光染色法鉴定；③通过CCl4腹腔注射联合2/3肝切除构建急性肝损伤小鼠模型，然后进行mHPCs-E_14.5单独移植(mHPCs-E_14.5移植组)，mHPCs-E_14.5与mHSCs-pHBLV-CMVIE-TGF-β1联合移植(过表达TGF-β1联合移植组)，mHPCs-E_14.5与mHSCs-pHBLV-CMVIE-GFP联合移植(对照联合移植组)；④在肝切除后14 d，共聚焦免疫荧光检测各组小鼠脾实质内ALB、CK19、a-SMA阳性表达，全自动生化分析仪检测小鼠血清谷丙转移酶、谷草转移酶活性。
结果与结论：①成功建立稳定过表达TGF-β1基因的小鼠肝星状细胞株，与空载对照组相比，慢病毒mHSCs-pHBLV-CMVIE-TGF-β1组目的基因TGF-β1、α-SMA表达明显增高(P < 0.01)；②mHPCs-E_14.5细胞株大量表达AFP，微弱表达ALB和CK19，提示该细胞株为胚胎肝前体细胞；③mHPCs-E_14.5移植组脾实质内存在少量CK19阳性细胞和ALB阳性细胞；对照联合移植组脾实质内存在少量CK19阳性细胞、α-SMA阳性细胞及较多的ALB阳性细胞，而过表达TGF-β1联合移植组存在大量CK19阳性细胞、α-SMA阳性细胞，少量ALB阳性细胞；④细胞移植后血清谷丙转移酶及谷草转移酶有所下降，过表达TGF-β1联合移植组下降更明显(P < 0.05)；⑤结果提示，移植的胚胎肝前体细胞在脾实质内定植并分化为肝细胞和胆管细胞，TGF-β1信号介导的肝星状细胞诱导胚胎肝前体细胞向胆管细胞分化而且能有效促进小鼠急性肝损伤的修复过程。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-0692-1594(艾麦提•牙森)

关键词: 肝星状细胞, 转化生长因子β1, 胚胎肝前体细胞, 急性肝损伤, 联合细胞移植, 脾脏, 干细胞, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Difficulty in long-time survival and continuous proliferation is the main problem for transplanted fetal hepatic progenitor cells and co-transplantation with transforming growth factor beta 1 (TGF-β1)-induced hepatic stellate cells may be a promising way to solve this scientific obstacle.
OBJECTIVE: To explore the therapeutic effects of co-transplantation of fetal hepatic progenitor cells and TGF-β1-induced hepatic stellate cells on acute liver injury in mice.
METHODS: Over-expression vector pHBLV-CMVIE-TGF-β1 was infected to mouse hepatic stellate cells and transfection efficiency was detected by immunocytochemistory, western blot and qRT-PCR. Hepatic progenitor cells, mHPCs-E_14.5, were cultured and identified by immunofluorescence in vitro. The mouse model of acute liver injury was established by intraperitoneal injection of CCl₄ in combination with 2/3 partial hepatectomy, followed by mHPCs-E_14.5 transplantation, co-transplantation of mHPCs-E_14.5 and mHSCs-pHBLV-CMVIE-TGF-β1 (experimental co-transplantation group) or co-transplantation of mHPCs-E_14.5 and mHSCs-pHBLV-CMVIE-GFP (control co-transplantation group) for cell transplantation assay. Confocal immunofluorescence staining against CK19, ALB, a-SMA was performed to analyze the engraftment and differentiation of transplanted cells in the splenic parenchyma 14 days post-transplantation; serum alanine transferase and aspartate transferase levels were monitored using an automatic biochemistry analyzer.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) A hepatic stellate cell line that over-expressing TGF-β1 was successfully established and expression levels of TGF-β1 and α-smooth muscle actin were efficiently up-regulated in the over-expression group (P < 0.01). (2) mHPCs-E_14.5 expressed massive AFP and low levels of ALB and CK19, confirming that this cell line was in complete conformity with fetal hepatic progenitor cells in vitro. (3) CK19 and ALB positive cells existed in the splenic parenchyma in mHPCs-E_14.5 transplantation group. Highly expressed ALB but less expressed α-SMA and CK19 were observed in the control co-transplantation group, while massive CK19 and a-SMA positive cells as well as less level of ALB positive cells existed in the experimental co-transplantation group. Serum alanine transferase and aspartate transferase levels were decreased remarkably after cell transplantation, and moreover, the decrease was more obvious in the experimental co-transplantation group (P < 0.05). Overall, transplanted fetal hepatic progenitor cells engraft and differentiate into hepatocytes and cholangiocytes in the splenic parechyma successfully in vivo. Importantly, hepatic stellate cells induced by TGF-β1 promote the differentiation of fetal hepatic progenitor cells into cholangiocytes and accelerate recovery from CCl₄/partial hepatectomy induced acute liver injury.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Hepatic Stellate Cells, Stromal Cells, Liver Diseases, Cell Transplantation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

艾麦提•牙森，金鑫，陈梓昕，李德卫. 胚胎肝前体细胞与转化生长因子β1信号介导的肝星状细胞联合移植治疗急性肝损伤[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(5): 710-716.

Aimaiti Yasen, Jin Xin, Chen Zi-xin, Li De-wei. Intrasplenic co-transplantation of fetal hepatic progenitor cells and transforming growth factor beta 1 induced hepatic stellate cells ameliorates acute liver injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(5): 710-716.

图/表（结果） 2

2.1 成功建立pHBLV-CMVIE-GFP及pHBLV-CMVIE- TGF-β1稳定感染的小鼠肝星状细胞 将pHBLV- CMVIE-GFP和pHBLV-CMVIE-TGF-β1病毒浓缩液感染携带绿色荧光GFP标记的mHSCs-T25细胞，3 d后倒置荧光显微镜下观察，感染效率约为50%。进行嘌呤霉素加压筛选，7 d左右形成稳定表达绿色荧光蛋白的稳定集落，见图1。挑取单克隆扩大培养后，稳定表达TGF-β1基因的小鼠肝星状细胞株建立，该细胞株携带绿色荧光蛋白。

2.2 慢病毒pHBLV-CMVIE-GFP和pHBLV-CMVIE- TGF-β1感染mHSCs-T25细胞的验证 qRT-PCR结果显示，mHSCs-pHBLV-CMVIE-TGF-β1过表达组中目的基因TGF-β1、α-SMA表达量分别为mHSCs-pHBLV-CMVIE- GFP对照组的5.24倍和3.15倍(P < 0.01)，见图2A。Western blotting结果显示，mHSCs-pHBLV-CMVIE-TGF-β1组中TGF-β1、a-SMA表达水平明显高于对照组(P < 0.01)，与qRT-PCR结果一致，见图2B，说明TGF-β1基因稳定过表达在小鼠肝星状细胞株中。

2.3 细胞免疫荧光法鉴定mHPCs-E_14.5细胞株 mHPCs-E_14.5细胞在倒置荧光显微镜下观察可见细胞大量表达AFP，同时微弱表达ALB，CK19，提示mHPCs-E_14.5细胞株为小鼠胚胎肝前体细胞而且体外未发生分化，见图3。

2.4 实验动物数量分析 参加实验15只C57BL/6小鼠，均进入结果分析，中途无脱落。

2.5 共聚焦免疫荧光法检测移植细胞在肝脾中的定植并分化 CK19、ALB、α-SMA分别为胆管细胞、肝细胞和活化肝星状细胞特异性分子标志物，在小鼠脾脏内无表达，可用来检测移植细胞在肝脾实质内的定植并分化。在mHPCs-E_14.5移植组小鼠脾实质内可见少量ALB阳性细胞和CK19阳性细胞；在对照联合移植组小鼠脾实质内可见少量α-SMA阳性细胞和CK19阳性细胞，而ALB阳性细胞较其他两组明显增多(P < 0.05)；在过表达TGF-β1联合移植组小鼠脾实质内可见少量ALB阳性细胞，而出现大量α-SMA阳性细胞和CK19阳性细胞集落(P < 0.05)，见图4。上述结果表明，移植的细胞在脾实质内定植，mHPCs-E_14.5与mHSCs-pHBLV-CMVIE-GFP联合移植促进mHPCs-E_14.5向肝细胞分化，而与mHSCs-pHBLV-CMVIE-TGF-β1联合移植促进其向胆管细胞分化。

2.6 细胞移植后血清谷丙转移酶、谷草转移酶活性 肝切除14 d后，血清谷丙转移酶、谷草转移酶活性开始下降至正常，而过表达TGF-β1联合移植组下降更为明显，与mHPCs-E_14.5移植组、对照联合移植组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图5。

参考文献

[1] Zeldenrust S, Gertz M, Uemichi T, et al. Orthotopic liver transplantation for hereditary fibrinogen amyloidosis. Transplantation. 2003;75(4):560-561.

[2] Rhim JA, Sandgren EP, Palmiter RD, et al. Complete reconstitution of mouse liver with xenogeneic hepatocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 1995;92(11):4942-4946.

[3] Pietrosi G, Vizzini GB, Gruttadauria S, et al. Clinical applications of hepatocyte transplantation. World J Gastroenterol. 2009;15(17):2074-2077.

[4] Ishii T, Yasuchika K, Machimoto T, et al. Transplantation of embryonic stem cell-derived endodermal cells into mice with induced lethal liver damage. Stem Cells. 2007;25(12): 3252-3260.

[5] Yap KK, Dingle AM, Palmer JA, et al. Enhanced liver progenitor cell survival and differentiation in vivo by spheroid implantation in a vascularized tissue engineering chamber. Biomaterials. 2013;34(16):3992-4001.

[6] Franco OE, Shaw AK, Strand DW, et al. Cancer associated fibroblasts in cancer pathogenesis. Semin Cell Dev Biol. 2010;21(1):33-39.

[7] Folkman J, Kalluri R. Cancer without disease.Nature. 2004; 427(6977):787.

[8] Gordillo M, Evans T, Gouon-Evans V. Orchestrating liver development. Development. 2015;142(12):2094-2108.

[9] Suzuki K, Tanaka M, Watanabe N, et al. p75 Neurotrophin receptor is a marker for precursors of stellate cells and portal fibroblasts in mouse fetal liver. Gastroenterology. 2008;135(1): 270-281.e3.

[10] Tanimizu N, Saito H, Mostov K, et al. Long-term culture of hepatic progenitors derived from mouse Dlk+ hepatoblasts. J Cell Sci. 2004;117(Pt 26):6425-6434.

[11] Cheng K, Benten D, Bhargava K, et al. Hepatic targeting and biodistribution of human fetal liver stem/progenitor cells and adult hepatocytes in mice. Hepatology. 2009;50(4):1194-1203.

[12] Chen L, Davis GJ, Crabb DW, et al. Intrasplenic transplantation of isolated periportal and perivenous hepatocytes as a long-term system for study of liver-specific gene expression. Hepatology. 1994;19(4):989-998.

[13] Martins PN, Theruvath TP, Neuhaus P. Rodent models of partial hepatectomies. Liver Int. 2008;28(1):3-11.

[14] Sancho-Bru P, Najimi M, Caruso M, et al. Stem and progenitor cells for liver repopulation: can we standardise the process from bench to bedside. Gut. 2009;58(4):594-603.

[15] Duncan AW, Dorrell C, Grompe M. Stem cells and liver regeneration. Gastroenterology. 2009;137(2):466-481.

[16] Zhang W, Tucker-Kellogg L, Narmada BC, et al. Cell-delivery therapeutics for liver regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 2010; 62(7-8):814-826.

[17] Kalinichenko VV, Bhattacharyya D, Zhou Y, et al. Foxf1 +/- mice exhibit defective stellate cell activation and abnormal liver regeneration following CCl4 injury. Hepatology. 2003; 37(1): 107-117.

[18] Onitsuka I, Tanaka M, Miyajima A. Characterization and functional analyses of hepatic mesothelial cells in mouse liver development. Gastroenterology. 2010;138(4):1525-1535.

[19] Yasui O, Miura N, Terada K, et al. Isolation of oval cells from Long-Evans Cinnamon rats and their transformation into hepatocytes in vivo in the rat liver. Hepatology. 1997;25(2): 329-334.

[20] Weis SM, Cheresh DA. Tumor angiogenesis: molecular pathways and therapeutic targets. Nat Med. 2011;17(11): 1359-1370.

[21] Liu D, Xiao H, Du C, et al. The effect of fibroblast activation on vascularization in transplanted pancreatic islets. J Surg Res. 2013;183(1):450-456.

[22] Cai J, Ito M, Nagata H, et al. Treatment of liver failure in rats with end-stage cirrhosis by transplantation of immortalized hepatocytes. Hepatology. 2002;36(2):386-394.

[23] Gupta S, Vemuru RP, Lee CD, et al. Hepatocytes exhibit superior transgene expression after transplantation into liver and spleen compared with peritoneal cavity or dorsal fat pad: implications for hepatic gene therapy. Hum Gene Ther. 1994;5(8):959-967.

[24] Ahmad TA. Study of the survival of hepatocytes transplanted to the spleen in rats. Hepatogastroenterology. 2011;58 (107-108): 892-895.

[25] 万真,张晓刚,郑幸龙,等. 异种肝前体细胞移植治疗急性肝损伤大鼠[J].中国组织工程研究, 2013,17(53): 9132-9138.

[26] Pintilie DG, Shupe TD, Oh SH, et al. Hepatic stellate cells' involvement in progenitor-mediated liver regeneration. Lab Invest. 2010;90(8):1199-1208.

[27] Clotman F, Jacquemin P, Plumb-Rudewiez N, et al. Control of liver cell fate decision by a gradient of TGF beta signaling modulated by Onecut transcription factors. Genes Dev. 2005; 19(16):1849-1854.

[28] Zong Y, Stanger BZ. Molecular mechanisms of bile duct development. Int J Biochem Cell Biol. 2011;43(2):257-264.

[29] Suzuki A, Iwama A, Miyashita H, et al. Role for growth factors and extracellular matrix in controlling differentiation of prospectively isolated hepatic stem cells. Development. 2003; 130(11):2513-2524.

[30] Iwama A, Osawa M, Hirasawa R, et al. Reciprocal roles for CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP) and PU.1 transcription factors in Langerhans cell commitment. J Exp Med. 2002;195(5):547-558.

引言

肝脏原位移植被认为是治疗急性肝功能损伤、肝功能衰竭和肝代谢紊乱性疾病的有效方法，但是由于供肝越来越短缺，每年都有大量的终末期肝病患者在等待肝移植的过程中死去，所以迫切需要一种新的治疗方法作为过渡，让患者有机会等到肝脏移植，或者通过此方式达到治愈目的^[1]。近年来，人们在细胞移植领域进行了研究和探索，证实同种异体胚胎肝前体细胞移植后能够恢复受体鼠的肝脏部分功能，为肝脏代谢性疾病、慢性肝脏疾病及爆发性肝功能衰竭等临床治疗奠定了基础^[2]。但由于胚胎肝前体细胞在分离过程中，其周围的间质细胞和细胞因子丧失，移植肝前体细胞只能获得一定的短期效果，长期效果不理想^[3-5]。

研究表明，肿瘤的发生、发展不仅取决于肿瘤细胞自身，肿瘤微环境中间质细胞、细胞外基质及所分泌的细胞因子也发挥着十分重要的作用^[6-7]。同样，在胚胎肝脏发育过程中，微环境中的肝脏间质细胞和肝脏前体细胞相互交流接触对后者的增殖和分化起重要作用^[8-9]。肝脏间质细胞包括星状细胞、巨噬细胞、成纤维细胞等，其中主要为肝星状细胞。肝星状细胞主要通过转化生长因子β1(transforming growth factorβ1，TGF-β1)激活为肌成纤维细胞而发挥相应的生物学功能^[10]。因此，将胚胎肝前体细胞与肝星状细胞联合移植有望获得长期治疗效果。

脾脏被认为是肝脏相关细胞移植的理想部位，经脾注射的细胞经过血窦内皮细胞并定植于脾实质内长期存活大量增殖，发挥合成、代谢功能^[11-12]。实验将TGF-β1介导的小鼠肝星状细胞与胚胎肝前体细胞联合移植于急性肝损伤小鼠脾脏，探索细胞移植后大量增殖及长期存活的理想方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞水平观察实验和随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 细胞实验于2016年12月至2017年2月在重庆医科大学第一附属医院实验研究中心完成。动物实验于2017年4至9月在重庆医科大学动物房完成。

1.3 材料

1.3.1 细胞 小鼠肝星状细胞株(mHSCs-T25)由北京北纳创联生物技术公司BNCC细胞库提供；小鼠胚胎肝前体细胞株(mHPCs-E_14.5)由重庆医科大学生命科学院心内科薛倩博士赠送。

1.3.2 实验动物 健康清洁级8-10周雄性C57BL/6小鼠15只，体质量20-30 g，由重庆医科大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SYXK(渝)20017-0023。在清洁环境下饲养，自由进食水、饲料，环境温度维持在25 ℃左右，湿度50%-80%。

1.3.3 主要试剂、仪器 DMEM培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素(美国Gibco公司)；Trizol、RNA反转录试剂盒、SYBR(大连TaKaRa公司)；嘌呤霉素C(美国Sigma公司)；小鼠抗小鼠TGF-β1单克隆抗体、兔抗小鼠α-SMA多克隆抗体、兔抗小鼠CK19单克隆抗体(英国Abcam公司)；小鼠抗小鼠单克隆抗体AFP(美国RD公司)；小鼠抗小鼠ALB单克隆抗体(美国Santacruz公司)；peroxidase-conjugated affinipure山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗、peroxidase- conjugated affinipure山羊抗兔IgG(H+L)二抗(美国PeproTech公司)；胰酶消化液、RIPA蛋白裂解液、PMSF、预染蛋白Marker、DEPC水、蛋白上样缓冲液(上海碧云天生物技术有限公司)；PVDF膜(美国Millipore公司)；pHBLV-CMVIE- TGF-β1、pHBLV-CMVIE-GFP慢病毒质粒由中国汉恒生物科技公司包装；低温高速离心机(美国Sigma公司)；荧光定量PCR仪FTC200(Canada公司)；CellDoc200凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)；激光扫描共聚焦显微镜(德国Leica公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养 以含体积分数为10%胎牛血清+1%双抗(青霉素-链霉素)的DMEM培养基培养mHSCs-T25细胞及mHPC-E_14.5细胞，置于37 ℃体积分数为5% CO₂培养箱培养，1 d或2 d换液1次，培养两三天细胞进行传代，0.25%胰酶消化细胞2.0-3.0 min，DMEM培养基终止反应。

1.4.2 慢病毒pHBLV-CMVIE-TGF-β1及pHBLV-CMVIE- GFP感染小鼠肝星状细胞 提前1 d将传代至第4代的5×10⁵ mHSCs-T25细胞接种于6孔板中，分别取200 μL pHBLV-CMVIE-TGF-β1、pHBLV-CMVIE-GFP病毒感染mHSCs-T25细胞，48 h后将各组细胞传代，继续培养24 h后加入嘌呤霉素，终质量浓度为4 mg/L(预实验测出嘌呤霉素对mHSCs-T25细胞的最小致死量)。待耐嘌呤霉素的细胞克隆形成后，在荧光显微镜下挑取表达绿色荧光蛋白的单克隆细胞集落，于6孔板中扩大培养。所建立的携带绿色荧光标记的细胞，分别沿用慢病毒命名，即为慢病毒mHSCs-pHBLV-CMVIE-TGF-β1过表达组，mHSCs- pHBLV-CMVIE-GFP空载对照组。

1.4.3 qRT-RCR 用Trizol试剂提取mHSCs-pHBLV- CMVIE-TGF-β1过表达组、mHSCs-pHBLV-CMVIE-GFP空载对照组总mRNA，按照反转录试剂盒说明书操作反转录为cDNA，反转录条件：25 ℃ 10 min，42 ℃ 50 min，85 ℃ 5 min。按照荧光定量PCR扩增试剂盒说明书操作，扩增条件设置：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环39次，72 ℃检测信号。使用2^-^??CT法来计算相对mRNA含量，?CT=CT(目的基因)-CT(管家基因GAPDH)，??CT=?CT(实验组)-?CT(对照组)，2^-^??CT表示实验组目的基因mRNA的含量相对对照组所改变的倍数。qRT-PCR引物序列见表1。

1.4.4 Western blotting 按照蛋白提取试剂盒说明书步骤提取mHSCs-pHBLV-CMVIE-TGF-β1过表达组、mHSCs-pHBLV-CMVIE-GFP空载对照组总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度并调整蛋白质量浓度为40 mg/L。蛋白样品与1×蛋白上样冲缓冲液4︰1混合后于100 ℃加热 5 min使蛋白变性，在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，采用湿转法将凝胶上的蛋白转移到PVDF膜上，用5%高钙脱脂奶粉在摇床上封闭2 h，加入特异性一抗TGF-β1、α-SMA 4 ℃过夜，用TBST洗3次，每次15 min，加入特异性二抗37 ℃孵育1 h，最后经ECL发光显影。定影后所得免疫印迹图谱用Fusion软件定量分析，用每个目的蛋白条带灰度扫描值对比相应的内参GAPDH条带的灰度值，得到目的蛋白灰度的标准化值。实验重复3次，取3次实验的平均值。

1.4.5 细胞免疫荧光染色法鉴定胚胎肝前体细胞株mHPCs-E_14.5 将4×10³ mHPCs-E_14.5接种于96孔板，培养24 h后吸弃培养基，PBS洗3次，每次5 min，用40 g/L多聚甲醛(PBS 配制)常温固定30 min，0.1% Trition(PBS配制)4 ℃透膜10 min，山羊血清室温封闭1.5 h，加足够量的稀释好的一抗(anti AFP，小鼠来源，1︰200；anti ALB，小鼠来源，1︰100；anti CK19兔来源，1︰300)并放入湿盒，4 ℃孵育过夜。取出湿盒，37 ℃复温45 min，PBS洗3次，加入适量稀释好的荧光二抗放于湿盒中37 ℃孵育 60 min(注：从此步起后面所有步骤均在暗室中进行)。滴加DAPI孵育5 min，对标本进行染核，洗去多余的DAPI。最后在倒置荧光显微镜下观察并采集图像。

1.4.6 小鼠急性肝损伤模型的建立 15只小鼠随机分为mHPCs-E_14.5移植组，mHPCs-E_14.5与mHSCs-pHBLV- CMVIE-TGF-β1联合移植组(过表达TGF-β1联合移植组)，mHPCs-E_14.5与mHSCs-pHBLV-CMVIE-GFP联合移植组(对照联合移植组)，每组5只。实验小鼠接受一次腹腔注射CCl₄，剂量为1 mL/kg。3 d后，小鼠禁食12 h，4%戊巴比妥腹腔注射麻醉后固定于鼠板。取腹部正中切口，游离肝脏周围的韧带，显露小鼠肝脏，参照Higgins方法行2/3肝切除，包括肝左外叶、左中叶、右中叶^[13]。切除肝中叶时，应注意距离下腔静脉3.0-4.0 mm，避免下腔静脉扭曲、狭窄；结扎左外叶应远离第二肝门，以免影响其他肝叶静脉回流；切除肝叶应彻底，避免残留肝组织缺血坏死影响肝再生。

1.4.7 细胞移植 肝切除后即刻，各组小鼠在无菌条件下接受细胞移植。清晰暴露脾脏下级及脾门区，用1 mL注射器经脾脏匀速、缓慢地注射0.2 mL DMEM培养液，内含1︰3混合的5×10⁵ mHPCs-E_14.5与mHSCs。注射时用棉签暂时性按压脾门区，使移植细胞更多的保留在脾脏内，同时避免门脉压力过高及血管栓塞的发生。mHPCs-E_14.5移植组小鼠注射0.2 mL DMEM培养液，内含5×10⁵ mHPCs-E_14.5。

1.4.8 标本留取 在肝切除后14 d，4%戊巴比妥深度麻醉处死实验小鼠。经肝上下腔静脉取全血0.2-0.5 mL，用回转半径15 cm的离心机1 500 r/min离心20 min，取上层澄清血清，置于-80 ℃冰箱保存备用。同时取脾脏标本用体积分数10%中性甲醛固定，20%、30%蔗糖脱水后制做冰冻切片，用于共聚焦免疫荧光实验。

1.4.9 共聚焦免疫荧光检测 切片室温晾干后，用PBS洗2次；0.5% Trition 37 ℃透膜30 min；加入适量枸椽酸钠进行抗原修复，室温自然冷却后滴加山羊血清37 ℃封闭2 h；滴加ALB、α-SMA及CK19一抗，4 ℃过夜。PBS洗3次，加入适量相应二抗，室温孵育1 h，避光操作。DAPI染核5 min，滴加甘油进行封固，然后在激光扫描共聚焦显微镜下观察并采集图像。

1.4.10 肝功能检测 -80 ℃冻存的血清采用全自动生化分析仪检测血清谷丙转移酶(ALT)、谷草转移酶(AST)活性，比较各组转氨酶变化来说明肝功能恢复情况。

1.5 主要观察指标 ①慢病毒pHBLV-CMVIE-TGF-β1及 pHBLV-CMVIE-GFP感染小鼠肝星状细胞后携带绿色荧光蛋白表达情况；②过表达TGF-β1的小鼠肝星状细胞的目的基因TGF-β1、a-SMA表达；③小鼠胚胎肝前体细胞株中AFP、ALB、CK19的表达；④细胞移植后各组小鼠脾实质内ALB、CK19、a-SMA阳性表达以及小鼠血清谷丙转移酶、谷草转移酶活性。

1.6 统计学分析 采用SPSS 20.0软件进行统计分析，数据资料用x(_)±s表示，样本均数比较采用单因素方差分析。P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

肝细胞移植的细胞来源有多种，其中胚胎肝前体细胞移植优势明显。与成体肝细胞相比，胚胎肝前体细胞具有较强增殖能力以及分化为肝细胞和胆管细胞的能力，同时具有免疫原性弱、与受体有更好的适应性及组织融合能力、能够更好地耐受低温和缺血等特点，因此成为治疗终末期肝脏疾病的理想细胞来源^[14]。肝前体细胞已经广泛应用到临床各种肝病的治疗中，肝细胞增殖受抑制时，胚胎肝前体细胞体内定植并进一步分化为肝细胞及胆管细胞，改善肝功能^[15-16]。

研究表明，胚胎肝前体细胞的产生、增殖、分化等生物过程受其所处微环境的调控，而肝星状细胞作为其微环境中的重要组成部分，主要通过TGF-β1信号通路激活为肌成纤维细胞，产生大量的细胞外基质，并分泌细胞因子和生长因子促进肝前体细胞的增殖及分化^[17-18]。有研究从小鼠分离出的胎肝前体细胞移植入2/3肝切除处理的受体肝脏，18周后30%-40%的肝细胞来源于移植的肝前体细胞，提示肝前体细胞在受体肝脏内定植^[19]。但是，移植的肝前体细胞在受体内大量增殖、长期存活困难，而且需进一步分化为有活性的肝细胞才能发挥作用。肿瘤微生态系统中的肌成纤维细胞对肿瘤细胞的增殖、分化转移发挥着十分重要的作用^[20-21]。因此，实验利用TGF-β1激活肝星状细胞转化为肌成纤维细胞，并与胚胎肝前体细胞联合移植于CCl₄腹腔注射并2/3切肝建立急性肝损伤模型的小鼠脾脏，评价移植细胞治疗急性肝损伤的治疗作用。

实验采用慢病毒感染技术构建稳定过表达TGF-β1的肝星状细胞株，qRT-PCR和western blotting方法双向验证病毒转染效率。结果均显示，mHSCs-pHBLV-CMVIE- TGF-β1组中目的蛋白TGF-β1表达量为对照组的5倍左右，而且关键蛋白α-SMA的表达量较对照组明显上调，进一步说明成功建立稳定表达TGF-β1基因的小鼠肝星状细胞株，增加了肝星状细胞的活性。胚胎肝前体细胞移植途径主要有门静脉、脾及腹腔等部位。目前研究发现，脾脏是肝细胞移植的最佳场所^[22]，其原因在于脾脏微环境与肝脏类似，脾红髓的网状结构不仅有效促进移植细胞间的相互作用、植入，同时脾内丰富的血供也为移植细胞的长期存活、增生及保持良好的生理功能提供有利条件^[23-24]。研究显示，异种肝前体细胞移植明显改善急性损伤大鼠肝功能而且15%左右的移植细胞仍留在脾内^[25]，所以脾内移植可作为胚胎肝前体细胞移植的一个研究窗口。实验检测了移植后2周内胚胎肝前体细胞与星状细胞在脾实质内的植入、增殖分化以及肝功能恢复情况。ALB、a-SMA、CK19共聚焦免疫荧光更直观地反映了移植细胞在脾实质内的定植及分化。胚胎肝前体细胞株在体外培养条件下，大量表达胎肝抗原AFP，而少量表达肝细胞及胆管细胞特异性分子标志物。但是，植入脾脏2周后部分细胞显著表达ALB及CK19，而且与小鼠肝星状细胞联合移植后，在脾实质内出现少量a-SMA阳性细胞，ALB阳性细胞数量明显增多，提示肝星状细胞诱导胚胎肝前体细胞向肝细胞方向分化。

肝脏发育是一个复杂的过程，需要肝前体细胞、微环境中各种间质细胞及细胞因子共同参与^[26]。近年来的研究证实TGF-β1是调控肝内胆管形成、发展的重要信号分子^[27-28]。Suzuki等^[29-30]利用富含有TGF-β1的肿瘤上清液与原代胚胎肝前体细胞共培养诱导胚胎肝前体细胞向胆管细胞分化，分化的细胞高表达胆管细胞标志物CK19、SOX9等。实验结果表明，过表达TGF-β1联合移植组脾实质内出现大量a-SMA阳性细胞和CK19阳性细胞，ALB阳性细胞较对照联合移植组明显减少，差异有显著性意义。与mHPCs-E_14.5移植组相比，对照联合移植组和过表达TGF-β1联合移植组血清谷丙转移酶、谷草转移酶水平均显著下降，而后者更明显。以上结果表明，胚胎肝前体细胞移植可以修复小鼠急性肝损伤，与TGF-β1介导的肝星状细胞联合移植效果更佳。不过，其确切的分子机制还不明确，需要进一步深入研究。

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供肝越来越短缺，每年都有大量的良性终末期肝病患者在等待肝移植的过程中死去，所以迫切需要一种新的治疗方法作为过渡，让患者有机会等到肝脏移植，或者通过此方式达到治愈目的。为此，人们在肝细胞移植领域进行了研究和探索，取得了一定的成绩。由于具有更好的增殖能力与可塑性、更少的免原性、与受体有更好的适应性及组织融合能力、能够更好地耐受低温和缺血等优点，胚胎肝前体细胞是肝细胞移植的最理想来源。目前，虽然有人将胚胎肝前体细胞移植应用于肝脏代谢性疾病、慢性肝脏疾病及爆发性肝功能衰竭等临床治疗，但都只能获得一定的短期效果，长期效果不理想^[1-2]。研究表明，胚胎肝前体细胞在分离过程中其周围的间质细胞和细胞因子丧失导致其移植后大量增殖困难、长期效果不理想的主要原因^[3-4]。胚胎肝脏发育是一个复杂的过程，需要胚胎肝前体细胞、微环境中各种细胞及细胞因子等共同参与^[5]。胚胎肝脏微环境中的肝脏间质细胞和胚胎肝脏前体细胞的交流接触对后者的增殖和分化起重要作用^[6-7]。肝脏间质细胞包括星状细胞、巨噬细胞、成纤维细胞等，其中主要为肝星状细胞。肝门静脉及其周围的星状细胞在肝前体细胞的增殖及分化中起非常重要的作用。研究表明，肝星状细胞主要通过转化生长因子β1激活为肌成纤维细胞而发挥促进肝纤维化、肝硬化、血管形成等生物学作用^[8-9]。因此将胚胎肝前体细胞与过表达转化生长因子β1基因的肝星状细胞联合移植，旨在摸索移植后胚胎肝前体细胞长期存活、大量增殖及分化最佳条件, 为胚胎前体细胞移植的临床应用打下基础。

[1] Pietrosi G, Vizzini GB, Gruttadauria S, Gridelli B. Clinical applications of hepatocyte transplantation. World J Gastroenterol. 2009; 15(17): 2074-2077.
[2] Ishii T, Yasuchika K, Machimoto T, et al. Transplantation of Embryonic Stem Cell-Derived Endodermal Cells into Mice with Induced Lethal Liver Damage. Stem Cells. 2007; 25(12): 3252-3260.
[3] Yap KK, Dingle AM, Palmer JA, et al. Enhanced liver progenitor cell survival and differentiation in vivo by spheroid implantation in a vascularized tissue engineering chamber. Biomaterials. 2013; 34(16): 3992-4001.
[4] Hou YT, Ijima H, Takei T, Kawakami K. Growth factor/heparin-immobilized collagen gel system enhances viability of transplanted hepatocytes and induces angiogenesis. J Biosci Bioeng. 2011; 112(3): 265-272.
[5] Pintilie DG,Shupe TD,Oh S,et al. Hepatic stellate cells`involment in progenetior-mediated liver regeneration. Lab Invest.2010;90(8): 1199-1208.
[6] Gordillo M, Evans T, Gouon-Evans V. Orchestrating liver development. Development. 2015;142(12): 2094-2108.
[7] Suzuki K, Tanaka M, Watanabe N, et al. p75 Neurotrophin receptor is a marker for precursors of stellate cells and portal fibroblasts in mouse fetal liver. Gastroenterology.2008; 135(1): 270-281.
[8］Naoki Tanimizu HS, Keith Mostov, Atsushi Miyajima. Long-term culture of hepatic progenitors derived from mouse Dlk+ hepatoblasts. Journal of Cell Science. 2004; 117(26): 6425-6434.
[9] Weis SM, Cheresh DA. Tumor angiogenesis: molecular pathways and therapeutic targets. Nature Medicine. 2011; 17(11): 1359-1370.

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胚胎肝前体细胞与转化生长因子β1信号介导的肝星状细胞联合移植治疗急性肝损伤

Intrasplenic co-transplantation of fetal hepatic progenitor cells and transforming growth factor beta 1 induced hepatic stellate cells ameliorates acute liver injury

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[1]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[2]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[3]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[4]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[5]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[6]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[7]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[8]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[9]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[10]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[11]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[12]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[13]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[14]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[15]	史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.