内皮祖细胞和肝干细胞联合移植对大鼠肝纤维化的逆转作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0439

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (5): 704-709.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0439

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内皮祖细胞和肝干细胞联合移植对大鼠肝纤维化的逆转作用

郭灿灿¹，兰玲^1，2，3，刘冉⁴，秦凌云⁵，刘博伟²，徐梦阳²

¹锦州医科大学，河南省人民医院规培基地，河南省郑州市 450003；²郑州大学人民医院(河南省人民医院)消化内科，河南省郑州市 450003；³河南大学，河南省开封市 475001；⁴河南省荣军医院肿瘤科，河南省新乡市 453003；⁵郑州市儿童医院，河南省郑州市 450000

修回日期:2017-09-02 出版日期:2018-02-18 发布日期:2018-02-18
通讯作者: 兰玲，博士，副主任医师，副教授，郑州大学人民医院(河南省人民医院)消化内科，河南省郑州市 450003；锦州医科大学，河南省人民医院规培基地，河南省郑州市 450003；河南大学，河南省开封市 475001
作者简介:郭灿灿，女，1992年生，山东省济宁市人，汉族，锦州医科大学在读硕士，主要从事肝纤维化防治研究。
基金资助:
国家自然科学基金(30900598)；河南省基础与前沿技术研究项目(142300410380)；河南省医学科技攻关计划项目(201303211)

Co-transplantation of endothelial progenitor cells and hepatocyte stem cells launches a counterattack against liver fibrosis in rats

Guo Can-can¹, Lan Ling^{1, 2, 3}, Liu-ran⁴, Qin Ling-yun⁵, Liu Bo-wei², Xu Meng-yang²

¹Culture Basis of Henan Provincial People’s Hospital, Jinzhou Medical University, Zhengzhou 450003, Henan Province, China; ²Department of Digestion, People’s Hospital of Zhengzhou University (Henan Provincial People’s Hospital), Zhengzhou 450003, Henan Province, China; ³Henan University, Kaifeng 475001, Henan Province, China; ⁴Department of Oncology, Henan Provincial Veteran Hospital, Xinxiang 453003, Henan Province, China; ⁵Zhengzhou Children's Hospital, Zhengzhou 450000, Henan Province, China

Revised:2017-09-02 Online:2018-02-18 Published:2018-02-18
Contact: Lan Ling, M.D., Associate chief physician, Associate professor, Culture Basis of Henan Provincial People’s Hospital, Jinzhou Medical University, Zhengzhou 450003, Henan Province, China
About author:Guo Can-can, Studying for master’s degree, Culture Basis of Henan Provincial People’s Hospital, Jinzhou Medical University, Zhengzhou 450003, Henan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 30900598; the Basic and Cutting-Edge Technology Research Project of Henan Province, No. 142300410380; the Medical Science Research Project of Henan Province, No. 201303211

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
内皮祖细胞：主要存在于骨髓、外周血和脐血，心脏、血管、骨骼肌和脂肪组织中也有少量分布。骨髓中含有大量造血干细胞和间充质干细胞等，其均可分化为内皮祖细胞，因而骨髓中内皮祖细胞的含量更丰富。内皮祖细胞是内皮细胞的前体，属于多能干细胞，它能在损伤信号的诱导下迁移到损伤局部，增殖分化为成熟内皮细胞，参与血管内皮修复和缺血器官的血管新生。
肝纤维化形成的机制：肝纤维化是各种损伤因子累及肝脏后的一种病理状态，是一种可逆性病理现象，不同病因导致肝细胞分泌各种生长因子、炎性因子、蛋白酶类及纤维化细胞因子，刺激肝星状细胞及其他类型细胞的活化，转变为肌成纤维样细胞，从而分泌大量细胞外基质，使得肝脏正常结构被破环，肝细胞数量减少，肝小叶结构改变，血管结构紊乱，是肝纤维化形成的共同机制。

摘要
背景：目前骨髓源性内皮祖细胞(bone marrow-derived endothelial progenitor cells，BM-EPCs)或骨髓源性肝干细胞(bone marrow-derived hepatocyte stem cells，BDHSCs)移植治疗肝纤维化的研究较多见，但二者联合移植治疗肝纤维化的报道却罕见。因此设想将具有血管形成作用的BM-EPCs和具有肝细胞再生作用的BDHSCs联合移植，可发挥双重抗纤维化作用。
目的：探讨BM-EPCs和BDHSCs联合移植对大鼠肝纤维化的逆转作用。
方法：利用四氯化碳皮下注射6周建立大鼠肝纤维化模型。通过体外诱导培养获得肝纤维化大鼠来源的BM-EPCs，通过磁珠分选获得肝纤维化大鼠来源的BDHSCs。将两种细胞经尾静脉、门静脉分支输注移植到肝纤维化大鼠体内，观察其对肝纤维化程度和肝脏功能的改善作用。
结果与结论：①Masson染色结果显示，单纯BDHSCs或BM-EPCs移植，以及两者联合移植均能抑制胶原纤维的形成。但肝纤维化分期评分结果显示，仅BM-EPCs/BDHSCs联合移植能明显改善肝纤维化程度，与模型组相比差异有显著性意义(P < 0.05)；②肝功能和凝血功能检测结果显示，与模型组相比，BM-EPCs/BDHSCs联合移植组谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆红素、凝血酶原时间和部分活化凝血活酶时间5项指标水平显著改善(P < 0.05)，与正常组水平相当；③结果表明，来源于肝纤维化大鼠的BM-EPCs/BDHSCs联合移植治疗肝纤维化有显著疗效，优于单一类型细胞移植。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-9744-4545(兰玲)

关键词: 内皮祖细胞, 肝干细胞, 细胞移植, 肝纤维化, 干细胞, 骨髓, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: At present, the transplantation of bone marrow-derived endothelial progenitor cells (BM-EPCs) or bone marrow-derived hepatocyte stem cells (BDHSCs) is common in the treatment of liver fibrosis, but the combined treatment for liver fibrosis is rarely reported. Combined transplantation of BM-EPCs possessing the function of angiogenesis and BDHSCs possessing the function of hepatocyte regeneration might play a dual anti-fibrosis role.
OBJECTIVE: To evaluate the reversal effect on liver fibrosis by the combined transplantation of BM-EPCs and BDHSCs in rats.
METHODS: The liver fibrosis rat models were induced with CCl4 subcutaneous injections for 6 weeks. BM-EPCs of rats with liver fibrosis were obtained by culture induction in vitro. BDHSCs of rats with liver fibrosis were obtained by magnetic bead cell sorting. BM-EPCs and/or BDHSCs were transplanted into liver fibrosis rats via the tail vein and branch of the portal vein, and then the effects of BDHSCs transplantatiron on liver fibrosis and liver function were observed.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Masson staining results showed transplantations of BDHSCs and BM-EPCs, alone or both, could suppress the formation of collagen fibers. However, the staging scores of liver fibrosis showed that only the combined transplantation of BM-EPCs and BDHSCs could significantly improve liver fibrosis, which was significantly different from the model group (1.75±0.25 vs. 3.00±0.19, P < 0.05). (2) The liver biochemical assay in the blood showed that the levels of all five parameters of alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase, total bilirubin, prothrombin time, and activated partial thromboplastin time in the BM-EPCs/BDHSCs group were significantly improved to be equivalent to normal levels, compared with those in the model group (P < 0.05). To conclude, it is an effective treatment for liver fibrosis by the co-transplantation of BM-EPCs and BDHSCs.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Endothelial Cells, Hepatocytes, Liver Cirrhosis, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

郭灿灿，兰玲，刘冉，秦凌云，刘博伟，徐梦阳. 内皮祖细胞和肝干细胞联合移植对大鼠肝纤维化的逆转作用[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(5): 704-709.

Guo Can-can, Lan Ling, Liu-ran, Qin Ling-yun, Liu Bo-wei, Xu Meng-yang. Co-transplantation of endothelial progenitor cells and hepatocyte stem cells launches a counterattack against liver fibrosis in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(5): 704-709.

图/表（结果） 3

2.1 BDHSCs和BM-EPCs形态 经MACS法分选后，β₂m^-/Thy-1⁺BDHSCs得率为1%-2%，即(1.0-2.0)×10⁶个细胞。新鲜分选的BDHSCs为小圆形，透亮度好(图1A)，经锥虫蓝染色检测细胞活力大于95%(图1B)。

内皮祖细胞经诱导培养4 d内贴壁，6 d呈现首尾相连的直线状条索样结构，7 d可形成集落，呈放射状向外周生长，周边有梭形细胞不断生成，在不同的培养时间可能会呈现出椭圆形、长梭形或纺锤形，10 d起增殖加速，大部分呈多角形，并逐渐分化成具有“铺路石”样结构特征的内皮细胞(图2)^[20]。

前期研究鉴定了BM-EPCs的吞噬功能和成血管功能，BDHSCs的肝相关基因表达及ALB和AFP蛋白表达功能，具体结果见前期研究^[11^，²⁰^，^24]。

2.2 实验动物数量分析 参加实验55只Wistar大鼠，中途因肝纤维化造模死亡9只，开腹手术死亡6只，进入结果分析40只。

2.3 胶原形成和肝纤维化程度改善情况 Masson染色结果显示，肝纤维化大鼠肝组织胶原纤维(绿色)大量形成(图3B)，肝纤维化分期评分为3.00±0.19，明显高于正常大鼠(0，P < 0.05)。单纯BDHSCs或BM-EPCs移植，以及两者联合移植均能抑制胶原纤维的形成(图3C-E)。但肝纤维化分期评分结果显示，BDHSCs组(2.88±0.23)和BM-EPCs组(2.75±0.16)的肝纤维化程度与模型组相比无明显改善 (P > 0.05)。而BM-EPCs/BDHSCs联合移植后肝纤维化程度较模型组明显改善(1.75±0.25，P < 0.05)，见表1。

2.4 肝脏功能改善情况 如表2所示，与正常组相比，模型组中所有5项肝脏功能指标的水平均增加(P < 0.05)。与模型组相比，BDHSCs移植抑制了谷丙转氨酶、总胆红素水平和部分活化凝血活酶时间(P < 0.05)，但未改善谷草转氨酶水平和凝血酶原时间(P > 0.05)；BM-EPCs移植抑制了谷丙转氨酶、谷草转氨酶水平和部分活化凝血活酶时间(P < 0.05)，但未改善总胆红素水平和凝血酶原时间(P > 0.05)。除了总胆红素水平(P < 0.05)，BM-EPCs组和BDHSCs组间的其他4项指标水平差异无显著性意义(P > 0.05)。而BM-EPCs和BDHSCs联合移植后，所有5项指标的水平显着改善至与正常组水平相当(P > 0.05)，与BDHSCs组相比，谷草转氨酶、总胆红素水平和凝血酶原时间改善明显(P < 0.05)，与BM-EPCs组相比，总胆红素水平和凝血酶原时间改善明显(P < 0.05)。

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年4月至2016年12月在郑州大学人民医院中心实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 雄性Wistar大鼠80只，8周龄，体质量250-300 g，购自河南省动物实验中心，在标准动物实验室饲养，室内温度23 ℃左右，湿度50%左右，自然昼夜节律光照，自由饮食饮水。动物研究经郑州大学动物伦理委员会批准，符合中国国家实验动物使用规定。

1.3.2 实验用试剂和仪器 胎牛血清、DMEM/F12培养液(Gibco)；血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和胰岛素样生长因子(Peprotech，New Jersey，NJ)；人纤维连接蛋白(BD Biosciences，San Jose， CA)。

1.4 实验方法

1.4.1 肝纤维化大鼠BM-EPCs的分离和培养 40只Wistar大鼠皮下注射体积分数40%四氯化碳(四氯化碳︰橄榄油= 2︰3)，3 mL/kg，2次/周(首剂加倍)，共注射6周，建立肝纤维化模型^[19-20]。从股骨和胫骨骨髓中提取单个核细胞，重悬于含体积分数为10%胎牛血清及血管内皮生长因子(20 μg/L)、碱性成纤维细胞生长因子(5 μg/L)、表皮生长因子(5 μg/L)和胰岛素样生长因子(10 μg/L)的DMEM/F12培养液中，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中培养24 h，收集未贴壁细胞，接种于人纤维连接蛋白(10 mg/L)预先包被的培养瓶中扩增培养，4 d后PBS洗去未贴壁细胞，贴壁细胞继续培养，倒置显微镜下观察细胞形态。

1.4.2 β₂m^-/Thy-1⁺BDHSCs通过细胞磁珠筛选和纯化 方法详见课题组以往研究^[11^，^21-22]。

1.4.3 肝纤维化模型建立及细胞移植 将Wistar大鼠40只随机分为5组(8只/组)：于建模第3，4，5周末，①正常组：橄榄油处理的大鼠输注PBS；②模型组：四氯化碳处理的大鼠输注PBS；③BDHSCs组：四氯化碳处理的大鼠输注BDHSCs；④BM-EPCs组：四氯化碳处理的大鼠输注BM-EPCs；⑤BM-EPCs/BDHSCs组：四氯化碳处理的大鼠输注BM-EPCs(第3，5周末)和BDHSCs(第4周末)。其中第3周末和第5周末，经尾静脉输注2×10⁶个BM-EPCs(1 mL PBS稀释)或单纯1 mL PBS，第4周末，经门静脉分支输注2×10⁵个BDHSCs (1 mL PBS稀释)或单纯1 mL PBS。大鼠于建模第6周末处死，取部分全血和血清即刻送检，留取肝组织-80 ℃冻存或体积分数为10%甲醛固定备用。

1.4.4 肝脏Masson三色胶原染色 体积分数为10%甲醛固定的肝组织行石蜡包埋，Masson三色胶原染色法染色，光学显微镜下观察肝组织中的胶原纤维。肝纤维化通过半定量评分分期如下^[23]：0分，无肝纤维化，无胶原纤维；1分，轻度肝纤维化，胶原纤维位于中央肝小叶；2分，中度肝纤维化，胶原纤维沿中央肝小叶扩展；3分，严重肝纤维化，胶原纤维延伸到肝小叶边缘；4分，肝硬化，假小叶形成。

1.4.5 肝功能和凝血功能检测 采用生化自动分析仪(Beckman LX20，USA)对血清中的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和总胆红素(TBIL)以及全血凝血酶原时间(PT)和部分活化凝血活酶时间(APTT)进行检测。

1.5 主要观察指标 肝组织胶原纤维量，血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶和总胆红素水平以及全血凝血酶原时间和部分活化凝血活酶时间。

1.6 统计学分析 应用SPSS 17.0统计学软件，计量资料以x(_)±s表示，比较方差齐次性，方差齐时采用方差分析(ANOVA)，方差不齐时采用Kruskal-Wallis检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

肝纤维化是各种慢性肝病进展为肝硬化的必经阶段，严重威胁人类健康。近来，有促肝细胞再生作用的骨髓干细胞已被用来治疗肝纤维化。肝纤维化的主要病理学特征是在功能性肝细胞减少和破坏的同时^[2]，存在细胞外基质的过度沉积、窦状隙缩窄和异常血管重塑^[1]。近来，有促肝细胞再生作用的骨髓干细胞已被用来治疗肝纤维化^[24-25]。然而，除了肝再生，肝脏内皮/血管重塑也是肝纤维化治疗的关键^[26-27]。内皮祖细胞已经在肝纤维化中表现出这种作用^[13^，^16]。内皮祖细胞主要存在于骨髓和外周血中。内皮祖细胞在血液中数量稀少，浓度是白细胞的0.005%- 0.01%^[28]。而骨髓含有许多造血干细胞和间充质干细胞，可以分化为内皮祖细胞^[29]。因此，骨髓应该是未来肝纤维化临床治疗中内皮祖细胞的主要来源。由于目前研究均使用来自健康个体的BM-EPCs^[14-18]，故内皮祖细胞的自体移植在临床应用受限。

肝纤维化病理环境中的骨髓细胞经体外培养能否获得充足的正常内皮祖细胞是自体内皮祖细胞治疗临床应用的关键，但其可行性仍有待确定。作者在前期研究中通过体外诱导培养肝纤维化大鼠的非贴壁骨髓单个核细胞成功获得了充足的具有特异性表型(VEGFR2和CD133)和功能(吞噬作用和血管发生)及正常增殖和分化能力的内皮祖细胞^[20]。

目前有多种细胞移植途径，其中经过入肝血管(肝动脉或门静脉)移植，因细胞未经全身血液循环，较尾静脉移植能更多数量的入肝，因此细胞肝内移植应首选经肝动脉或门静脉输注。国内外均有经肝动脉或门静脉分支移植干细胞的研究^[25^，^30-31]，作者前期研究也已建立了较成熟的经门静脉分支移植BDHSCs的方法，开腹手术存活率高，细胞在肝内种植率高^[11]。因此，BDHSCs移植选择经门静脉分支输注。BM-EPCs在BDHSCs输注前后分两次输注，可以更好地在BDHSCs入肝前后发挥血管重塑作用，利于BDHSCs在肝内的种植、增殖和分化。但如果选择经门静脉分支移植BM-EPCs，则大鼠将经历多达3次开腹手术，死亡率将极高，不利于研究的顺利开展。且作者前期研究也建立了较成熟的经尾静脉移植BM-EPCs的方法，结果证实BM-EPCs经尾静脉输注入肝纤维化大鼠体内后可顺利迁移并种植于肝脏^[32]，通过尾静脉注射的内皮祖细胞对肝脏有很好的趋向性^[33]。因此，BM-EPCs移植选择了经尾静脉输注。虽然两种细胞移植方式不同，但以上5组大鼠均经历了3次移植，即第3周末和5周末的2次尾静脉移植，第4周末的1次门静脉分支移植，遵循了随机对照同等条件原则。

为了实现肝脏内皮/血管重塑和肝再生的双重疗效，作者评价了BM-EPCs和BDHSCs联合移植对肝纤维化的影响。肝组织胶原纤维半定量结果显示，单纯BM-EPCs和单纯BDHSCs移植对改善肝组织纤维化程度均未见明显疗效，而BM-EPCs和BDHSCs联合移植的疗效显著优于单一类型细胞移植。肝功能和凝血功能检测结果显示，任何类型细胞移植均较容易改善谷丙转氨酶水平和部分活化凝血活酶时间；谷草转氨酶水平不能被单纯BDHSCs移植改善，可被单纯BM-EPCs移植和联合移植改善；总胆红素和凝血酶原时间通过单一类型细胞移植改善效果不明显，BM-EPCs和BDHSCs联合移植则明显改善总胆红素水平和凝血酶原时间。出现上述结果，考虑原因如下：①谷丙转氨酶存在于肝细胞胞浆中，在肝细胞膜通透性增高或破坏的情况下即可释放入血，其水平较易受肝脏炎症的影响而升高，是反映肝细胞受损程度最灵敏的指标^[34-35]，但并非肝纤维化的敏感指标，故在移植干细胞的治疗作用下，谷丙转氨酶水平较易改善，不受肝纤维化程度有无改善的影响；②部分活化凝血活酶时间不仅受肝脏凝血因子合成功能的影响，也受全身凝血系统的影响，故其在肝纤维化中异常程度较低，在移植干细胞的治疗作用下较易改善；③谷草转氨酶存在于肝细胞线粒体内，肝细胞受损严重或发生肝纤维化时，破坏了线粒体才会导致谷草转氨酶释放入血，水平升高，故其需要在肝纤维化程度改善的基础上而发生，单纯BM-EPCs移植和联合移植均能有效改善肝纤维化；④总胆红素和凝血酶原时间是反映肝脏胆红素代谢和凝血因子合成这两大功能的重要关键指标，其水平的升高往往代表肝纤维化病变程度的严重和预后不良^[36]，较难改善，本研究中联合移植明显改善总胆红素水平和凝血酶原时间，足以提示联合移植能更好地逆转纤维化，恢复肝脏关键功能。

总之，实验证实了从肝纤维化大鼠骨髓中获得正常内皮祖细胞的可行性以及BM-EPCs和BDHSCs联合移植治疗肝纤维化的有效性。这为内皮祖细胞自体移植的临床应用，以及BM-EPCs和BDHSCs联合移植治疗肝纤维化提供了实验依据。当然，BM-EPCs和BDHSCs在纤维化肝组织中的相互作用机制仍需进一步研究。此外，BM-EPCs治疗肝纤维化过程中有无促进肿瘤血管生成和引起潜在肿瘤生长的可能也应该进一步探讨^[3]。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

内皮祖细胞和肝干细胞联合移植对大鼠肝纤维化的逆转作用

Co-transplantation of endothelial progenitor cells and hepatocyte stem cells launches a counterattack against liver fibrosis in rats

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