人羊膜上皮细胞对四氯化碳诱导小鼠肝损伤的定位修复

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0438

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (5): 698-703.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0438

• 干细胞移植 stem cell transplantation • 上一篇下一篇

人羊膜上皮细胞对四氯化碳诱导小鼠肝损伤的定位修复

刘默凝¹，张钰堃¹，李岩¹，曹贵方¹，白立恒²

¹内蒙古农业大学动物组织胚胎学与发育生物学实验室，内蒙古自治区呼和浩特市 010018；²内蒙古妇幼保健医院，内蒙古自治区呼和浩特市 010020

修回日期:2017-10-13 出版日期:2018-02-18 发布日期:2018-02-18
通讯作者: 白立恒，副主任医师。内蒙古妇幼保健医院，内蒙古自治区呼和浩特市 010020
作者简介:刘默凝，女，1990年生，吉林省松原市人，汉族，内蒙古农业大学在读博士，主要从事免疫学、干细胞方面研究。并列第一作者：张钰堃，女，1992年生，吉林省吉林市人，汉族，2016年内蒙古农业大学毕业，硕士，主要从事细胞生物学及干细胞方面的研究。
基金资助:
内蒙古自治区自然科学基金项目(2015MS0375)

Human amnion epithelial cell transplantation provides a local repair of liver damage induced by carbon tetrachloride in mice

Liu Mo-ning¹, Zhang Yu-kun¹, Li Yan¹, Cao Gui-fang¹, Bai Li-heng²

¹Laboratory of Animal Embryology and Developmental Biology, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, Inner Mongolia Autonomous Region, China; ²Department of Maternity, Inner Mongolia Maternal and Child Health Hospital, Hohhot 010020, Inner Mongolia Autonomous Region, China

Revised:2017-10-13 Online:2018-02-18 Published:2018-02-18
Contact: Bai Li-heng, Associate chief physician, Department of Maternity, Inner Mongolia Maternal and Child Health Hospital, Hohhot 010020, Inner Mongolia Autonomous Region, China
About author:Liu Mo-ning, Studying for doctorate, Laboratory of Animal Embryology and Developmental Biology, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, Inner Mongolia Autonomous Region, China. Zhang Yu-kun, Master, Laboratory of Animal Embryology and Developmental Biology, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, Inner Mongolia Autonomous Region, China. Liu Mo-ning and Zhang Yu-kun contributed equally to this work.
Supported by:
the National Natural Science Foundation of Inner Mongolia Autonomous Region, No. 2015MS0375

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
羊膜上皮细胞：羊膜上皮细胞来源于羊膜的外胚层，具有干细胞特性并表达SSEA-3和SSEA-4等胚胎干细胞表面标志。羊膜上皮细胞是在受精后，胚胎发育的第8天左右由外胚层发育而来的，此时原肠胚还没形成，细胞还没有开始进入特定分化.
羊膜上皮细胞特性：更接近于胚胎干细胞，且有研究显示，与胚胎干细胞相比，羊膜上皮细胞不会使免疫缺陷型小鼠产生畸胎瘤。

摘要
背景：人羊膜上皮细胞具有无致瘤性、来源丰富、容易获取、免疫原性低、无医学伦理限制等优点，很多优势是胚胎干细胞和诸多成体干细胞所不具备的，有望成为今后临床移植治疗的重要种子细胞。
目的：观察并研究荧光染料羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(5，6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE)标记的人羊膜上皮细胞对四氯化碳诱导的小鼠肝损伤的定位修复情况。
方法：使用酶消化法从人羊膜中分离得到人羊膜上皮细胞，观察细胞形态，人羊膜上皮细胞的鉴定采用免疫细胞化学法检测细胞角蛋白19的表达。用四氯化碳腹腔注射诱导小鼠肝损伤。将用CFSE标记的人羊膜上皮细胞通过尾静脉注射移植到肝损伤小鼠体内，细胞移植后7 d后检测小鼠组织病理学变化，30 d后检测肝功相关指标。
结果与结论：①实验成功分离得到纯度较高的人羊膜上皮细胞；②免疫细胞化学检测显示人羊膜上皮细胞可表达上皮细胞标志角蛋白19；③冰冻切片免疫荧光显示人羊膜上皮细胞可以归巢到受损肝脏；④人羊膜上皮细胞移植后对肝损伤小鼠的肝功能、组织病理学改变都有明显修复作用；⑤结果证实，人羊膜上皮细胞可有效改善肝组织的生理功能，为细胞定位移植治疗肝脏疾病的修复情况提供实验数据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-0420-5057(刘默凝)

关键词: 人羊膜上皮细胞, 四氯化碳, 肝损伤, 定位修复, CFSE, 谷草转氨酶, 冰冻切片, 干细胞, 免疫荧光, 小鼠, 组织工程

Abstract:

BACKGROUND: Human amnion epithelial cells (hAECs) have many merits that embryonic stem cells and adult stem cells do not have, such as no tumorigenicity, rich sources, easy to obtain, low immunogenicity and no medical ethics limit. Therefore, hAECs are expected to be important seed cells for clinical transplantation.
OBJECTIVE: To observe the therapeutic effect of hAECs transplantation labeled with carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) in a mouse model of liver damage induced by carbon tetrachloride.
METHODS: hAECs from the human amniotic membrane were collected using enzymatic digestion, and morphology of cells was observed. Expression of keratin 19 in hAECs was detected by immunocytochemistry. Model of liver damage was made in mice by intraperitoneal injection of carbon tetrachloride. Then, CFSE-labeled hAECs were injected into the liver damage mice via tail vein. Histopathological changes and liver function in mice were observed at 7 and 30 days after transplantation, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: The high-purity hAECs were successfully isolated, which expressed keratin 19 shown by immunocytochemical staining. Frozen sections of immunoflrorescence showed that hAECs could be moved to the damaged liver, and exhibited remarkable repair effects on the liver function and histopathology in mice. These findings indicate that hAECs can be used for xenotransplantation and function to promote physiological recovery from liver injury, thereby providing experimental evidence for liver repair with cell transplantation.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Tissue Engineering, Stem Cell Transplantation, Immunohistochemistry

中图分类号:

R394.2

刘默凝，张钰堃，李岩，曹贵方，白立恒. 人羊膜上皮细胞对四氯化碳诱导小鼠肝损伤的定位修复[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(5): 698-703.

Liu Mo-ning, Zhang Yu-kun, Li Yan, Cao Gui-fang, Bai Li-heng. Human amnion epithelial cell transplantation provides a local repair of liver damage induced by carbon tetrachloride in mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(5): 698-703.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析 纳入小鼠60只均进入结果分析，造模过程中发现死亡和感染后及时补充，无脱失值。

2.2 人羊膜上皮细胞的形态特征 原代培养接种24 h后，可见大部分细胞仍悬浮在培养基中，但已可见少量形态呈圆形、三角形、多边形，形态不规则的贴壁细胞，大部分细胞仍悬浮于培养基中(图1A)。

培养72 h后换液去除未贴壁细胞，可见细胞多数呈卵圆形，折光性强，细胞形态大小均一(图1B)。

第2代细胞呈铺路石样排列呈单片状，上皮细胞形态显著(图1C)。第7代细胞退化严重，折光性减弱，细胞边界模糊，形态多样性，生长缓慢(图1D)。

2.3 各组小鼠肝组织角蛋白19(CK19)的表达 爬片完成后的第2代人羊膜上皮细胞，经免疫细胞化学法检测。结果显示人羊膜上皮细胞细胞核经苏木精染色呈蓝色，细胞质可见棕黄色着色，表明CK19在人羊膜上皮细胞的细胞质中呈阳性表达，用DPBS代替一抗孵育的对照组未见棕黄色着色为阴性(图2)。

2.4 小鼠肝组织CFSE标记人羊膜上皮细胞形态 使用第2代人羊膜上皮细胞，CFSE染色标记人羊膜上皮细胞后，用荧光显微镜观察，结果显示经过处理的人羊膜上皮细胞的细胞核、细胞质及细胞膜均被CFSE染色标记，发出绿色荧光，荧光呈强阳性(图3)。

2.5 检测CFSE标记的人羊膜上皮细胞在小鼠肝脏内定植情况 取移植人羊膜上皮细胞7 d的治疗组小鼠和尾静脉注射生理盐水对照组小鼠肝脏组织，进行冰冻切片制作，DAPI染色后，激光共聚焦显微镜观察见图4，实验组经CFSE标记的人羊膜上皮细胞细胞分布在小鼠肝小叶周围(图4A)，对照组小鼠肝脏组织未见绿色荧光细胞(图4C)。

2.6 人羊膜上皮细胞移植前后小鼠肝功变化 与模型组相比，治疗组小鼠的天门冬氨酸转移酶及丙氨酸氨基转移酶表达量明显降低，并接近正常组小鼠肝功水平。结果表明移植人羊膜上皮细胞对小鼠肝功能有恢复作用(表1)。

2.7 移植人羊膜上皮细胞小鼠肝脏病理学变化 苏木精-伊红染色结果显示，注射CCl₄模型组的肝脏组织表面变性明显，肝脏细胞广泛坏死，有水肿现象，并有明显坏死灶(图5A)。移植人羊膜上皮细胞的治疗组小鼠肝脏组织切片染色后，结果显示小鼠肝脏中变性肝细胞减少，水肿现象有效缓解(图5B)。尾静脉注射生理盐水的对照组苏木精-伊红染色结果与模型组无显著差异(图5C)。

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学实验。

1.2 时间及地点 于2015年4月至2016年12月在内蒙古农业大学组织胚胎与发育生物学实验室完成。

1.3 材料

胎盘：采取未感染肝炎、艾滋病等其他传染性疾病，约39周龄，顺产分娩胎儿的胎盘8个(产妇均签署了有关胎盘用于科学实验研究的知情同意书，实验得到内蒙古妇幼保健医院伦理委员会批准)。

动物：健康6周龄昆明白系雄性小鼠60只，由金宇公司国家清洁级实验动物繁育室提供。

1.4 实验方法

1.4.1 人羊膜上皮细胞的分离培养 取新鲜的足月顺产胎儿的胎盘组织。无菌条件下机械剥离羊膜，透明没有血管的一层为羊膜层。生理盐水清洗羊膜后使用胰蛋白酶(体积分数0.25% Trypsin-0.02% EDTA，Gibco，美国)消化组织，37 ℃摇床200 r/min分3次对其进行消化，第1次消化10 min，第2次消化40 min，第3次消化20 min，分别过200目细胞筛，收集细胞过滤液，终止消化，2 000 r/min离心5 min，细胞团块用完全培养基(DMEM/F12、体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素，Gibco，美国)重悬，用细胞计数仪计数，接种浓度为5×10⁵个细胞接种1个100 mm培养皿，37 ℃，体积分数5%CO₂的饱和湿度的培养箱中进行原代培养。培养到第3天换液，随后每隔2 d换液1次，直至细胞浓度达到80%-90%。

1.4.2 免疫细胞化学染色鉴定人羊膜上皮细胞 用第1代人羊膜上皮细胞做细胞爬片，次日细胞贴壁后做如下处理：DPBS(Gibco，美国)冲洗3次；加40 g/L多聚甲醛(Solarbio)，在4 ℃冰箱中过夜固定；次日从冰箱中取出，DPBS冲洗3次；加体积分数0.3%Triton-X 100/PBS，室温下使细胞通透15 min；DPBS冲洗3次；加山羊血清封闭非特异性抗体，室温下30 min；加入小鼠抗人角蛋白19(CK19，福州迈新公司；上皮细胞特异表达的蛋白，用于鉴定以鉴定人羊膜上皮细胞)，4 ℃冰箱中过夜处理，阴性对照组加入等量的DPBS；次日从冰箱中取出，DPBS冲洗3次；加入山羊抗小鼠IgG抗体(peprotech)，室温下处理1 h；DPBS冲洗3次；每张载玻片滴加100 μL新配置的DAB显色液(福州迈新)，正置显微镜下观察其显色情况，显色后迅速用蒸馏水冲洗掉表面多余的DAB显色液；苏木精复染2-5 s，蒸馏水冲洗掉剩余染料；梯度乙醇脱水干燥；二甲苯透明；中性树胶封固，正置显微镜观察并照片。

1.4.3 CFSE标记人羊膜上皮细胞 取生长汇合度达80%-90%的培养于100 mm培养皿中的第2代人羊膜上皮细胞，加入2.5 mL体积分数0.25%的胰蛋白酶，37 ℃消化5 min后加入5 mL培养基终止消化，1 500 r/min离心5 min，弃上清后加入1 mL完全培养基轻轻吹散细胞，用细胞计数仪计数，使细胞浓度保持在1×10⁹ L^-1；加入CFSE工作液(DMSO溶解粉末CFSE，配制成10 mmol/L的浓储，-20 ℃冰箱中避光保存；CFSE工作液浓度为10 μmol/L)并轻轻吹打均匀，放入37 ℃，体积分数5%CO₂培养箱中孵育10 min；取出加入2倍体积分数10%胎牛血清的终止消化培养基，轻轻吹打均匀，立即放在冰盒中避光放置5 min；1 500 r/min离心5 min；加入DPBS轻轻吹打清洗，1 500 r/min离心5 min，弃上清，如此用DPBS反复清洗3次；最后加入DPBS，依然使细胞浓度保持在1×10⁹ L^-1，荧光显微镜观察染色情况并拍照记录。

1.4.4 构建四氯化碳诱导小鼠肝损伤模型及细胞移植 将小鼠60只随机分成模型组、治疗组、对照组和正常组，每组15只，分笼饲养。

四氯化碳(CCl₄)注射液配制：CCl₄和橄榄油按1∶10比例混匀。

建模及干预：按小鼠体质量20 μL/g的注射量进行腹腔注射，注射前24 h断粮，使其保持空腹状态，每周注射2次，共注射4周；治疗组：造模过程同模型组同时进行，并在最后1次注射后24 h内进行人羊膜上皮细胞移植治疗；对照组：造模过程同模型组同时进行，并在治疗组进行细胞移植时腹腔注射等量生理盐水；正常组：按时添加水与鼠粮即可。每天观察各组小鼠的体质量、活动情况、毛色等。在第8次即最后一次腹腔注射CCl₄后24 h内对治疗组小鼠进行人羊膜上皮细胞移植。首先将人羊膜上皮细胞用CFSE标记，使细胞浓度保持在1×10⁹ L^-1。治疗组小鼠每只注射标记好CFSE的细胞悬液0.2 mL。对照组尾静脉注射0.2 mL生理盐水。

1.4.5 人羊膜上皮细胞在小鼠肝脏定植情况检测 取人羊膜上皮细胞移植7 d的治疗组和对照组小鼠各10只，取小鼠肝脏组织，OCT包埋，制作冰冻切片；40 g/L多聚甲醛中室温固定1 h；DPBS溶液中浸泡清洗；避光条件下滴加DAPI染色液，常温避光染色10 min；用甘油∶水为1∶1的混合溶液为封片剂封固；使用激光共聚焦显微镜对其观察绿色荧光细胞的定植情况及分布。

1.4.6 肝功相关指标的测定 随机选取模型组(造模结束后)、治疗组(移植人羊膜上皮细胞后30 d)和正常组小鼠各5只，眼球采血；4 ℃冰箱中放置12 h过夜；3 000 r/min离心20 min，吸取上层血清，-20 ℃冰箱中保存。试剂盒检测模型组、治疗组和正常组小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)及门冬氨酸氨基转移酶(AST)水平。

1.4.7 切片苏木精-伊红染色观察小鼠肝脏组织病理学变化 小鼠采血后立即开腹取小鼠肝脏组织，并随机选取对照组小鼠5只同样方法处死后取小鼠肝脏组织，OCT包埋，制作冰冻切片；常规苏木精-伊红染色15 min；体积分数0.5%伊红染色10 s后固定、脱色、透明，滴加少许中性树胶，加盖玻片封固，放置于37 ℃干燥箱中24 h以上，烘干；正置显微镜下观察小鼠肝脏有无变性、坏死等病理学变化。

1.5 主要观察指标 各组小鼠肝功能变化及肝脏组织病理学变化。

1.6 统计学分析 数据以x(_)±s表示，用SPSS 20.0软件进行统计学分析。组间数据差异的比较采用单因素方差分析和SNK检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

实验采用胰蛋白酶分步多次消化法分离人羊膜上皮细胞，缩短消化时间，及时收集消化下来的人羊膜上皮细胞，分批获得足够量的细胞，最大程度降低酶对细胞的伤害。收集使用胰蛋白酶分步多次消化得到人羊膜上皮细胞，原代培养72 h后换液去除未贴壁细胞，可见细胞呈铺路石样紧密排列呈片状，细胞形态大小均一，上皮细胞形态特征显著。细胞角蛋白(CK)是上皮细胞特异性表达蛋白，实验通过免疫细胞化学法证明角蛋白19在人羊膜上皮细胞中呈阳性表达，说明分离培养细胞确为人羊膜上皮细胞，并未掺杂羊膜组织中其他细胞，细胞纯度高。

荧光染料CFSE可以穿过细胞膜进入到细胞内部，在活细胞内与蛋白以共价结合方式结合^[17]，水解释放出绿色荧光。在细胞增殖分裂过程中，所标记的荧光随细胞的分裂而平分至子代细胞中，在体内可观察的荧光效果可长达数周，但其不会影响细胞的增殖能力。

根据陈少强等对CFSE标记大鼠骨髓间充质干细胞最佳浓度的研究结果^[17]，并通过预实验确定CFSE标记细胞时的浓度，最终确定当CFSE浓度为10 μmol/L时，在荧光显微镜下观察被标记的人羊膜上皮细胞，细胞核、细胞质、细胞膜均被荧光标记，表达强绿色荧光，为最佳染色标记浓度。

中国《中药药理实验指导原则》明确指定应用CCl₄造模的动物进行保肝降酶新药的药理实验^[18-22]。用CCl₄造肝损伤动物模型，造模技术容易掌握、实验成功率高、重复性好、可靠性强。因此实验使用CCl₄与橄榄油混合，根据小鼠体质量以质量浓度为20 μL/g的注射量、腹腔注射的方式注入小鼠体内造模^[23]。

CCl₄造成肝损伤的作用机制通常被认为是：CCl₄诱导的肝脏内发生自由基的聚集和脂质过氧化的链式反应^[24-26]，细胞内钙平衡被破坏^[27-28]，进而导致肝脏内脂质代谢发生紊乱，产生障碍^[29]，从而诱发肝脏内炎症反应，造成肝损伤^[30]。

实验将用CFSE标记的人羊膜上皮细胞通过尾静脉注射的方式移植到小鼠体内，通过血液循环转移细胞。有研究证明用CCl₄诱导肝损伤，损伤时间发生在6-24 h内，而肝脏进行自我修复的时间发生在48 h-14 d^[31]，因此实验在最后一次造模注射后24 h内进行细胞移植^[28]。

对移植人羊膜上皮细胞2周后的小鼠肝脏组织进行免疫荧光实验，结果显示，实验组小鼠肝脏组织肝小叶附近检测到标记荧光，注射生理盐水的对照组则没有检测到荧光标记，说明人羊膜上皮细胞成功定植到受损肝脏组织中。通过对实验组小鼠与对照组小鼠血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶的检测结果对比分析，归巢至肝脏的人羊膜上皮细胞对受损肝脏有明显的修复作用。

综上所述，CFSE标记的人羊膜上皮细胞经小鼠尾静脉移植后能够定植到肝脏，并对肝损伤有一定的修复作用，为临床治疗肝脏功能损伤提供了理论支持。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

人羊膜上皮细胞对四氯化碳诱导小鼠肝损伤的定位修复

Human amnion epithelial cell transplantation provides a local repair of liver damage induced by carbon tetrachloride in mice

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