透明质酸水凝胶包裹骨髓间充质干细胞改善大鼠心肌梗死后心功能

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0434

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (5): 675-679.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0434

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透明质酸水凝胶包裹骨髓间充质干细胞改善大鼠心肌梗死后心功能

商青青^1，2，周建业¹，李凯¹，孙嘉康¹，孟健¹，李君¹

¹中国医学科学院，北京协和医学院，国家心血管病中心，阜外心血管病医院，心血管疾病国家重点实验室，北京市 100037；²滨州医学院附属医院疼痛科，山东省滨州市 256603

修回日期:2017-09-17 出版日期:2018-02-18 发布日期:2018-02-18
通讯作者: 周建业，硕士，教授，中国医学科学院，北京协和医学院，国家心血管病中心，阜外心血管病医院，心血管疾病国家重点实验室，北京市 100037
作者简介:商青青，女，1987年生，山东省巨野县人，汉族，2014年北京协和医学院毕业，硕士，主要从事慢性疼痛及心血管组织工程研究。现工作单位为滨州医学院附属医院疼痛科。

Combination of hyaluronic acid and bone marrow mesenchymal stem cells promotes cardiac function after myocardial infarction

Shang Qing-qing^{1, 2}, Zhou Jian-ye¹, Li Kai¹, Sun Jia-kang¹, Meng Jian¹, Li Jun¹

¹State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Fuwai Hospital, National Center for Cardiovascular Diseases, Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100037, China; ²Department of Pain, Affiliated Hospital of Binzhou Medical University, Binzhou 256603, Shandong Province, China

Revised:2017-09-17 Online:2018-02-18 Published:2018-02-18
Contact: Zhou Jian-ye, Master, Professor, State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Fuwai Hospital, National Center for Cardiovascular Diseases, Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100037, China
About author:Shang Qing-qing, Master, Physician, State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Fuwai Hospital, National Center for Cardiovascular Diseases, Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100037, China; Department of Pain, Affiliated Hospital of Binzhou Medical University, Binzhou 256603, Shandong Province, China

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
透明质酸：是一种线性的糖胺聚糖，在多种天然组织细胞外基质中含量丰富，参与细胞黏附、迁移、增殖及分化，在机体组织水分保持、关节润滑和损伤修复过程中发挥重要作用。透明质酸通过化学交联方法能形成具备一定特性和机械性能的水凝胶。
可注射水凝胶修复梗死心肌的作用机制：①作为细胞移植的载体，通过其本身的黏滞性阻止因心脏跳动和静脉回流导致的细胞逃逸，提高移植细胞的滞留，并能为移植的细胞提供合适的三维立体生长环境，防止细胞的失巢凋亡，提高细胞存活率；②作为蛋白或者生长因子的控制释放载体，防止这些生物活性分子被体内的酶降解，阻止其一过性释放，延长生物活性分子在体内的作用时间，并实现局部用药；③水凝胶通过材料堆积增加梗死区室壁厚度，提供力学支撑；④性能优良的水凝胶能为内源性修复创造条件，为干细胞植入提供附着支架；⑤水凝胶降解的活性生物片段招募内源性干细胞，促进心肌再生。

摘要
背景：细胞移植后的低存活率是限制细胞治疗效果的一个重要因素，其解决方法之一是用生物材料作为移植细胞的载体。
目的：探索透明质酸水凝胶包裹骨髓间充质干细胞对心肌梗死大鼠心功能的影响。
方法：分离培养雄性SD大鼠骨髓间充质干细胞，然后用透明质酸水凝胶包裹骨髓间充质干细胞在培养皿中进行体外三维培养。结扎雌性SD大鼠前降支制作大鼠心肌梗死模型，1周后行超声检测，将符合条件的大鼠随机分为4组：①PBS对照组(n=8)；②水凝胶组(n=8)；③细胞组(n=29)；④细胞+水凝胶组(n=29)。造模1周后将模型鼠行二次开胸，按照分组将移植物注射到梗死边缘区及梗死区。移植后1 d和1，2周，RT-PCR评价细胞的存活率，TUNEL检测移植细胞的凋亡率；移植后4周，超声检测心功能。
结果与结论：①移植后1 d及2周，细胞+水凝胶组的移植细胞存活率显著高于单纯细胞组(P < 0.05)；②移植后1 d及1周，细胞+水凝胶组的移植细胞凋亡率显著低于单纯细胞组(P < 0.05)；③移植后4周，细胞+水凝胶组的心功能显著改善，与其他组比较差异有显著性意义(P < 0.05)；④结果表明，透明质酸水凝胶提高了移植细胞的存活率，使得心肌梗死部位早期(2周之内)有更多的细胞参与损伤心肌的修复过程，达到了显著改善心功能的效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-3332-2642(商青青)

关键词: 透明质酸, 骨髓间充质干细胞, 心肌梗死, 细胞移植, 心功能, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: The poor retention and survival of donor cells implanted into the myocardium limit the efficacy of cell therapy for myocardial infarction. Embedding cells in natural or synthetic biomaterials is a strategy to address this issue.
OBJECTIVE: To explore the effects of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) encapsulated in hyaluronic acid (HA) hydrogel on cardiac function after myocardial infarction.
METHODS: BMSCs from male Sprague-Dawley rats were isolated and cultured, and then HA-encapsulated BMSCs were cultured in vitro in the three-dimensional manner. A model of myocardial infarction was made by cutting the anterior descending artery of female Sprague-Dawley rats. After 1 week, the model rats were screened by ultrasonic testing and then eligible ones were randomly divided into four groups: PBS group (n=8), HA group (n=8), BMSCs group (n=29), and HA-encapsulated BMSCs group (n=29). At 1 week after modeling, the model rats underwent the secondary thoracotomy and the implants were injected into the marginal zone and infarcted region in corresponding groups. The survival rate and apoptosis of implanted cells were examined at post-injection day 1, week 1 and week 2 by RT-PCR and TUNEL respectively. At post-injection week 4, changes of cardiac microstructure and function were evaluated by histological examination and echocardiography.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the BMSCs group, HA hydrogel significantly enhanced the survival rate and reduced the apoptotic rate of BMSCs at post-injection day 1 and week 2 (both P < 0.05). At post-injection week 4, the HA+BMSCs combined treatment yielded the best recovery of cardiac function (P < 0.05). To conclude, HA hydrogel can act as a vehicle for BMSCs delivery and improve the beneficial effects of implanted BMSCs in early myocardial repair (within 2 weeks after infarction) via enhancing cell retention and survival.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Myocardial Infarction, Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Hyaluronic Acid, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

商青青，周建业，李凯，孙嘉康，孟健，李君. 透明质酸水凝胶包裹骨髓间充质干细胞改善大鼠心肌梗死后心功能[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(5): 675-679.

Shang Qing-qing, Zhou Jian-ye, Li Kai, Sun Jia-kang, Meng Jian, Li Jun. Combination of hyaluronic acid and bone marrow mesenchymal stem cells promotes cardiac function after myocardial infarction[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(5): 675-679.

图/表（结果） 2

2.1 透明质酸水凝胶提高移植细胞的滞留存活率 见图1。在体外，用透明质酸水凝胶包裹骨髓间充质干细胞在 35 mm培养皿中进行三维培养(图1A)。培养72 h时，没有细胞从透明质酸水凝胶中迁移到培养皿表面。

在体内，RT-PCR结果(图1C)表明，移植1 d时，细胞+水凝胶组的细胞存活率(55.72±27.49)%明显高于单纯细胞组(7.66±5.6)%(P=0.041)；移植1周时，两组差异不明显[细胞+水凝胶组为(3.45±3.45)%，细胞组为(3.87±3.32)%，P=0.887]；移植2周时，细胞+水凝胶组的细胞存活率为(0.27±0.07)%，细胞组为(0.08±0.06)%，两组比较差异有显著性意义(P=0.025)。

TUNEL实验进一步证实：在移植1 d时，细胞+水凝胶组没有检测到细胞凋亡(图1F，表1)，而单纯细胞组细胞凋亡严重(图1D)，两组比较差异有显著性意义(P=0.017)；移植1周时，细胞+水凝胶组的细胞加速凋亡(图1H，表1)；移植2周时，两组细胞凋亡率差异无显著性意义(表1)。

2.2 心功能 为了评价水凝胶与细胞组成的复合物对心功能的改善情况，移植后4周对各个实验组进行超声心动图检测，具体结果见表2。在移植前，4组的左室射血分数比较差异无显著性意义(P=0.323)。然而，移植后4周各组射血分数呈现出不同的变化：与移植前相比，PBS组的左室射血分数值显著降低，水凝胶组及细胞组的左室射血分数值差异不大，细胞+水凝胶组的左室射血分数值增高。

细胞组左室射血分数的相对变化值与PBS组相比差异无显著性意义。水凝胶组的左室射血分数变化值与PBS组比，差异有显著性意义(P=0.023)。细胞+水凝胶组的左室射血分数相对变化值是最高的，与PBS组(P=0.001)及细胞组(P=0.026)相比差异有显著性意义。

左室的短轴缩短率与射血分数呈现同样的变化趋势(表2)。

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引言

心肌梗死已成为当今社会威胁全人类生命与健康的主要疾病之一^[1]。心肌梗死后，缺血的心肌细胞大量死亡，且心脏自身再生能力有限，梗死区无法修复^[2]。近几年细胞治疗展现出修复受损心脏、阻止心室重塑进展的优良潜能，进而改善心肌梗死存活者的预后^[3-4]。从临床角度看，骨髓来源间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)自身具有很多优点，如易于获取及免疫原性低，成为心血管领域中细胞移植治疗的常用细胞^[5]。

尽管骨髓来源细胞移植修复受损心脏是安全的，但是临床试验显示射血分数只有轻度提高(0-5%)^[6-8]，这远远不能达到临床要求。低移植率是限制细胞治疗效果的一个重要因素，而因心脏跳动导致的机械丢失、失巢凋亡及缺血缺氧诱导凋亡是移植细胞低存活率的主要机制^[3^，⁵^，^9-10]。研究表明，用生物材料作为移植细胞的载体，其可通过生物材料本身具有的黏性防止因心脏跳动导致的细胞流失，并且合适的材料能为移植细胞提供黏附位点和生长微环境，降低失巢凋亡以及营养缺失导致的细胞凋亡^[11]。

透明质酸(hyaluronic acid，HA)广泛存在于动物组织的细胞外基质中，可以通过化学修饰方法形成一种可注射、原位聚合的水凝胶。由于具有可降解性及良好的生物相容性，透明质酸水凝胶在三维细胞培养及组织工程领域中受到广泛关注与应用^[12-16]。透明质酸水凝胶不仅能为细胞生长提供较理想的三维立体环境，更能支持细胞的生长行为，例如干细胞的活性、增殖等^[17]。因此，作者假设：①透明质酸水凝胶能提高细胞的移植存活率；②由透明质酸与骨髓来源间充质干细胞构成的复合物能增加单纯细胞移植的治疗效果，并在大鼠心肌梗死模型中进行了验证。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 移植前后对比观察动物实验。

1.2 时间及地点 于2013年3月至2014年7月在北京协和医学院阜外心血管病医院心血管疾病国家重点实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 健康雄性三四周龄的SPF级SD大鼠20只，体质量60 g左右，用于分离骨髓间充质干细胞；健康雌性6-8周龄SD大鼠74只，体质量220 g左右；均由北京大学医学部提供，许可证号：SCXK(京)2001-0012。动物饲养环境为清洁级，实验过程对动物的处置符合相关动物伦理学要求。

1.3.2 实验用主要试剂、设备 DMEM培养液及胎牛血清(Gibco，美国)；磷酸盐缓冲液(Sigma，美国)；CM-DIL(Invitrogen，美国)；IX70型倒置相差荧光显微镜(Olympus，日本)；组织切片机、冰冻切片机(Leica，德国)；荧光封固剂(含DAPI)(北京中山金桥生物公司)。

1.4 方法

1.4.1 大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及标记^[18] 采用颈椎脱臼法处死SD大鼠，取股骨和胫骨，用5 mL注射器吸取DMEM细胞培养液反复冲洗骨髓腔，尽量将冲出的块状骨髓冲散。将冲出的细胞接种于培养瓶内，于体积分数为5%CO₂、37 ℃细胞培养箱内原代培养，24 h后首次换液，以后每隔2 d换液1次，达70%-80%融合时以1︰2的比例传代。收集第2代细胞，加入1 g/L的CM-DIL 5 μL进行细胞标记，37 ℃孵育5 min，混匀后4 ℃冰箱放置15 min后备用。

1.4.2 透明质酸水凝胶的制备 按照透明质酸水凝胶试剂盒HyStem Hydrogel说明书制作0.8%的透明质酸水凝胶。用1 mL注射器向HyStem管形瓶中添加1.0 mL去离子水，用注射器向Extralink管形瓶中添加0.5 mL去离子水，将Extralink和HyStem按照1︰4比例混合，20 min内完成凝胶化。包封细胞时，先反应10 min，然后用移液枪吹吸溶液，使细胞在凝胶中均匀分布，再进行移植。

1.4.3 大鼠心肌梗死模型的制作 将雌性SD大鼠麻醉开胸后结扎前降支，以心脏前壁局部颜色转为苍白为标准。结扎后1周，使用超声心动图筛选符合条件的大鼠，心肌梗死入选标准是短轴缩短率小于30%。

1.4.4 动物分组及体内移植 将符合条件的大鼠随机分为4组：①PBS对照组(n=8)：心肌内注射50 μL PBS；②水凝胶组(n=8)：心肌内注射50 μL透明质酸水凝胶；③细胞组(n=29)：心肌内注射用50 μL PBS溶解的1×10⁶个骨髓间充质干细胞；④细胞+水凝胶组(n=29)：心肌内注射用50 μL透明质酸水凝胶包封的1×10⁶个骨髓间充质干细胞。造模1周后将模型鼠行二次开胸，按照分组将移植物注射到梗死边缘区及梗死区，移植物新鲜配制，5 min内注射完毕。移植后1 d和1，2，4周，按实验计划取相应数量的实验大鼠，经水合氯醛腹腔注射麻醉后处死，取出心脏进行以下实验。

1.4.5 Real-time PCR评价移植细胞存活率 收集1×10⁶雄性大鼠骨髓间充质干细胞并提取基因组DNA，Real-time PCR扩增SRY基因，制作细胞数和SRY基因Ct值的标准曲线。移植后1 d和1，2周，收集细胞组、细胞+水凝胶组大鼠(n=3)心室，取移植部位所在的左室前壁及室间隔称质量，提取DNA并检测浓度，Real-time PCR扩增SRY基因，根据标准曲线每毫克DNA中计算出存活的移植细胞数目。再根据Van der Laarse等^[19]关于心室质量与心室DNA含量关系的公式Y=1.391X+0.55[X：心室质量(g)，Y：心室DNA含量(mg)]计算出心室中存活的移植细胞总数。

1.4.6 TUNEL检测移植后骨髓间充质干细胞凋亡水平 移植后1 d和1，2周，细胞组、细胞+水凝胶组大鼠(n=4)经水合氯醛腹腔注射麻醉后处死，以解剖刀自二尖瓣乳头肌水平沿心脏短轴方向切开(大致将移植区均分为2部分)，OCT包埋，-80 ℃冷冻保存。按照TUNEL试剂盒说明书进行染色，加入适量TUNEL混合液到已完成通透性处理的组织切片上，37 ℃孵育60 min，PBS洗涤，用含DAPI的封固剂封固。激光扫描共聚焦显微镜观察拍照，每个切片随机选取4个视野。DAPI与CM-DIL同时阳性者为移植细胞，DAPI、CM-DIL与TUNEL同时阳性者为移植细胞的凋亡细胞。统计移植细胞的总数及凋亡的移植细胞数目，计算移植细胞的凋亡率。

1.4.7 超声心动图评价心功能 移植后4周进行第2次超声心动图检查，评价各组大鼠(n=8)左心功能。取左室乳头肌水平二维左室短轴切面，记录左室收缩末期直径(left ventricular end-systolic diameters，LVESd)及左室舒张末期直径(left ventricular end-diastolic diameters，LVEDd)，由超声机自动计算出左室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)及左室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening，LVFS)。FS(%)=[(LVEDd-LVESd)/LVEDd]×100%，EF(%)=[(LVEDd³-LVESd³)/LVEDd³]×100%。

1.5 主要观察指标 移植细胞存活率，移植细胞凋亡率，大鼠左室射血分数和左室短轴缩短率。

1.6 统计学分析 结果数据表示为x(_)±s，数据图中用误差棒表示标准差。两组比较用t 检验，多组比较用单因素方差分析，进一步两两比较用SNK检验。应用SPSS 17.0进行统计学分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

实验结果表明透明质酸水凝胶能提高移植细胞的存活率，然后通过比较移植后4周大鼠的射血分数，证实了透明质酸水凝胶作为骨髓间充质干细胞移植的载体促进了大鼠心肌梗死后心功能的改善。

研究表明移植到心肌组织中的细胞首先会由于心脏跳动和静脉回流而遭受机械性丢失^[20-21]，随后会因没有合适的黏附位点导致发生失巢凋亡^[22]，最后会面临缺血缺氧的微环境继续凋亡^[10^，^23-24]。实验结果显示，包裹在透明质酸水凝胶中的移植细胞与单纯注射溶解在PBS中的细胞相比，在注射后1 d时，前者细胞数量是后者的7倍左右，并且前者没有凋亡发生，而后者有8.02%左右的凋亡。因此，透明质酸水凝胶有能力阻止细胞的机械性丢失及失巢凋亡。从注射后1 d到1周这段时间内，细胞+水凝胶组的细胞存活率急剧下降。TUNEL实验进一步确认了1周时细胞+水凝胶组的细胞凋亡情况严重，表明这种水凝胶并不能阻止因为缺血缺氧而导致的细胞凋亡。

研究表明骨髓来源的细胞移植修复受损心脏，其射血分数只有轻度的提高(0-5%)^[6^，^25]。实验结果显示，单纯细胞移植组和单纯透明质酸水凝胶组注射前后心功能变化差异无显著性意义，但相对于PBS组心功能恶化而言，这两种处理措施阻止了心功能的恶化，其中细胞移植组相当于提高心功能(-4.89±15.70)%，这与文献报道一致。而水凝胶与骨髓干细胞的结合则大幅度地改善了心功能，相当于提高了(12.37±14.42)%，表明水凝胶与干细胞发挥了协同作用。结合细胞的存活情况，作者认为由于透明质酸水凝胶载体的留滞作用，使得心肌梗死部位早期(2周之内)有更多的细胞参与了损伤心肌的修复过程，达到了显著改善心功能的效果，但是这个过程的具体机制尚待进一步研究。另外，如果采取措施增加干细胞对缺氧的耐受，使干细胞存活的时间更长，对心功能改善的贡献也值得探索。

总之，透明质酸水凝胶作为骨髓间充质干细胞的运输载体，能改善大鼠心肌梗死后的心功能。由骨髓间充质干细胞与透明质酸水凝胶组成的复合物在心肌梗死治疗方面有较好的应用价值，值得进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

透明质酸水凝胶包裹骨髓间充质干细胞改善大鼠心肌梗死后心功能

Combination of hyaluronic acid and bone marrow mesenchymal stem cells promotes cardiac function after myocardial infarction

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