甲萘醌7对体外培养大鼠骨髓基质细胞分化的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0431

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
骨髓基质细胞：是存在于骨髓内，有不定向多方向分化潜能的一类干细胞，具有分化成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞和脂肪细胞等细胞的潜能，目前常用于细胞实验中。
甲萘醌7：是维生素K2最广泛、最强大的活性成分，有抗骨质疏松等作用，但在关于其在体外对骨髓基质细胞的诱导作用尚未见报道。

摘要
背景：目前甲萘醌7的研究主要集中在其抗骨质疏松的作用方面，关于其对体外细胞培养体系中大鼠骨髓基质细胞的作用尚不明确。
目的：观察甲萘醌7对大鼠骨髓基质细胞增殖及分化的影响。
方法：提取大鼠骨髓基质细胞，体外培养扩增后，种植骨髓基质细胞于细胞培养皿中，分别用质量浓度10^-⁶，10^-⁵，10^-⁴ g/L的甲萘醌7及100 μg/L 的碱性成纤维细胞生长因子诱导骨髓基质细胞增殖，检测不同组骨髓基质细胞的相应吸光度值。于第2，4，6和8天检测骨髓基质细胞碱性磷酸酶水平和钙结节数量，并检测骨钙素、骨桥蛋白和Runx2蛋白的mRNA表达情况。
结果与结论：①细胞增殖：甲萘醌7诱导的骨髓基质细胞增殖良好，各浓度的甲萘醌7及碱性成纤维细胞生长因子组均有促进骨髓基质细胞增殖的作用(P < 0.05)；②相关蛋白mRNA表达：甲萘醌7组比对照组能表达更多的碱性磷酸酶和钙结节。质量浓度10^-⁴ g/L的甲萘醌7能上调骨钙素、骨桥蛋白和Runx2蛋白mRNA的表达(P < 0.05)；③结果证实，甲萘醌7能诱导骨髓基质细胞向成骨方向分化，可用于骨组织工程中种子细胞的诱导剂。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-4042-4249(徐兵)

关键词: 甲萘醌7, 碱性成纤维细胞, 干细胞, 骨髓干细胞, 骨髓基质细胞, 细胞增殖, 碱性磷酸酶, 成骨分化, 骨组织工程

Abstract:

BACKGROUND: The current research on menadione 7 mainly focuses on its anti-osteoporosis effect, and its role in rat bone marrow stromal cells in vitro culture system is unclear.
OBJECTIVE: To investigate the effect of menadione-7 on the proliferation and differentiation of Bone marrow stromal cells, and to provide theoretical basis for the application of menadione-7 in bone tissue engineering.
METHODS: Bone marrow stromal cells were obtained from rats by surgery. After cultured in vitro, bone marrow stromal cells were incubated in cell culture dishes. The proliferation of bone marrow stromal cells was induced by 10^-6, 10^-5 and 10^-4 g/L menadione-7 and 100 μg/L basic fibroblast growth factor (bFGF). The corresponding absorbance value of bone marrow stromal cells was detected in each group. The levels of alkaline phosphatase and the number of calcium nodules in bone marrow stromal cells were detected at 2, 4, 6 and 8 days, and the mRNA expression of osteocalcin, osteopontin and Runx2 was detected at 4, 6 and 8 days.
RESULTS AND CONCLUSION: Bone marrow stromal cells induced by menadione-7 proliferated well, and the cell proliferation could be promoted by different concentrations of menadione-7 and bFGF (P < 0.05). More alkaline phosphatase and calcium nodules were expressed in menadione-7 groups than the control group. The mRNA expression of osteocalcin, osteopontin and Runx2 could be significantly up-regulated by 10^-4 g/L menadione-7 (P < 0.05). To conclude, bone marrow stromal cells can be induced by menadione-7 into osteogenic differentiation and menadione-7 can be used as an inducer for seed cells in bone tissue engineering.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Tissue Engineering, Cell Proliferation, Alkaline Phosphatase

中图分类号:

R394.2

徐兵，柳园. 甲萘醌7对体外培养大鼠骨髓基质细胞分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(5): 657-661.

Xu Bing, Liu Yuan. Menadione-7 induces the differentiation of rat bone marrow stromal cells in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(5): 657-661.

图/表（结果） 1

参考文献

[1] Kagami H, Agata H, Inoue M, et al. The use of bone marrow stromal cells (bone marrow-derived multipotent mesenchymal stromal cells) for alveolar bone tissue engineering: basic science to clinical translation. Tissue Eng Part B Rev. 2014;20: 229-232.

[2] Ohgushi H. Osteogenically differentiated mesenchymal stem cells and ceramics for bone tissue engineering. Exp Opin Biol Ther. 2014;14:197-208.

[3] Polymeri A, Giannobile WV, Kaigler D. Bone Marrow Stromal Stem Cells in Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Horm Metab Res. 2016;48:700-713.

[4] Yang M, Zhang H, Gangolli R. Advances of mesenchymal stem cells derived from bone marrow and dental tissue in craniofacial tissue engineering. Curr Stem Cell Res Ther. 2014;9(3):150-161.

[5] Hoch AI, Leach JK. Concise review: optimizing expansion of bone marrow mesenchymal stem/stromal cells for clinical applications. Stem Cells Transl Med. 2014;3(5):643-652.

[6] Mendez-Ferrer S, Scadden DT, Sanchez-Aguilera A. Bone marrow stem cells: current and emerging concepts. Ann N Y Acad Sci. 2015;1335:32-44.

[7] Anthony BA, Link DC. Regulation of hematopoietic stem cells by bone marrow stromal cells. Trends Immunol. 2014;35: 32-37.

[8] Do HV, Loke WT, Kee I, et al. Characterization of Insulin-Secreting Porcine Bone Marrow Stromal Cells Ex Vivo and Autologous Cell Therapy In Vivo. Cell Transplant. 2015; 24:1205-1220.

[9] Ozdal-Kurt F, Tuglu I, Vatansever HS, et al. The effect of autologous bone marrow stromal cells differentiated on scaffolds for canine tibial bone reconstruction. Biotech Histochem. 2015;90:516-528.

[10] Zhou BO, Yue R, Murphy MM, et al. Leptin-receptor-expressing mesenchymal stromal cells represent the main source of bone formed by adult bone marrow. Cell Stem Cell. 2014;15:154-168.

[11] Aubin JE. Osteoprogenitor cell frequency in rat bone marrow stromal populations: role for heterotypic cell-cell interactions in osteoblast differentiation. J Cell Biochem. 1999;72: 396-410.

[12] 常祺,刘建,胡蕴玉,等.bFGF对兔骨髓基质细胞VEGF因子表达及细胞生物行为的影响[J].第四军医大学学报,2003,24(19): 1748-1751.

[13] 李春明,杨春艳,王鑫,等.bFGF基因修饰的骨髓基质细胞复合多孔矿化Bio-Oss胶原修复下颌骨缺损的实验研究[J].实用口腔医学杂志,2008,24(4):470-474.

[14] 徐忠世,肖德明,林博文,等.bFGF转染骨髓基质细胞培养及修复软骨缺损的动物实验[J].南方医科大学学报,2009,29(6): 1123-1126.

[15] Bai Y, Li P, Yin G, et al. BMP-2, VEGF and bFGF synergistically promote the osteogenic differentiation of rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Biotechnol Lett. 2013;35(5):301-308.

[16] Yuan S, Pan Q, Fu CJ, et al . Effect of growth factors (BMP-4/7 & bFGF) on proliferation & osteogenic differentiation of bone marrow stromal cells. Indian J Med Res. 2013;138:104-110.

[17] 胡军,邢达,张爱斌,等.冲击波诱导人骨髓基质细胞体内成骨研究[J].生物化学与生物物理进展,2006,33(5):452-457.

[18] 金小岚,郎红梅,万勇,等.不同氧浓度对骨髓基质细胞向成骨细胞分化的影响[J].中国病理生理杂志,2010,26(5):982-986.

[19] 张海峰,杜子婧,姜闻博,等.3D打印PLA-HA复合材料与骨髓基质细胞的相容性研究[J].组织工程与重建外科杂志,2015,11(6): 349-353.

[20] 杜朝阳,戴彩华.环孢素A联合康力龙对慢性再生障碍性贫血患者骨髓基质细胞相关细胞因子的影响[J].中国老年学杂志,2015, 35(4):955-957.

[21] 杜密,潘婉,杨丕山,等.阿司匹林对小鼠骨髓基质细胞生物活性的影响[J].中华口腔医学杂志,2016,51(3):160-165.

[22] 贾延,杨于嘉,周燕,等.黄芩甙诱导大鼠骨髓基质细胞向神经细胞分化的研究[J].中华医学杂志,2002,82(19):1337-1341.

[23] 万蕾蕾,刘宏伟.β-磷酸三钙复合骨髓基质细胞构建组织工程骨的实验研究[J].口腔医学研究,2010,26(4):497-500.

[24] 王和鸣,王力,李楠.巴戟天对骨髓基质细胞向成骨细胞分化影响的实验研究[J].福建中医学院学报,2004,14(3):16-20.

[25] 张雷,张媛,倪红霞,等.黄芩甙体外诱导大鼠骨髓基质细胞向神经干细胞的分化[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(27): 5054-5057.

[26] 刘钰瑜,崔燎,吴铁,等.大黄素对体外大鼠骨髓基质细胞向脂肪细胞方向分化的影响[J].中国药理学通报,2005,21(7):842-847.

[27] 李拖平,郭梅,王娜.枯草杆菌发酵生产VK2的技术工艺条件初探[J].食品科学,2008,20(11):2354-2357.

[28] 蒋雨薇,饶智国.维生素 K2 抗肿瘤作用的研究进展[J].实用癌症杂志,2015,30(1):156-158.

[29] 应卫星,陈华,李荣洲.维生素 K2 联合苯那普利对裸鼠胃癌的治疗作用及其机制的研究[J].中国药学杂志,2012,47(3):186-189.

[30] 周小芸,王艳红,薛琼.维生素K2干预肝癌的实验研究[J].中国临床医学,2009,16(1)75-79.

[31] 雷泽,付正启,木晓云.维生素 K2-新型骨质疏松防治药物[J].中国骨质疏松杂志,2010, 16(1):2063-2066.

[32] 邹志强.维生素 K2 的研究进展[J].中国骨质疏松杂志,2005, 11(3):389-392.

[33] Shearer MJ. Vitamin K and vitamin K-dependent protein. Br J Haemal. 1990;75(2):156-162.

[34] Ferland G. The Vitamin K-dependent portein: an update. Nutr Rev. 1998;56(8):223-230.

引言

材料方法

1.1 设计 细胞学实验。

1.2 时间及地点 于2017年4至9月在南方医科大学生物实验室完成。

1.3 材料

实验动物：健康2月龄SD大鼠2只，体质量15-25 g，雌雄不限，由南方医科大学动物中心提供，许可证号：SCXK 20090002。

1.4 实验方法

1.4.1 骨髓基质细胞培养 取2月龄SD大鼠，手术中去除胫骨和股骨附着的软组织，并去除骺软骨，露出髓腔后用无菌注射器抽含有胎牛血清及MEM培养液的混合液反复冲洗髓腔，冲洗出髓腔液并转移入离心管中，高速离心8 min，弃上清液。沉淀物加入体积分数15%的胎牛血清和MEM培养液反复吹打，使细胞悬浮。

计数细胞数量后，每个培养瓶中装约10⁵的细胞量，细胞置于恒温细胞培养箱中培养，每隔2 d换液1次。约半个月后细胞贴壁形成单层细胞，用胰蛋白酶消化并传代培养。取第3代细胞用于实验。

1.4.2 甲萘醌7对骨髓基质细胞增殖的影响 采用MTT法检测，将大鼠骨髓基质细胞接种入3块24孔板中，细胞浓度10⁴/孔。实验分为5组，实验组根据质量浓度不同包括3组，分别加入不同质量浓度(10^-⁶，10^-⁵，10^-⁴ g/L)的甲萘醌7(上海宝曼生物科技有限公司)，对照组加入等体积的生理盐水，阳性对照的碱性成纤维细胞生长因子组加入质量浓度100 μg/L的碱性成纤维细胞生长因子，调零孔仅加入培养基、MTT和二甲基亚砜，每组均设3个复孔。

分别在第1，4，7，10天检测细胞增殖情况，检测时弃上清后加入二甲基亚砜约150 μL入每孔，检测细胞在490 nm处的吸光度值并减去调零孔数值获得最终吸光度值，取均值。

1.4.3 甲萘醌7诱导骨髓基质细胞碱性磷酸酶和钙结节的表达 用第3代骨髓基质细胞接种入24孔板后培养，实验分为3组，甲萘醌7组(加入质量浓度10^-⁴ g/L的甲萘醌7)，阳性对照为碱性成纤维细胞生长因子组(加入质量浓度100 μg/L的碱性成纤维细胞生长因子)和对照组(加入生理盐水)。实验中用碱性磷酸酶试剂盒检测骨髓基质细胞在第1，4，7，10天的碱性磷酸酶的表达，同时检测钙结节的数量(Von Kossa染色法)，每组均检测3次，取均值。

碱性磷酸酶检测：①500 μL PBS冲洗2次，每次3 min；②40 g/L多聚甲醛固定8 min；③PBS洗2遍；④用吸附纸吸取残液，放封口膜上，加碱性磷酸酶底物50 μL在载玻片上，室温下放30 min；⑤PBS洗2遍；⑥体积分数80%甘油封固；⑦显微拍照。

钙结节的检测：①PBS冲洗2次，每次3 min；②多聚甲醛固定8 min；③蒸馏水冲洗2次；④体积分数5%硝酸银紫外下照20 min；⑤蒸馏水冲洗2次；⑥入体积分数2%硫代硫酸钠5 min；⑦水洗封固。

1.4.4 甲萘醌7诱导骨髓基质细胞成骨相应基因的表达 骨髓基质细胞按照10⁷ L^-¹的细胞浓度接种于细胞培养板中，随机分成实验组和对照组，实验组各孔均加入10^-⁴ g/L的甲萘醌7，对照组仅加入细胞培养液，然后于第4，6，8天收集细胞，检测骨桥蛋白、Runx2和骨钙素的mRNA含量，实验重复检测3次。

去除细胞培养液，贴壁细胞用PBS洗涤2次，各组细胞的总RNA均用Trizol法裂解细胞并提取。溶解细胞后，加入300 μL氯仿浸泡5 min，用离心机离心15 min(10 000 r/min)。离心后再2次分别用异丙醇及体积分数75%乙醇洗涤并离心，每次离心5 min。加入40 μL的ddH₂O溶解沉淀，低温保存备用。按照反转录试剂盒说明合成cDNA，低温保存备用。

建立PCR反应体系并扩增，采用Delta-delta Ct 法计算骨桥蛋白、Runx2和骨钙素的表达情况，引物信息(上海英拜生物科技有限公司设计)见表1。

1.5 主要观察指标 各组骨钙素、骨桥蛋白和Runx2的mRNA表达量。

1.6 统计学分析 数据用x(_)±s表示，不同组间数据的比较采用单因素方差分析和LSD法，P < 0.05表示差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

目前因骨髓基质细胞的解剖和生物学特性，越来越多的组织工程选用其为种子细胞。骨髓基质细胞是位于骨髓腔内，有大量骨髓基质细胞用于骨组织工程的研究证实其可被诱导成骨用于组织工程中^[1-4]，其内有各类细胞如脂肪细胞、成骨细胞、破骨细胞和软骨细胞的前体细胞^[1^，^5-6]，在不同的诱导情况下，骨髓基质细胞有不同的分化能力和分化方向，可被诱导成为成骨细胞、破骨细胞和脂肪细胞等^[7-10]。

有研究证实骨髓基质细胞包括定向性骨祖细胞和诱导性骨祖细胞，其中定向骨祖细胞能定向分化为成骨细胞、破骨细胞或软骨细胞，诱导性骨祖细胞在特定的刺激因子的作用下可被动的分化为特定的细胞体系^[11]。因此，探讨可行的诱导因子，研究其对骨髓基质细胞定向诱导分化能力对骨组织工程有重要的意义。

实验发现甲萘醌7可促进骨髓基质细胞增殖。关于甲萘醌7对骨髓基质细胞的增殖相关的研究目前比较少，实验发现甲萘醌7组比对照组在不同时间点吸光度值均更高，说明其有明显促进骨髓基质细胞增殖的作用，同时和碱性成纤维细胞生长因子组无差异，说明其对细胞促增殖作用强度和碱性成纤维细胞生长因子类似。

成骨细胞表达的特异性物质包括碱性磷酸酶和钙结节，表达的特异性基因包括Runx2、骨钙素、骨桥蛋白等，实验通过检测以上特异成骨标记物，发现甲萘醌7组和对照组对比明显增高，同时和碱性成纤维细胞生长因子组无统计学差异，说明甲萘醌7有特异性诱导骨髓基质细胞分化为成骨细胞的作用。

实验选用的阳性对照物碱性成纤维细胞生长因子对骨髓基质细胞的促进增殖作用已经被广泛证实^[12-16]，通过阳性对照物的对比研究进一步论证了甲萘醌7对骨髓基质细胞的促增殖和促成骨分化作用。

目前特定诱导骨髓基质细胞分化有多种方式，主要包括物理因素和生物因子因素。物理因素包括冲击波及人工材料等^[17-19]，生物因子因素包括中成药、地塞米松及阿司匹林等^[20-24]。有研究用巴戟天的提取物作用于骨髓基质细胞，发现能诱导其向成骨细胞分化^[24]。

张雷等^[25]通过提取Wistar大鼠骨髓基质细胞，并用黄芩甙体外诱导扩增，通过蛋白质印迹及RT-PCR等实验证实黄芩甙可在体外培养体系中刺激大鼠骨髓基质细胞向神经样细胞分化。有学者通过建立大鼠SD大鼠模型，通过油红O染色法及RT-PCR证明大黄素能诱导骨髓基质细胞向脂肪细胞分化^[26]。

甲萘醌7是和骨代谢密切相关并且有多种功效的物质，其又名七烯甲萘醌(MK-7)或者维生素K2(35)^[27]，是维生素K2中的最强大、最广泛的活性成分。甲萘醌7有多种功效，包括抗癌，抗骨质疏松及预防高血压等^[28-32]。

甲萘醌7主要是调节钙的代谢异常来抗骨质疏松的。有多种存在骨组织中的蛋白是依赖维生素K的，常见的包括S蛋白和骨钙素等^[33]，骨钙素别名是骨钙蛋白，有偶联骨形成和骨吸收、调节破骨细胞分化、调节破骨细胞活性等的生理作用^[34]。有研究证实，低羧化的骨钙素含量越高则骨密度越低，增加维生素K2能降低低羧化骨钙素含量，从而改变骨的物理特性，引起骨质更加致密，硬度更强和抗疲劳性更好。目前甲萘醌7用于诱导骨髓基质细胞尚未见相关的研究和报道，由于其和骨代谢密切相关，探讨其对骨髓基质细胞在体外培养体系中的相互作用，并用于定向诱导细胞分化有重要的意义。

实验认为甲萘醌7可作用刺激因子用于骨组织工程中。甲萘醌7作为诱导剂用于骨组织工程未见相关报道，实验经过研究，发现甲萘醌7能促进骨髓基质细胞向成骨方向分化，且其诱导分化能力和碱性成纤维细胞生长因子无明显差异。因此，甲萘醌7可作为组织工程的待选诱导剂，实验通过MTT及PCR等方法，论证了甲萘醌7在体外特定条件下对骨髓基质细胞相关作用，为骨组织工程选用良好有效的诱导剂奠定了理论基础。实验选用的骨髓基质细胞因取材容易、不定向分化等生物学特点，可作为骨组织工程的待选种子细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程