外泌体在间充质干细胞治疗骨性关节炎中的作用：新策略与新思路

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0424

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (1): 140-145.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0424

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外泌体在间充质干细胞治疗骨性关节炎中的作用：新策略与新思路

罗欣，余丽梅

遵义医学院附属医院贵州省细胞工程重点实验室，贵州省骨髓与羊膜干细胞基础与临床研究科技创新团队，贵州省细胞工程中心，遵义市干细胞与再生医学工程研究中心，贵州省遵义市 563003

修回日期:2017-06-16 出版日期:2018-01-08 发布日期:2018-01-08
通讯作者: 余丽梅，博士，教授，硕士生导师，主要从事干细胞与再生医学研究。遵义医学院附属医院贵州省细胞工程重点实验室，贵州省骨髓与羊膜干细胞基础与临床研究科技创新团队，贵州省细胞工程中心，遵义市干细胞与再生医学工程研究中心，贵州省遵义市 563003
作者简介:罗欣，男，1990年生，湖南省张家界市人，汉族，硕士，主要从事干细胞与再生医学研究，骨关节再生医学研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81260507)；遵义市科技计划项目[遵市科合(2016)6号]

Exosomes: a new strategy for mesenchymal stem cell transplantation in the treatment of osteoarthritis

Luo Xin, Yu Li-mei

Key Laboratory of Cell Engineering in Guizhou Province, Basic and Clinical Innovation Team of Bone Marrow and Amniotic Stem Cells, Cell Engineering Center of Guizhou Province, Engineering Research Center of Stem Cells and Regeneration of Zunyi City, the Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563003, Guizhou Province, China

Revised:2017-06-16 Online:2018-01-08 Published:2018-01-08
Contact: Yu Li-mei, M.D., Professor, Master’s supervisor, Key Laboratory of Cell Engineering in Guizhou Province, Basic and Clinical Innovation Team of Bone Marrow and Amniotic Stem Cells, Cell Engineering Center of Guizhou Province, Engineering Research Center of Stem Cells and Regeneration of Zunyi City, the Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563003, Guizhou Province, China
About author:Luo Xin, Master, Key Laboratory of Cell Engineering in Guizhou Province, Basic and Clinical Innovation Team of Bone Marrow and Amniotic Stem Cells, Cell Engineering Center of Guizhou Province, Engineering Research Center of Stem Cells and Regeneration of Zunyi City, the Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563003, Guizhou Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81260507; Science and Technology Support Project in Zunyi, No. Zunshikehe (2016)6.

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
外泌体：囊泡在转运过程中，依据转运位置的不同可分为早期内涵体、晚期内涵体和循环内涵体，其中晚期内涵体可形成多泡体，进一步分泌一类直径为40-100 nm的膜性囊泡，即外泌体。外泌体主要通过两种方式发挥功能，即受体依赖性调控机制直接作用于靶细胞，或膜转运方式，转运膜受体、功能性蛋白质、mRNA和miRNA等活性物质发挥作用。
外泌体促进损伤组织再生的作用机制：在生理与病理性细胞外微环境中，外泌体不仅可以保护生物活性物质不被降解和稀释，还可以协调这些物质在组织液或血液中的远距离运输。越来越多的研究表明，间充质干细胞分泌的外泌体是干细胞发挥治疗作用的主要分子机制之一，它可广泛参与细胞间信号转导，特异性作用于靶细胞，调节微环境和炎症免疫，促进损伤组织再生。

摘要
背景：尽管间充质干细胞及其释放的外泌体有望成为治愈骨性关节炎的新措施，但具体的分子机制尚不清楚。
目的：在理解骨性关节炎发病主要机制和间充质干细胞重要特点的基础上，了解外泌体在间充质干细胞治疗骨性关节炎中的作用与机制。
方法：查阅2006至2016年期间，国内外有关骨性关节炎与外泌体、间充质干细胞来源外泌体与骨性关节炎的文献。检索词分别为“外泌体，间充质干细胞，骨性关节炎”和“exosomes，mesenchymal stem cells，osteoarthritis”。最后选择38篇文献纳入结果分析。
结果与结论：骨性关节炎是一类与年龄、劳损等相关的难治性疾病，采用间充质干细胞治疗已取得良好疗效。间充质干细胞的成软骨分化、微环境改善、旁分泌及外泌体作用等机制已被不断报道。外泌体可通过转运不同的生物活性蛋白质、脂质、核酸等分子介导细胞间信号转导和生物应答，与骨性关节炎发病机制有关，也涉及间充质干细胞所引起的骨关节组织再生修复。间充质干细胞分泌的外泌体可以通过改变膜交换和转运活性分子来促进骨关节组织再生，为确定骨性关节炎治疗新策略提供了新思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-4853-3650(罗欣)

关键词: 干细胞, 骨性关节炎, 间充质干细胞, 外泌体, 核糖核酸, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Although mesenchymal stem cells (MSCs) and MSCs-released exosomes are expected to become a new means for osteoarthritis, the concrete molecular mechanisms remain unclear yet.
OBJECTIVE: To understand the effect and mechanism of exosomes in the MSC treatment of osteoarthritis based on the main pathogenesis of osteoarthritis and characteristics of MSCs.
METHODS: Domestic and foreign articles concerning MSCs and MSCs-released exosomes for the osteoarthritis treatment published from 2006 to 2016 were retrieved and analyzed. The keywords used were “exosomes, mesenchymal stem cells, osteoarthritis” in Chinese and English, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: Osteoarthritis is a refractory disease associated with age and strain, and MSCs therapy has been obtained a good effect. Cartilage differentiation, microenvironment improvement, paracrine and exosomes mechanism of MSCs have also been reported. Exosomes play an important role in mediating intercellular signal transduction and biological responses by transferring a variety of biologically active proteins, lipids, nucleic acids and other molecules. The changes are not only related to the osteoarthritis pathogenesis, but also involved in MSCs induced regeneration and repair of bone and joint tissues. Exosomes secreted by MSCs can improve bone and joint tissue regeneration through membrane exchange and transport of active molecules. This will provide a new insight into the osteoarthritis treatment.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Mesenchymal Stem Cells, Osteoarthritis, Exosomes, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

罗欣，余丽梅. 外泌体在间充质干细胞治疗骨性关节炎中的作用：新策略与新思路[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(1): 140-145.

Luo Xin, Yu Li-mei. Exosomes: a new strategy for mesenchymal stem cell transplantation in the treatment of osteoarthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(1): 140-145.

图/表（结果） 2

2.1 关节软骨退行性变与骨性关节炎的发病机制 健康的关节软骨属透明软骨，表面光滑，呈淡蓝色，厚1-5 mm。关节软骨在关节活动中负责传导生物负载、吸收震荡，以及抗磨损和润滑作用。30岁以后，人的关节软骨趋于纤维变性，弹性和延伸能力弱化，加上关节液减少，使关节腔变得干燥，软骨易于磨损和损伤。随着年龄的增长，人体机能和运动能力逐渐下降，软骨下滋养血管数量减少，软骨生理、生化异常改变，细胞外基质蛋白多糖生物合成和分解异常，软骨细胞不能合成正常的具有长链结构的透明质酸和聚氨基葡萄糖，导致关节软骨局部软化、失去弹性及易于丢失基质，关节僵硬和炎性症状逐渐加重^[4]。

软骨细胞中活性组分与基质等成分的合成与分解受到一系列分子的严格调控，而微环境的动态平衡则是保持关节软骨正常发挥功能的关键。骨形态发生蛋白和软骨源性形态发生蛋白在促进合成代谢方面发挥重要作用。其中骨形态发生蛋白3、骨形态发生蛋白7、软骨源性形态发生蛋白1和软骨源性形态发生蛋白2均在正常软骨组织中高表达，而在骨性关节炎损伤的软骨中低表达或不表达，并在体内外软骨形成实验中发挥促进作用。相反，白细胞介素17及其相关分子则负向调控骨形态发生蛋白和软骨源性形态发生蛋白的表达^[5-6]。其中，白细胞介素17β在关节软骨的中区和深区表达，为主要负反馈作用分子，白细胞介素1和肿瘤坏死因子α等炎性因子也参与了关节软骨基质的降解。

骨性关节炎的病理机制中涉及NF-κB、p38MAPK和Wnt/β-catenin等细胞信号通路、巨噬细胞自噬清除、多种转录因子和miRNA的调控，以及肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6、白细胞介素10等促炎与抑炎因子失衡、雌激素和机械应力等细胞外因素刺激等^[7-8]。近年来有关外泌体在骨性关节炎发病机制中的作用不断被发现，早期关节腔微环境中的外泌体能代偿性分泌一些抑炎因子和miRNA等保护因素来延缓疾病进程；而中晚期，外泌体则会分泌过多的血管生成因子、促纤维化蛋白和促炎miRNA等来加速骨性关节炎的病理进展。

现有骨性关节炎的治疗主要包括非类固醇类抗炎药物、中医药及外科手术。1994年Brittberg等^[9]首次报道了自体骨软骨移植术(马赛克成形术)，但因软骨膜移植存在供区损伤等问题，难以适合较大面积的软骨缺损修复；随之发展的同种异体软骨移植术，也因移植物尺寸难控制，存在传染病风险和免疫排斥反应等，且有效作用期较短，成本较高，难以普及。自体软骨细胞移植技术，虽然治疗效果让人惊喜，但只适用于小面积软骨损伤，而且会遗留一部分损伤无法修复，或加重疾病进展^[10]。21世纪以来，基于干细胞移植的细胞治疗已成为热点，动物实验和临床研究均证实了它的有效性，为骨性关节炎的治愈带来了新策略。

2.2 外泌体的特征与间充质干细胞的分泌功能 在囊泡转运过程中，依据转运位置的不同可分为早期内涵体、晚期内涵体和循环内涵体，其中晚期内涵体会形成多泡体，并能进一步分泌形成外泌体。1980年，这些小囊泡首次发现于羊网织红细胞的分泌物中^[11]。1996年，Raposo等^[12]发现B淋巴细胞分泌的外泌体具有激活免疫系统的作用，可参与适应性免疫应答。此后研究者们相继报道了外泌体囊泡中含有多种功能性蛋白，并不断阐明外泌体在细胞间的信号传递作用，即外泌体能够运载mRNA至靶细胞，翻译成相应的功能蛋白，还能负载miRNA，沉默某些功能基因表达。

随着外泌体在众多疾病中的病理作用被不断明确，2010年，间充质干细胞来源外泌体也被首次报道，其可明显减轻小鼠心肌缺血再灌注损伤^[13]，至此，外泌体所产生的强大作用日益受到学术界的高度关注。间充质干细胞来源外泌体不仅表达外泌体特异性表面标志物CD9和CD81，还表达间充质干细胞特异性表型CD29、CD44、CD73和CD90等^[14]。

大多数间充质干细胞来源的外泌体除携带细胞膜骨架蛋白、微管蛋白、肌动蛋白和肌球蛋白外，还携带 CD9、CD63、CD81、CD82、Hspa8、Hsp60、Hsp70和Hsp90、ALG-2相互作用蛋白Ⅹ与肿瘤易感基因101蛋白，代谢相关蛋白GAPDH、LDHA、PGK1和PKM，以及组织/细胞类型特异性MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ等功能性蛋白^[14]。间充质干细胞来源的外泌体还能转运mRNA、miRNA和siRNA等多种RNA，其中mRNA可直接在靶细胞中翻译出相应的功能蛋白质，发挥再生修复作用；miRNA 则通过沉默或抑制目标mRNA翻译来下调蛋白质在靶细胞中的表达(表1)；siRNA则可敲除受体细胞中的目标基因达到基因沉默的作用^[15]。外泌体也参与多种微环境中细胞信号转导，因此间充质干细胞来源外泌体在疾病发生、发展中的变化及疾病治疗中的作用日益受到关注。

2.3 外泌体与骨性关节炎微环境变化 关节腔是一个密闭的低氧环境，软骨细胞能够在此进行正常新陈代谢。骨性关节炎患者关节腔的极低氧环境明显加剧了关节软骨细胞的分解代谢，其中低氧诱导因子是协调骨性关节炎极低氧环境最主要的转录因子，低氧诱导因子1α可诱导血管内皮生长因子大量合成，形成侵蚀性血管翳，进一步破坏关节软骨^[16]。滑膜组织在低氧微环境中出现代偿性增生，趋化因子与其受体结合产生的趋化作用可诱导炎细胞浸润与促炎因子释放，形成慢性滑膜炎；同时软骨下骨供应血管功能紊乱进一步加剧低氧微环境的改变；恶性循环下，极低氧环境还能降低碱性磷酸酶的合成，促进白细胞介素1、白细胞介素6和MCP-1等促炎因子及趋化因子CXCL-12、COX-2、血管内皮生长因子和前列腺素E2等生成，诱发微环境中慢性炎症反应、软骨下骨硬化与骨赘形成^[17]。研究证明，这些骨性关节炎病理微环境的改变均与局部外泌体所携带的多种蛋白和RNA转运密切相关^[18]。

骨性关节炎微环境改变的另一个重要因素是胆固醇代谢。骨性关节炎发展中，受损软骨细胞的肝X受体α/β (Liver X Receptor α/β, LXR α/β)会大量流失，LXRα/β是胆固醇转运泵载脂蛋白A1(apolipoprotein A1, ApoA1)和ATP结合盒转运蛋白A1(ATP binding cassette subfamily A member 1, ABCA1)的关键转录调节因子，LXRα/β的减少会导致骨性关节炎微环境中ApoA1和ABCA1表达显著下调，从而阻碍胆固醇外流过程，导致细胞内脂质过度积累，进一步破坏软骨细胞^[19]。外泌体广泛参与骨性关节炎微环境中的胆固醇代谢，其携带的转录因子胆固醇调节元件结合蛋白2(sterol regulatory element binding protein-2, SREBP-2)和miRNA-33a是胆固醇代谢的基本调节因子。Kostopoulou等^[20]课题组在一系列关于骨性关节炎患者胆固醇微环境代谢的研究中发现，miRNA-33a在骨性关节炎患者的软骨细胞中显著升高，通过沉默靶标蛋白Smad7的转录过程提高转化生长因子β1的表达，再通过TGF-β1/PI3K/AKt/SREBP-2细胞信号途径大量增加软骨细胞内的胆固醇合成；miRNA-33a同时还能显著减少ABCA1和ApoA1的mRNA表达水平，从而阻碍胆固醇逆向转运过程，加重骨性关节炎的发展进程。Kostopoulou等^[21]还发现，在骨性关节炎患者RNA中大量存在SREBP-2 G/C序列的高频突变，能导致转化生长因子β诱导蛋白聚糖合成抑制，也是骨性关节炎微环境中胆固醇代谢障碍的机制之一。

微环境中Zn²⁺代谢失衡也与骨性关节炎密切相关，外泌体分泌的miRNA-488在骨性关节炎中表达下调，并受转化生长因子β3和白细胞介素1β的调控，能够下调锌转运因子8(Zinc transporter 8, ZIP8)，进而下调Zn²⁺敏感的金属调节转录因子1(Metal regulatory transcription factor 1, MTF-1)表达，导致MMP-3，MMP-13和ADAMTS-5高表达，可见miRNA-488/ZIP8/MTF1/ MMPs-ADAMTS5可能是骨性关节炎发病机制中至关重要的代谢调节轴线^[22]。骨性关节炎发生发展过程中，外泌体分泌的miRNA-155会显著上调，导致自噬关键调节因子Ulk1、FoxO3、Atg14、Atg5、Atg3、Gabarapl1和Map1lc3等分泌合成同样被抑制，致使微环境中免疫细胞的自噬清除功能紊乱^[23]。

2.4 外泌体释放的miRNAs介导骨性关节炎损伤的再生修复 在骨性关节炎的损伤与修复机制中，广泛存在于生物基因组中的非编码miRNA备受关注^[24]，大规模基因芯片技术分析发现34个与骨性关节炎发病和修复机制相关的miRNAs，其中14个miRNAs在骨性关节炎患者软骨中表达上调(miR-9, mir-16, miR-21, miR-22, mir-23b, mir-30b, miR-98, mir-103, mir-146a, mir-223, mir-377, mir-483, miR-483-5p和mir-509)，20个miRNAs在骨性关节炎患者软骨中表达下调(miR-25, miR-26a, mir-27a, mir-27b, miR-29a, miR-125b, miR-127-5p, miR-140, miR-146, miR-148a, miR-149, miR-210, miR-337, miR-373, miR-558, miR-576-5p, mir-634, mir-641, miR-675和mir-1227)^[25-26]。而不同来源间充质干细胞分泌的外泌体携带了不同含量的miRNAs，其表达正好能反向调节上述骨性关节炎患者软骨中miRNAs的改变，可能是间充质干细胞发挥再生修复作用的新机制(图1)。

研究发现，miR-140不但在长骨和扁骨的发育过程中广泛表达，还与软骨的发育和成软骨分化密切相关，骨性关节炎患者软骨细胞中miR-140表达显著下调，通过增加Dnpep基因表达，下调软骨细胞分泌MMP-13和BMP-2等，参与骨性关节炎的疾病进程^[27]。Miyaki等^[28]通过基因敲除及转基因过表达技术制造miRNA-140 (--/++)小鼠模型，发现miRNA-140介导了关节软骨蛋白多糖的合成和软骨的纤维化过程，其缺失可导致与年龄相关的骨性关节炎发生，而当miRNA-140高表达时可防止骨性关节炎样软骨的退变，表明miRNA-140在骨性关节炎发病中可能是一种保护因子，而间充质干细胞外泌体中携带的高含量miRNA-140可能为骨性关节炎潜在的治疗方式，值得深入研究。

miR-675也被证实能够调节软骨基质中Ⅱ型胶原A1(collagen-Ⅱ A1，Col2A1) 的表达，miR-675过表达能够在一定程度上缓解由于H19基因与Sox9基因缺失造成的Col2A1缺乏，可能是关节软骨恢复及间充质干细胞治疗骨性关节炎的关键靶点^[29]。miR-148a高表达则可以降低Ⅹ型胶原A1(collagen-X，Col10A1)、MMP-13和ADAMTS-5的表达，促进Col2A1分泌，刺激软骨细胞增殖，缓解骨性关节炎发展^[30]。mir-27a/b、miR-125b和miR-127-5p在骨性关节炎患者的软骨中低表达，间充质干细胞治疗后可上调其表达量，通过抑制白细胞介素1β信号转导途径，沉默MMP-13和ADAMTS-4的mRNA转录过程，而降低MMP-13和ADAMTS-4的表达，在骨与软骨代谢分解中发挥重要调节作用^[31-33]。miR-558则可直接抑制COX-2 mRNA的翻译，反之利用白细胞介素β体外诱导刺激后，能够激活软骨细胞的MAPK和NF-κB转导途径，抑制miR-558表达，促进COX-2合成^[34]。其他下调的miRNAs，如miR-29a、miR-149、miR-576-5p、miR-634、miR-641和miR-1227等仅在正常软骨细胞的生长和发育中表达，可能是通过沉默TGF、Wnt和Erb等细胞信号通路上某些蛋白的表达来发挥作用^[35]。

骨性关节炎早中期，表达上调的miR-146a/b对NF-κB和TNF-β/Smad途径的影响占据了重要地位，并受细胞炎性因子白细胞介素1β等的调控，miR-146a/b的高表达通过沉默Smad4 mRNA，来破坏TNF-β通路上的糖胺聚糖等软骨生成蛋白的表达，并间接上调VEGF表达，可能是机体对抗受累关节腔内急性炎症反应的应答表现，发展到晚期miR-146a/b低表达，可能是过多的炎性因子浸润的反向抑制作用^[36]。间充质干细胞分泌的外泌体可通过对炎性因子的抑制作用来下调miR-146a/b，从而到达治疗骨性关节炎的效果。

miR-21亦在骨性关节炎患者的关节软骨中表达上调，不但可以直接靶向沉默GDF-5/CDMP-1 mRNA翻译，还可抑制通路上软骨细胞成熟所需合成蛋白的表达，并间接刺激MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-9蛋白高表达^[37]。功能学实验发现，miR-22与骨性关节炎软组织肥大和炎症反应相关；miR-9可以显著上调MMP-13蛋白表达；miR-9、miR-98和miR-146则通过下调TNF-α/β途径来参与骨性关节炎进程^[38]。这些miRNAs不但均能在间充质干细胞分泌的外泌体中找到，而且这些miRNAs的作用可能很好地介导间充质干细胞抑制骨性关节炎的炎症反应，促进软骨损伤修复。

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引言

大多数骨性关节炎是与年龄和劳损相关的一类慢性疾病，随着老龄化社会的到来，骨性关节炎发病率呈增长趋势，在中老年人群中的发病率可高达40%-80%，轻者影响生活质量，重者致残，致残率最终可大于50%^[1]。骨性关节炎Ⅲ期软骨损伤及Ⅳ期全层软骨损伤患者在老年人群中的发病率分别为40%和19%，显然，骨性关节炎已成为人类必需面对的严峻健康问题。

间充质干细胞广泛存在于人体组织中，具有自我更新和多向分化潜能，可通过定向分化、调节免疫、抗炎、促血管生成、改善微环境和促再生等发挥治疗作用。较早的研究认为间充质干细胞主要通过定植于损伤部位发挥再生作用，然而近年的研究证实，间充质干细胞的归巢受诸多因素影响，在损伤组织中分化为功能细胞的效率很低，甚至移植的间充质干细胞与所作用的损伤组织并无直接位置相关性^[2]。因此，愈来愈多的学者认为间充质干细胞可能通过释放某些生物活性物质，介导再生相关的信号转导，激活或沉默相关基因表达，调节损伤细胞的修复，从而促进组织再生。间充质干细胞所分泌的外泌体及外泌体所介导的细胞间、细胞与组织间相互作用，为进一步阐释间充质干细胞的非功能细胞分化作用及其参与损伤组织再生修复的机制提供新方向^[3]。

外泌体是由细胞分泌的直径为40-100 nm的亚细胞双层膜性囊泡，以“内吞-融合-外排”的方式释放至细胞外基质中。外泌体内包含了多种mRNA、miRNA、DNA和蛋白质等活性物质，几乎存在于所有体液中，能够介导细胞间多种信号转导以及调节微环境变化，既是潜在的治疗靶点^[3]，还可能被直接应用。在生理与病理性细胞外微环境中，外泌体不仅可以保护这些生物活性物质不被降解和稀释，还可以协调这些物质在组织液或血液中的远距离运输，抵达作用部位或调控循环中多种血细胞的功能。越来越多的研究表明，外泌体是干细胞发挥治疗作用的主要分子机制之一，它可广泛参与细胞间信号转导，特异性作用于靶细胞，调节微环境和炎症免疫，促进损伤组织再生。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

外泌体在间充质干细胞治疗骨性关节炎中的作用：新策略与新思路

Exosomes: a new strategy for mesenchymal stem cell transplantation in the treatment of osteoarthritis

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