负压条件下骨髓间充质干细胞向表皮细胞的诱导分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0418

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (1): 101-106.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0418

• 骨髓干细胞 bone marrow stem cells • 上一篇下一篇

负压条件下骨髓间充质干细胞向表皮细胞的诱导分化

赵伯文，徐强，葛权虎，李伯龙，彭心宇，张宏伟，吴向未

石河子大学医学院第一附属医院，新疆维吾尔自治区石河子市 832008

修回日期:2017-08-13 出版日期:2018-01-08 发布日期:2018-01-08
通讯作者: 彭心宇，主任医师，博士研究生导师，石河子大学医学院第一附属医院，新疆维吾尔自治区石河子市 832008；并列通讯作者：张宏伟，主治医师，石河子大学医学院第一附属医院，新疆维吾尔自治区石河子市 832008
作者简介:赵伯文，男，1991年生，新疆维吾尔自治区石河子市人，汉族，2017年石河子大学毕业，硕士，主要从事肝脏外科疾病的基础与临床研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(31271458)；兵团应用基础研究计划(2016AG019)

Negative pressure promotes epidermal differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells

Zhao Bo-wen, Xu Qiang, Ge Quan-hu, Li Bo-long, Peng Xin-yu, Zhang Hong-wei, Wu Xiang-wei

The First Affiliated Hospital, College of Medicine, Shihezi University, Shihezi 832008, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Revised:2017-08-13 Online:2018-01-08 Published:2018-01-08
Contact: Peng Xin-yu, Chief physician, Doctoral supervisor, the First Affiliated Hospital, College of Medicine, Shihezi University, Shihezi 832008, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; Zhang Hong-wei, Attending physician, the First Affiliated Hospital, College of Medicine, Shihezi University, Shihezi 832008, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Zhao Bo-wen, Master, the First Affiliated Hospital, College of Medicine, Shihezi University, Shihezi 832008, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 31271458; Applied Basic Research Project of Xinjiang Production and Construction Corps, No. 2016AG019

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
负压影响细胞增殖分化：机械力、细胞骨架和整合素三者相互作用影响细胞的增殖分化，而负压作为一种物理因素可通过机械力作用导致细胞膜及细胞骨架的变形传导至细胞内，并由细胞内信号传导传入细胞核，促使合成细胞所需的因子，影响细胞的增殖分化。
角蛋白(cytokeratin，CK)：是一种中间丝蛋白，在细胞内形成广泛的网状结构，是表皮细胞的结构蛋白，目前公认细胞角蛋白相关抗原是表皮细胞的特异性标志，存在于表皮细胞的胞浆内，正常情况下，间充质干细胞不表达这种抗原。处于不同分化阶段的细胞，细胞表达不同的角蛋白，因而也可作为干细胞、定向祖细胞、分化细胞的鉴定手段，定向祖细胞及表皮细胞表达角蛋白5、角蛋白10，故实验检测角蛋白5、角蛋白10的表达评估骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化的能力。

摘要
背景：负压作为一种物理因素影响间充质干细胞的分化，其可以促进间充质干细胞向成骨细胞、内皮细胞分化。如果能发现负压对于间充质干细胞向表皮细胞分化的作用，对未来临床上负压联合干细胞修复创伤具有重要意义。
目的：探讨负压作用条件对兔骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化的影响。
方法：分离培养新西兰大白兔骨髓间充质干细胞，取第3代骨髓间充质干细胞在负压下(-16.625 kPa，2次/d，4 h/次)进行成表皮诱导分化，设置0 kPa组为对照组，绘制细胞生长曲线，实时荧光定量PCR检测负压条件下诱导2周后CK-5、CK-10 mRNA的表达。
结果与结论：与0 kPa组比较，16.625 kPa组细胞生长受抑制，细胞CK-5、CK-10 mRNA表达水平增高，差异均有显著性意义(P < 0.05)。说明负压能抑制细胞增殖，促进兔骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-2535-7618(赵伯文)

关键词: 干细胞, 骨髓间充质干细胞, 负压创面技术, 细胞分化, 细胞增殖, 表皮分化, 负压诱导, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: As a physical factor, negative pressure can promote the osteogenic differentiation and endothelial differentiation of mesenchymal stem cells. If a negative pressure exerts effects on the epidermal differentiation of mesenchymal stem cells, it will be highly important for the combination use of negative pressure and mesenchymal stem cells in wound healing.
OBJECTIVE: To explore the effect of negative pressure on the epidermal differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells of New Zealand white rabbits were isolated and cultured. Then, the passage 3 cells were induced for epidermal differentiation under negative pressure (-16.625 kPA, twice a day, once for 4 hours) as experimental group. Another cells induced under no negative pressure were used as control group. After induction, cell growth curve was drawn in each group, and the expression of cytokeratin 5 and cytokeratin 10 mRNA was examined by real-time PCR at 2 weeks after induction.
RESULTS AND CONCLUSION: The cell growth of the experimental group was inhibited, and the mRNA expression of cytokeratin 5 and cytokeratin 10 was significantly increased compared with the control group (P < 0.05). These findings indicate that under the condition of negative pressures, the epidermal differentiation ability of bone marrow mesenchymal stem cells is increased, and in contrary, the cell proliferation is inhibited.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Pressure, Epidermis, Cell Differentiation, Tissue Engineering

中图分类号:

R349.2

赵伯文，徐强，葛权虎，李伯龙，彭心宇，张宏伟，吴向未. 负压条件下骨髓间充质干细胞向表皮细胞的诱导分化[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(1): 101-106.

Zhao Bo-wen, Xu Qiang, Ge Quan-hu, Li Bo-long, Peng Xin-yu, Zhang Hong-wei, Wu Xiang-wei. Negative pressure promotes epidermal differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(1): 101-106.

图/表（结果） 2

2.1 倒置显微镜观察骨髓间充质干细胞的形态 刚接种时细胞多为圆形或椭圆形，五六个小时后细胞贴壁呈椭圆形，可见大量圆形淋巴细胞和血细胞未贴壁；48 h后初期贴壁椭圆形细胞开始变形呈棒状或梭形，4-6 d后细胞快速增殖，形成分散的细胞集落；8-10 d后细胞融合至80%-90%，细胞为梭形，呈鱼群样生长(图1A)。第2代骨髓间充质干细胞传代，接种4 h可见细胞贴壁呈现短梭形；24 h后细胞全部贴壁，可见部分细胞变为长梭形，部分细胞变为不规则形，杂细胞较少，细胞壁不光滑可能因传代时胰酶消化以及吹打造成细胞损伤；72 h后可见细胞形态较为均一，均为长梭形，细胞壁光滑，细胞数量较前明显增多(图1B)。

2.2 流式细胞仪鉴定兔骨髓间充质干细胞 流式细胞仪检测结果显示，99.4%的细胞表达CD44，98.9%的细胞表达CD29，0%的细胞表达CD34。细胞高表达骨髓间充质干细胞表面抗原CD44、CD29，低表达或不表达骨髓成纤维细胞、造血干细胞表面抗原CD34，见图2-4。

2.3 负压下成表皮诱导的骨髓间充质干细胞生长曲线 在负压下诱导第4天时，0 kPa组细胞数为(14.17±0.76)×10⁴个，-16.625 kPa组细胞数为(12.08±0.65) ×10⁴个，两组相比差异有显著性意义(P < 0.05)；在负压下诱导第5-7天，0 kPa组与-16.625 kPa组之间差异有显著性意义(P < 0.05)，负压下细胞增殖受抑制(图5)。

2.4 免疫荧光检测表皮样细胞Pan-Keratin的表达 由图6A可见未经过诱导的骨髓间充质干细胞不表达或者稍表达Pan-Keratin；由图6B可见经过成表皮诱导两三周后表皮样细胞表达Pan-Keratin，说明骨髓间充质干细胞可向表皮细胞诱导分化。

2.5 荧光定量PCR检测CK-5、CK-10 mRNA的表达 经过负压成表皮诱导14 d后，CK-5、CK-10 mRNA表达量较0 kPa组均有明显增高，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图7。

参考文献

[1] Fleischmann W, Strecker W, Bombelli M, et al. Vacuum sealing as treatment of soft tissue damage in open fractures. Unfallchirurg. 1993;96(9):488-492.

[2] 裘华德,王彦峰,李汉民.负压封闭引流技术[M].北京:人民卫生出版社,2003.

[3] 张承德,王进勇,邹晓辉,等.封闭负压引流技术对毁损创面恢复血管生成及创周组织血管通透性的影响[J].医学临床研究, 2013, 30(10):2012-2013.

[4] Saxena V, Hwang CW, Huang S, et al. Vacuum-assisted closure: microdeformations of wounds and cell proliferation. Plast Reconstr Surg. 2004;114(5):1086-1096

[5] Kaplan M, Banwell P, Orgill DP, et al. Guidelines for the management of the open abdomen.Wounds: A Compendium of Clinical Research and Practice.2005;17(S1):1-24.

[6] Kopp J, Kneser U, Bach AD, et al. Buried chip skin grafting in neuropathic diabetic foot ulcers following vacuum-assisted wound bed preparation: enhancing a classic surgical tool with novel technologies. Int J Low Extrem Wounds. 2004;3(3): 168-171.

[7] Hu KX, Zhang HW, Zhou F, et al. Observation on the therapeutic effects of negative-pressure wound therapy on the treatment of complicated and refractory wounds. Zhonghua Shao Shang Za Zhi. 2009;25(4):249-252.

[8] 黄晓栋.封闭负压引流术治疗难愈性烧伤创面疗效观察[J].中国基层医药,2013,20(19):2992-2993.

[9] Bosnakovski D, Mizuno M, Kim G, et al. Isolation and multilineage differentiation of bovine bone marrow mesenchymal stem cells. Cell Tissue Res. 2005;319(2):243-253.

[10] Greenspoon N, Hershkoviz R, Alon R, et al. Structural analysis of integrin recognition and the inhibition of integrin-mediated cell functions by novel nonpeptidic surrogates of the Arg-Gly-Asp sequence. Biochemistry. 1993;32(4):1001-1008.

[11] Chothia C, Jones EY. The molecular structure of cell adhesion molecules. Annu Rev Biochem. 1997;66:823-862.

[12] Hocking DC, Kowalski K. A cryptic fragment from fibronectin's III1 module localizes to lipid rafts and stimulates cell growth and contractility. J Cell Biol. 2002;158(1):175-184.

[13] Kittredge R. Paraphrasing for condensation in journal abstracting. J Biomed Inform. 2002;35(4):265-277.

[14] Yang Z, Yao JF, Xu P, et al. Functions and mechanisms of intermittent negative pressure for osteogenesis in human bone marrow mesenchymal stem cells. Mol Med Rep. 2014;9(4):1331-1336.

[15] 陶圣祥,余国荣,喻爱喜,等.负压培养对大鼠骨髓基质干细胞增殖及分化的影响[J].医学新知,2007,17(6):324-326.

[16] 杨治,朱养均,程延,等.体外负压培养对骨髓间充质干细胞成骨活性的影响[J].中国骨伤,2011,24(12):1024-1027.

[17] Zhang YG, Yang Z, Zhang H, et al. Effect of negative pressure on human bone marrow mesenchymal stem cells in vitro. Connect Tissue Res. 2010;51(1):14-21.

[18] 李宁,吴桂英,李启明,等.不同氧浓度微环境对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响实验研究[J].重庆医学,2009,8(4):891-893.

[19] Zhu J, Yu A, Qi B, et al. Effects of negative pressure wound therapy on mesenchymal stem cells proliferation and osteogenic differentiation in a fibrin matrix. PLoS One. 2014;9(9):e107339.

[20] Grayson WL, Zhao F, Izadpanah R, et al. Effects of hypoxia on human mesenchymal stem cell expansion and plasticity in 3D constructs. J Cell Physiol. 2006;207(2):331-339.

[21] 齐国先,孔宏亮,霍鑫,等.缺氧环境下大鼠骨髓间充质干细胞凋亡相关蛋白和mRNA的表达[J].中国组织化学与细胞化学杂志, 2008,17(2):140-143.

[22] Greijer AE, van der Wall E. The role of hypoxia inducible factor 1 (HIF-1) in hypoxia induced apoptosis. J Clin Pathol. 2004;57(10):1009-1014.

[23] Watt FM, Hogan BL. Out of Eden: stem cells and their niches. Science. 2000;287(5457):1427-1430.

[24] Fuchs E, Tumbar T, Guasch G. Socializing with the neighbors: stem cells and their niche. Cell. 2004;116(6):769-778.

[25] Nakagawa H, Akita S, Fukui M, et al. Human mesenchymal stem cells successfully improve skin-substitute wound healing. Br J Dermatol. 2005;153(1):29-36.

[26] Han CM, Wang SY, Lai PP, et al. Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells differentiate into epidermal-like cells in vitro. Differentiation. 2007;75(4):292-298.

[27] Li H, Xu Y, Fu Q, et al. Effects of multiple agents on epithelial differentiation of rabbit adipose-derived stem cells in 3D culture. Tissue Eng Part A. 2012;18(17-18):1760-1770.

[28] De R, Zemel A, Safran SA.Theoretical concepts and models of cellular mechanosensing. Methods Cell Biol. 2010;98:143-175.

[29] Gong T, Zhao K, Yang G, et al. The control of mesenchymal stem cell differentiation using dynamically tunable surface microgrooves. Adv Healthc Mater. 2014;3(10):1608-1619.

[30] 雷晓华,邓智利,宁立娜,等.机械力及力学信号转导影响肝细胞命运的研究进展[J].中国科学:生命科学,2014,44(7):639-648.

[31] Han SJ, Sniadecki NJ. Simulations of the contractile cycle in cell migration using a bio-chemical-mechanical model. Comput Methods Biomech Biomed Engin. 2011;14(5):459-468.

[32] Ding H, Chen S, Yin JH, et al. Continuous hypoxia regulates the osteogenic potential of mesenchymal stem cells in a time-dependent manner. Mol Med Rep. 2014;10(4):2184-2190.

[33] Zscharnack M, Poesel C, Galle J, et al. Low oxygen expansion improves subsequent chondrogenesis of ovine bone-marrow-derived mesenchymal stem cells in collagen type I hydrogel. Cells Tissues Organs. 2009;190(2):81-93.

[34] Ren H, Cao Y, Zhao Q, et al. Proliferation and differentiation of bone marrow stromal cells under hypoxic conditions. Biochem Biophys Res Commun. 2006;347(1):12-21.

引言

材料方法

1.1 设计 细胞学实验。

1.2 时间及地点 于2016年6至12月在石河子大学医学动物实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 新西兰大白兔20只，雌雄不限，4-6月龄，体质量1.5-2.0 kg，由石河子大学实验动物中心提供，实验经石河子大学附属医院伦理委员会讨论批准。

1.3.2 主要试剂和仪器 L-DMEM培养基、胎牛血清、双抗、胰酶(美国Hyclone公司)；Ficoll淋巴细胞分离液、2%明胶(Solarbio公司，北京)；CD34-FITC、CD44-PE、CD29-APC(eBiosicence公司，美国)；12孔板细胞爬片(Solarbio公司，北京)；鼠抗Pan-Keratin抗体(Cell Signaling公司，美国)；DAPI(Simga公司，美国)；Trizol(Invitrogen公司，美国)；First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo公司，美国)；SYBR Green PCR Kit(Qiagen公司，德国)；CK-5、CK-10、β-actin引物(上海生工生物工程股份有限公司合成)；CO₂培养箱(Thermo公司，美国)；荧光倒置显微镜(Leica公司，德国)；实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad CFX96 Manager^® Thermo公司，美国)。

1.4 方法

1.4.1 原代兔骨髓间充质干细胞提取 新西兰大白兔以3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)经耳缘静脉麻醉，无菌条件下，暴露一侧股骨，用一只固定有16号针头内含1 mL肝素(3 000 U/mL)的5 mL注射器从股骨中抽取2-4 mL骨髓液，用无血清DMEM培养基悬浮，将细胞悬液缓慢加在1.077 g/cm³的Ficoll分离液上部(细胞悬液与分离液之比为2∶1)，离心(20 min，2 000 r/min)，然后小心吸取位于分离液中间的乳白色细胞层，移入另一离心管中，用无血清DMEM培养基重悬洗涤2次，末次离心后用3 mL含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM接种于60 mm培养皿内，放入37 ℃，体积分数为5%CO₂恒温箱培养，每48 h换液1次，待细胞融合至80%-90%进行传代培养。

1.4.2 兔骨髓间充质干细胞的传代培养 原代培养七八天后，倒置显微镜观察细胞生长状况，达到80%-90%融合时，胰蛋白酶消化，倒置显微镜下观察到细胞收缩，细胞间隙增大时终止消化，轻轻吹打细胞至细胞脱落，将细胞悬液移至另一无菌离心管内，离心(5 min，800 r/min)，弃上清，加入含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM重悬细胞，按1∶2或1∶3接种于60 mm培养皿内，放入37 ℃，体积分数为5%CO₂恒温箱培养，每48 h换液1次，待细胞融合至80%-90%再次传代培养。

1.4.3 兔骨髓间充质干细胞的鉴定 通过倒置显微镜观察细胞形态及流式细胞仪检测细胞表面特异性抗原来鉴定骨髓间充质干细胞。流式细胞仪鉴定细胞方法：取第3代骨髓间充质干细胞，胰蛋白酶消化后，PBS洗涤2遍，再用PBS调整细胞浓度为1×10⁸ L^-¹-1×10⁹ L^-¹，向其中加入CD34-FITC、CD44-PE、CD29-APC，4 ℃避光孵育20 min，PBS洗涤2遍后上机检测。

1.4.4 负压条件下成表皮诱导 第3代兔骨髓间充质干细胞消化后，按照2×10⁴/cm²的细胞密度接种于事先包被0.1%明胶的6孔板中，每孔加入含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养液，放入细胞恒温箱中培养，当细胞融合度达到40%-50%时，吸走完全培养基加入含体积分数为10%胎牛血清，30 μg/L表皮细胞生长因子、10 μg/L角质细胞生长因子、10 μg/L肝样细胞生长因子、2.5 mmol/L维甲酸的诱导培养基，并将细胞放入无菌自制的负压细胞培养盒，将培养盒与微型负压仪用导管相连，调节负压仪，设置压力为-16.625 kPa，2次/d，4 h/次，以后每48 h用成表皮诱导培养基换液。

1.4.5 细胞生长曲线的绘制 第3代兔骨髓间充质干细胞消化后，按照4×10⁴/cm²的细胞密度接种于12孔板中，在上述设置的压力条件下进行成表皮诱导，分别于1-7 d每天消化3孔，采用细胞计数板计数法计算细胞密度，绘制细胞生长曲线。

1.4.6 免疫荧光检测表皮样细胞Pan-Keratin的表达 取诱导2至3周且发生形态学改变的细胞，消化后接种于12孔板内的细胞爬片上，每孔加入200-500 μL的0.2% TritonX-100通透10 min，PBS漂洗三四次，每孔加入200-500 μL山羊血清封闭30 min，PBS漂洗三四次，滴加一抗[将小鼠抗Pan-Keratin抗体按抗体说明书1∶400标准稀释后，每孔加入一抗稀释液250 μL(能将细胞爬片覆盖即可)]，将培养板放入4 ℃孵育过夜，取出培养板，吸出一抗稀释液，PBS漂洗三四次，滴加二抗[将FITC标记的山羊抗小鼠抗体按抗体说明书1∶100标准稀释后，每孔加入二抗稀释液250 μL(能将细胞爬片覆盖即可)]，避光室温孵育2 h，吸出二抗稀释液，PBS漂洗三四次，DAPI染核[将DAPI按3∶1 000比例加入适量PBS中混匀，每孔加入250 μL DAPI工作液]，将细胞培养板置于37 ℃、体积分数为5%CO₂恒温箱内孵育30 min，吸出DAPI工作液，PBS漂洗三四次，取干净载玻片，在中央滴加95%的甘油封固，注意避光，荧光倒置显微镜下观察细胞Pan-Keratin的表达。

1.4.7 RT-PCR检测CK-5，CK-10 mRNA的表达 负压条件下诱导表皮分化14 d后，Trizol提取细胞总RNA，采用Nanodrop 2000(Thermo Fisher公司，美国)测量吸光度A₂₆₀/A₂₈₀，检测RNA样本浓度和纯度，取200 ng总RNA反转录合成cDNA，加入PCR仪中扩增(95 ℃预变性2 min，95 ℃变性5 s，55 ℃退火30 s，60 ℃延伸10 s，共40个循环)。结果采用实时荧光定量PCR分析程序分析Ct值，计算目的基因相对值=2^-^??Ct。

1.5 主要观察指标 ①兔骨髓间充质干细胞的形态；②兔骨髓间充质干细胞表面标志物的表达；③兔骨髓间充质干细胞成表皮诱导后免疫荧光染色观察Pan-Keratin的表达；④负压下兔骨髓间充质干细胞成表皮诱导后的细胞增殖能力；⑤负压下兔骨髓间充质干细胞成表皮诱导后CK-5，CK-10 mRNA的表达。

1.6 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件进行分析。数据以x(_)±s表示，两组数据间的比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

间充质干细胞作为一种成体干细胞，来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞，主要来源于骨髓，具有多向增殖分化潜能、自我更新、免疫调控和自我复制等特点，是一种良好的组织工程学种子细胞，在特定的诱导条件及环境下可向特定细胞分化如脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞、肝细胞、血管内皮细胞、神经样细胞、表皮细胞以及尿路上皮细胞。影响间充质干细胞分化的因素主要有生理因素、化学因素以及物理因素，负压作为一种物理因素可促进骨髓间充质干细胞的分化。有学者研究显示负压可促进骨髓间充质干细胞向骨细胞、内皮细胞以及成纤维细胞分化^[14-15]。因此，基于前人的研究^[14-17]，本实验观察负压对于骨髓间充质干细胞成表皮分化能力的影响，为今后临床负压联合干细胞修复创面提供一定的实验理论依据。

实验在两个不同的负压条件下(0 kPa和-16.625 kPa，2次/d，4 h/次)进行骨髓间充质干细胞向表皮细胞诱导分化培养。结果显示，随着负压增高，骨髓间充质干细胞的表皮诱导分化能力及细胞增殖的抑制作用均增强。Zhang等^[17]实验结果显示在负压(-50 kPa，30 min/次，2次/d)条件下间充质干细胞的增殖受抑制；李宁等^[18]研究也认为低压氧环境抑制干细胞的增殖，与本实验结果一致。Zhu等^[19]研究发现在负压(-16.625 kPa，诱导72 h)条件下可促进干细胞增殖，陶圣祥等^[15]研究发现压力为-39.9 kPa时干细胞的增殖能力不受影响，而压力为-79.8 kPa时干细胞的增殖能力受抑制，与本实验结果相异，这可能与负压条件所造成的细胞培养环境相对低氧有关。低氧同样也是一种物理因素影响干细胞的迁移趋化、增殖、凋亡以及分化，骨髓间充质干细胞主要聚集部位在骨髓，骨髓中的氧体积分数为1%-7%，骨髓间充质干细胞生理状态通常应该处于低氧环境中，而过高的氧体积分数会对细胞产生应激性损伤，Grayson等^[20]将人骨髓间充质干细胞置于2%的氧体积分数下培养1个月，与细胞置于20%的氧体积分数下培养相比，低氧促进细胞的增殖能力更强。然而齐国先等^[21]研究发现将间充质干细胞置于1%的低氧环境下培养时，间充质干细胞的凋亡更加明显，且缺氧后比缺氧前的凋亡率更高，Caspase-3凋亡因子的表达率也增高。Greijer等^[22]实验表明细胞凋亡或者适应缺氧而存活取决于缺氧的严重程度，体积分数为0.5%O₂可以启动细胞的凋亡，从而阻止低氧诱导突变的积累，在此过程中存在着复杂诱导凋亡和抗凋亡间的平衡。以上研究的结果都进一步说明了缺氧严重程度影响细胞的凋亡与增殖。本实验研究结果与其他研究结果相异之处，可能由于负压强度、负压诱导时间以及负压吸入模式不同所造成的，本研究所采用的稍低负压强度(-16.625 kPa)，长时间的间歇性负压吸入模式及较长的负压诱导时间(2次/d，4 h/次，持续对细胞施加负压7 d)，造成局部的细胞培养环境氧浓度过低，细胞凋亡增加导致-16.625 kPa组的细胞增殖低于0 kPa组，该推测有待后续进一步的实验与研究发现。

实验采用多种细胞因子(表皮细胞生长因子、角质细胞生长因子、肝样细胞生长因子、维甲酸)体外诱导骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化，倒置显微镜下可见细胞变大，形态为不规则形和(或)多边形，荧光倒置显微镜下可见细胞部分表达Pan-Keratin，说明体外诱导骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化存在一定的局限性。多数学者认为干细胞的分化方向可能与干细胞所处微环境的niche有关^[23-24]，其为干细胞提供一个保护性的微环境，包括细胞因子、生长因子以及niche内各种细胞、细胞外基质等，均直接或者间接调控干细胞的生长与分化方向。Nakagawa等^[25]研究结果显示将间充质干细胞种植于裸鼠皮肤创伤处，与对照组相比其创面修复加速，创面上有更多的上皮细胞形成，创面明显缩小；Han等^[26]研究认为间充质干细胞在特定的培养条件下进行培养，可向表皮样细胞分化；Li等^[27]将干细胞培养在类似于上皮培养特定微环境的3D培养系统内，发现干细胞向上皮细胞分化的能力增强，以上研究都进一步说明了体内特定微环境对干细胞定向分化起着促进作用。

角蛋白是一种中间丝蛋白，在细胞内形成广泛的网状结构，是表皮细胞的结构蛋白，目前公认细胞角蛋白相关抗原是表皮细胞的特异性标志，存在于表皮细胞的胞浆内，正常情况下，间充质干细胞不表达这种抗原。处于不同分化阶段的细胞，细胞表达不同的角蛋白，因而也可作为干细胞、定向祖细胞、分化细胞的鉴定手段，定向祖细胞及表皮细胞表达CK1、CK5、CK8、CK10，因此实验采用CK5、CK10检测骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化的能力。实验结果显示骨髓间充质干细胞向表皮分化的活性随着压力增高而逐渐增强，作者认为其原因主要是：①负压条件下压力作用于液面从而对细胞产生机械刺激；②负压产生相对缺氧的环境。有学者认为机械力、细胞骨架和整合素三者相互作用可改变细胞形态，影响细胞的增殖分化^[28-31]。而低氧条件下也可促进间充质干细胞的分化，目前低氧对间充质干细胞分化多集中在成骨分化、成软骨分化以及成脂肪分化^[32-34]。因而在负压条件下对骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化起主要作用的因素有待进一步的深入研究。

综上所述，随着负压增高，骨髓间充质干细胞的增殖能力受抑制，骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化能力逐渐增强，作者推测当负压强度、时间在合适的范围内时，骨髓间充质干细胞的增殖能力及向表皮细胞分化增强，而这个范围将有待于进一步的研究发现，而骨髓间充质干细胞向表皮细胞诱导分化的最佳条件也还有待于进一步探索；其次将细胞种植于具有良好组织相容性的生物支架材料并联合负压技术可为组织工程学修复组织缺损提供一种新的研究思路；最后为未来临床上负压联合干细胞加速创面愈合提供一定的理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

负压条件下骨髓间充质干细胞向表皮细胞的诱导分化

Negative pressure promotes epidermal differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 2

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[2]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[3]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[4]	刘聪, 刘肃. miR-17-5p调控低氧诱导因子1α介导脂肪细胞分化及血管生成的分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1069-1074.
[5]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[6]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[7]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[8]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[9]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[10]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[11]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[12]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[13]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[14]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[15]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.