人尿源性干细胞的分离培养及生物学特性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0417

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
尿源性干细胞：是一种从尿液中分离获取，具有间充质干细胞的活性，有极强的自我更新、无限增殖能力和多向分化潜能，能够为输尿管或尿道组织工程与重建、膀胱修复及阴茎海绵体修复等泌尿系组织构建方面提供理想的种子细胞。
表皮生长因子：尿源性干细胞培养液是由角质细胞无血清培养液和祖细胞培养液以1∶1比例混合而成，隔日换液，发现细胞生长缓慢，而表皮生长因子能有效地促进和调节细胞的生长与增殖，与细胞膜上特异性受体相结合，从而激活蛋白酶，加快蛋白质的合成，促进细胞的生长，在体内体外都对细胞有强烈的促分裂作用。在培养基里面加入表皮生长因子，发现细胞生长迅速且生长状态好。

摘要
背景：尿源性干细胞作为干细胞家族新兴的群体，在组织工程构建方面越来越引起人们的重视。
目的：研究尿源性干细胞的培养方法，对尿源性干细胞进行生物学鉴定。
方法：取健康成人清洁尿液，将其离心、分离、培养、传代获取尿源性干细胞，用MTT法检测细胞的生长曲线，流式细胞仪检测细胞表面标志物，并对细胞进行成骨、成脂诱导能力鉴定。
结果与结论：①从尿液中分离获取得到生长迅速并大量增殖的尿源性干细胞，对该细胞进行培养传代，细胞生长曲线成“S”型；②尿源性干细胞表达间充质干细胞表面标志物CD29、CD44、CD73、CD90，保持了干细胞的活性；③尿源性干细胞有向成骨、成脂细胞分化的生物学特性；④结果表明，尿源性干细胞有很强的增殖分化能力，作为一种经济便利无创的细胞来源，为以后研究尿道缺损、器官再造等提供巨大的便利。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-1326-7914(赵长辉)

关键词: 尿源性干细胞, 细胞培养, 生长曲线, 细胞分化, 尿道缺损, 干细胞, 培养

Abstract:

BACKGROUND: As an emerging stem cell family, urine-derived stem cells have attracted more and more attentions in the tissue engineering construction.
OBJECTIVE: To study the culture method of urine-derived stem cells, and to identify the biological characteristics of urine-derived stem cells.
METHODS: Cleaning urine samples were harvested and centrifuged, and urine-derived stem cells were isolated from the urine samples and extensively expanded in vitro. Cell growth curve was measured by MTT method, and cell surface markers were detected by flow cytometry. Meanwhile, the cells were subjected to osteogenic and adipogenic induction.
RESULTS AND CONCLUSION: Urine-derived stem cells were successfully isolated from the urine samples, which grew and proliferated rapidly. After subculture, the cells exhibited an S-shaped growth. The isolated urine-derived stem cells expressed CD29, CD44, CD73 and CD90, indicating that the cells maintained the activity
of stem cells. Moreover, the isolated cells had the ability of osteogenic and adipogenic differentiation. To conclude, urine-derived stem cells have strong proliferation and differentiation potentials, as a kind of economic, convenient, non-invasive source of cells, which can provide great convenience for urethral defect repair and organ reconstruction.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Urine, Stem Cells, Cell Differentiation, Cell Proliferation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

赵长辉，哈木拉提•吐送，木拉提•热夏提，王峰，马军，安尼瓦尔•牙生. 人尿源性干细胞的分离培养及生物学特性[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(1): 95-100.

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图/表（结果） 1

2.1 尿源性干细胞生长形态 尿液样本在接种第7天左右开始出现成簇状的细胞团，呈贴壁生长状态，细胞形态为短梭形或圆形。第11天左右培养瓶大部分长满细胞，未见其他微生物生长，显微镜下观察到细胞各种分裂相，细胞逐渐变为长梭形。约14 d后，细胞长满培养瓶，细胞形态为长梭形，然后进行传代培养。见图1。

2.2 MTT法检测生长曲线 见图2。第4代尿源性干细胞的生长曲线大致呈“S”型，分为潜伏期、指数生长期、平顶期、衰亡期。从图中可以看出，传代后培养第1-3天，细胞生长较缓慢，处于潜伏期，此期是细胞贴壁生长阶段，细胞分裂及增殖不明显；培养至第4-6天，细胞大量分裂，迅速增殖，进入指数生长期；至第6-8天时，细胞生长较第4-6天缓慢，此时细胞进入平顶期，第9，10天时，细胞退化衰亡，细胞数量呈轻度下降进入衰亡期。

2.3 尿源性干细胞表面标志物 流式细胞技术测定第4代人尿源性干细胞表面标志物，结果发现CD29、CD44、CD73、CD90表达强阳性，说明尿源性干细胞表达间充质干细胞表面标志物，保持了干细胞的活性。见图3。

2.4 人尿源性干细胞诱导分化结果

2.4.1 成脂诱导结果 成脂诱导14 d，细胞内有脂滴出现，呈颗粒状或串珠状。油红O染色呈鲜红色，由此可知尿源性干细胞有向脂肪细胞分化的能力。见图4。

2.4.2 成骨诱导结果 成骨诱导21 d ，细胞形态由梭形逐渐变为多角形或扁条形，细胞密集，呈现重叠性、多层性排列，有少量矿盐沉积的钙化结节，茜素红染色后钙化结节呈红色，说明尿源性干细胞有向成骨细胞分化的能力。见图5。

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学观察实验。

1.2 时间及地点 于2016年1至11月在新疆医科大学第一附属医院实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验试剂 H-DMEM培养基、胎牛血清、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、青-链霉素均为Gibco公司产品；牛血清白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、地塞米松、β-甘油磷酸、抗坏血酸、吲哚美辛、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、茜素红染色剂、油红O染色剂、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、多聚甲醛干粉均为Sigma公司产品。

1.3.2 人尿源性干细胞培养基配制 由角质细胞无血清培养液和祖细胞培养液以1︰1比例混合而成^[6]。其中，角质细胞无血清培养液：KSFM中添加5 μg/L表皮生长因子，50 μg/L碱性成纤维细胞生长因子，1%青链霉素，1% L-谷氨酰胺。祖细胞培养液：75%的DMEM，25%的F-12培养液，体积分数为10%胎牛血清，0.4 mg/L氢化可的松，10 μg/L胰岛素，5 μg/L转铁蛋白，2×10^-⁹ mol/L三碘甲腺原氨酸，10 μg/L表皮生长因子，1.8×10^-⁴ mol/L腺嘌呤，1%青链霉素，1% L-谷氨酰胺。

1.4 实验方法

1.4.1 尿源性干细胞分离培养 所有对象均签署知情同意书。收集健康成人男性中段晨尿，注意操作及收集过程中保持清洁。①分离、培养：收集清洁晨尿200 mL，加入5 mL青链霉素混匀，迅速分装入4个50 mL离心管，然后于30 min内放入离心机，1 500 r/min离心10 min，弃上清液，加入10 mL PBS，用移液枪轻轻吹打，待沉淀悬浮起来后，移入15 mL离心管，再次离心10 min，弃上清液，加入尿源性干细胞培养基重悬沉淀，移入培养瓶，标记，放入37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中静置培养，观察细胞生长情况，每3 d换液1次，放在荧光倒置显微镜下观察、拍照；②传代：待原代培养的尿源性干细胞融合率达到70%-80%时，进行传代培养；以1︰3比例进行传代接种，传代时，首先吸弃培养基，离心管中加入5 mL PBS，用胶头滴管冲洗2遍，吸弃PBS，加入1 mL 0.25%胰酶，放入培养箱中30 s-1 min，取出后可轻轻敲打瓶底使其充分反应，放在荧光倒置显微镜下观察细胞形态变化，控制消化时间，若细胞缩短变圆、折光度增加、细胞充分悬浮起来时，加入5 mL含血清的高糖培养基终止消化，放入离心机中1 500 r/min离心5 min，弃上清液，加入尿源性干细胞培养基混匀移入新的培养瓶；③冻存：冻存每代部分细胞备用。步骤如下：吸弃培养基，培养瓶中加入5 mL PBS，用胶头滴管冲洗2遍，吸弃PBS，加入1 mL 0.25%胰酶，放入培养箱中30 s-1 min，取出后可轻轻敲打瓶底使其充分反应，放在荧光倒置显微镜下观察，待细胞充分悬浮起来，加入5 mL含血清的高糖培养基终止消化，放入离心机中1 500 r/min离心5 min，离心过程中配冻存液，按培养基︰胎牛血清︰二甲基亚砜=6︰3︰1的比例配制，待离心结束后，弃上清，加入冻存液混匀，移入冻存管中，封存，标记，梯度冻存，最后放入液氮中冻存^[6]。

1.4.2 MTT法检测细胞生长活性 取第4代尿源性干细胞，待细胞融合率达到70%-80%时，吸弃培养基，PBS冲洗2遍，加入1 mL 0.25%胰酶，放入培养箱30 s-1 min，取出后可轻轻敲打瓶底使其充分反应，放在倒置显微镜下观察细胞形态变化控制消化时间，当细胞缩短变圆、充分悬浮起来后，加入5 mL含血清的高糖培养基终止消化，移入离心管，放入离心机中1 500 r/min离心5 min，弃上清液，加入尿源性干细胞培养液混匀，以5×10³/孔的细胞密度接种于96孔板，共10组，每组8孔，每孔加入200 mL尿源性干细胞培养液，于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中静置培养24 h后，加入用PBS配制的0.5%MTT(5 g/L)20 μL，37 ℃培养箱内培育4 h后终止培养，小心吸出孔内培养液，加入150 μL二甲基亚砜，避光，每行第一孔设置为调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)。用酶标仪在570 nm处测量各孔吸光度值。连续测量10 d，根据测量结果，以生长时间为横轴，吸光度值为纵轴绘制细胞生长曲线^[12]。

1.4.3 尿源性干细胞表面标志物的检测 取第4代尿源性干细胞，待细胞融合率达到70%-80%时，吸弃培养基，加入5 mL PBS冲洗2遍，吸弃PBS，加入1 mL 0.25%胰酶，待充分反应后，加入5 mL含血清的高糖培养基终止消化，移入离心管，1 500 r/min离心10 min，弃上清液，加入尿源性干细胞培养液重悬混匀，调整细胞浓度为5×10⁸ L^-¹，分别加入荧光标记的CD29、CD44、CD73、CD90单克隆抗体^[13]，室温下避光孵育30 min；PBS洗涤细胞，离心，弃上清，加入PBS，振荡，重悬细胞；40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗2遍，流式细胞仪进行检测。

1.4.4 尿源性干细胞多向分化能力及鉴定

成脂肪细胞诱导分化：取生长密度达80%-90%的第4代尿源性干细胞，PBS冲洗，加入1 mL 0.25%胰酶，倒置显微镜下观察，待细胞充分悬浮起来，加入5 mL含血清的高糖培养基终止消化，离心，弃上清液，加入尿源性干细胞培养基混匀，以1×10⁵/孔的细胞密度接种于6孔板中。待细胞贴壁生长至80%-90%时，吸弃培养基，加入2 mL成脂诱导液，放入37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中静置培养，每3 d换液1次，成脂诱导14 d，吸弃诱导液，PBS轻轻漂洗2遍，室温下40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗2遍，60%异丙醇漂洗，然后用3︰2稀释的油红O染液染色30 min，PBS漂洗2遍，于显微镜下观察结果并拍摄照片^[14]。

成骨细胞诱导分化：取生长密度达80%-90%的第4代尿源性干细胞，PBS冲洗，加入1 mL 0.25%胰酶，倒置显微镜下观察，待细胞充分悬浮起来，加入5 mL含血清的高糖培养基终止消化，离心，弃上清，加入尿源性干细胞培养基混匀，以1×10⁵/孔的细胞密度接种于6孔板中。待细胞贴壁生长至80%-90%时，吸弃培养基，加入2 mL成骨诱导液，放入37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中静置培养，每3 d换液1次，成骨诱导21 d，吸弃成骨诱导液，PBS漂洗2遍，室温下40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗2遍，用0.1%的茜素红溶液染色30 min，PBS漂洗2遍，于显微镜下观察结果并拍摄照片^[15]。

1.5 主要观察指标 ①人尿源性干细胞的生长形态；②人尿源性干细胞的生长曲线；③人尿源性干细胞表面抗原的表达；④人尿源性干细胞向成骨、成脂方向的诱导分化能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

近年来，组织工程学作为一门新兴学科，在组织器官的修复和重建方面越来越重要^[16-20]。泌尿道创伤、缺损等修复与重建一直是医学界的难题。既往研究从机体获取少量的活体组织，用特殊的酶或其他方法，将种子细胞从组织中分离出来在体外进行培养扩增，然后将扩增的细胞与具有良好生物相容性、可降解性和可吸收的生物材料(支架)按一定的比例混合，使细胞黏附在生物材料(支架)上形成细胞-材料复合物；将该复合物植入机体的组织或器官病损部位，随着生物材料在体内逐渐被降解和吸收，植入的细胞在体内不断增殖并分泌细胞外基质，最终形成相应的组织或器官，从而达到修复创伤和重建功能的目的^[21-22]。

越来越多的研究者开始关注尿源性干细胞在生物医学中的实用性，其研究进展为人类缺损器官组织尤其是近年来的医学难题尿道缺损等治疗提供更多的选择与机会^[18-22]。已有研究者对尿源性干细胞进行了一系列的研究，并取得了良好的效果^[28]，分离培养获得尿源性干细胞，对其进行生物学特性检测，在体外诱导分化为尿路上皮细胞和平滑肌细胞，将诱导分化细胞种植到支架上，移植入大鼠体内，观察大鼠生长状态，数周后检测发现支架移植物生长状态良好，支架上形成了尿路上皮细胞和平滑肌细胞^[29]。赵雅培等^[30]在SD大鼠肾皮质内注射人尿源干细胞悬液，检测大鼠血清肌酐及肾小球滤过率判断尿源干细胞对肾功能等生化指标有明显改善作用，能够参与肾功能的修复与重建。上海交通大学部分研究者将尿源性干细胞与生物降解材料结合后植入大鼠股骨缺损，8周后可见骨缺损部位有大量的新生骨痂形成，缺损处可见部分髓腔结构出现，表明尿源性干细胞与生物降解材料结合后能促进骨修复再生，尿源性干细胞可以作为骨组织工程的种子细胞^[31]。本研究取健康成人男性尿液，进行分离、纯化，得到尿源性干细胞，通过贴壁培养法将该细胞进行增殖传代培养，发现细胞增殖能力极强，呈贴壁生长状态，细胞生长曲线大致呈“S”型，分为潜伏期、指数生长期、平顶期、衰亡期。对贴壁细胞进行成骨、成脂诱导，发现成脂诱导液诱导后不断出现脂滴沉积，且脂滴逐渐变大并合成串珠状，最后整个细胞的胞浆中都是脂滴，经油红O染色后脂滴呈鲜红色；成骨诱导后钙离子以钙盐的方式沉积下来形成钙化结节，茜素红和钙发生显色反应，产生一种深红色的带色化合物，这样成骨诱导的细胞外沉积的钙结节也就被染成深红色。采用流式细胞技术对尿源性干细胞表面的免疫学表型进行检测，结果发现尿源性干细胞CD29、CD44、CD73、CD90表达阳性，说明尿源性干细胞表面有间充质干细胞类似的表面标志物。由此说明尿源性干细胞也是干细胞家族的重要成员^[32-33]。

研究结果证实，健康成人尿液中确实存在一种大量增殖的细胞，该细胞有很强的增殖分化能力，部分研究者进一步研究证实尿源性干细胞可以向尿路上皮细胞或平滑肌细胞方向分化，当与合适的支架材料结合后，分化的细胞可生长并渗透在支架内，从而防止尿盐结晶暴露在支架表面形成结石及泌尿道感染^[34]。

作者在研究初期留取新鲜尿液时尝试采用留取中段尿液达到相对清洁的目的，但待到离心收集沉渣培养后，发现培养基易污染；而膀胱造瘘管处留取的尿液对机体创伤较大，作者尝试收集志愿者插入导尿管后留取的新鲜尿液，将尿液离心后得到沉渣培养，效果较好。在细胞培养增殖阶段，细胞培养液是由角质细胞无血清培养液和祖细胞培养液以1∶1比例混合而成，隔日换液，发现细胞生长缓慢，而表皮生长因子能有效地促进和调节细胞的生长与增殖，与细胞膜上特异性受体相结合，从而激活蛋白酶，加快蛋白质的合成，促进细胞的生长，在体内体外都对细胞有强烈的促分裂作用。于是作者在培养基里面加入表皮生长因子，发现细胞生长迅速且生长状态好。

过去，科学家只能人工培育出皮肤、骨等一些相对简单的组织或器官，若尿源性干细胞研究顺利，可以培育出相对复杂的组织或器官，这有望成为移植器官的新来源，如进行膀胱再造完成器官移植等，有望给更多的患者带来福音^[35]。尿源性干细胞能为泌尿器官的修复重建提供理想的干细胞来源，但是，在应用于临床之前，其仍有许多问题有待于解决^[36]。尿源性干细胞种植到支架上是否会引起细胞排斥反应，尿源性干细胞与支架结合种植体内是否有成瘤恶变风险等，仍需进一步研究。尿源性干细胞诱导分化为平滑肌细胞和尿路上皮细胞技术尚不成熟，尽管有人将兔尿源性干细胞诱导为尿路上皮细胞和平滑肌细胞^[37-40^]，但有关尿源性干细胞诱导分化尿路上皮细胞和平滑肌细胞的研究较少。目前如何高效的诱导分化获取目的细胞仍是下一步研究的重点。虽然当前对有些难题尚不足以解决，但是，近些年随着组织工程学、再生医学的研究进展^[41-44]，干细胞对科研及临床做出越来越多的贡献，特别是尿源性干细胞的发展为泌尿道缺损器官、组织的再生、愈合开启了全新的研究方向^[45-46]，随着对尿源性干细胞研究的进一步深入，其必将为再生医学的发展作出卓越贡献。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程