异基因造血干细胞移植后调节T细胞及相关细胞因子水平：粒细胞集落刺激因子的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0416

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
异基因造血干细胞移植的3个必要条件：一是移植前的预处理，这是为了使受者能够接受外来的造血干细胞和减少本身肿瘤细胞负荷采取的措施；二是受者和供者应有相匹配的人类白细胞抗原(HLA)系统；三是要有一定量的造血干细胞数。
粒细胞集落刺激因子：主要由内毒素、肿瘤坏死因子α和γ-干扰素活化单核细胞和巨噬细胞产生。粒细胞集落刺激因子基因全长2.5 kb，包括5个外显子和4个内含子，有5个半胱氨酸，Cys36与Cys42，Cys74与Cys64之间形成两对二硫键，Cys17为不配对半胱氨酸，二硫键对于维持粒细胞集落刺激因子生物学功能是必须的因素。人和小鼠粒细胞集落刺激因子在氨基酸水平上有73%同源性，并具有相互交叉的生物学活性。

摘要
背景：急性移植物抗宿主病是调节T细胞介导的炎症性疾病，通过改善机体CD4⁺CD5⁺Treg及其相关炎症因子水平对预防及治疗急性移植物抗宿主病具有一定的意义。
目的：探讨粒细胞集落刺激因子对恶性血液疾病患儿异基因造血干细胞移植后CD4⁺CD5⁺Treg及相关细胞因子水平的影响。
方法：选取70例接受异基因造血干细胞移植的血液疾病患儿，其中45例供者移植前经粒细胞集落刺激因子动员为粒细胞集落刺激因子组，另25例直接采集骨髓为非粒细胞集落刺激因子组，分别于异基因造血干细胞移植后4周采集外周血，另选取60例健康体检儿童为对照组，应用流式细胞仪及ELISA法测定各组外周血调节T细胞水平及血清白细胞介素35、干扰素γ水平。根据异基因造血干细胞移植后是否发生急性移植物抗宿主病将70例血液疾病患儿分为急性移植物抗宿主病阳性组及急性移植物抗宿主病阴性组，分析调节T细胞及细胞因子水平变化与急性移植物抗宿主病的关系。
结果与结论：①血液疾病患儿CD4⁺CD5⁺Treg占CD4⁺T细胞比例、CD4⁺CD5⁺Treg占CD4⁺FoxP3⁺T细胞比例及血清白细胞介素35水平低于对照组(P<0.05)，而干扰素γ水平均高于对照组(P<0.05)；②粒细胞集落刺激因子组CD4⁺CD5⁺Treg占CD4⁺T细胞比例、CD4⁺CD5⁺Treg占CD4⁺FoxP3⁺T细胞比例及血清白细胞介素35水平低于非粒细胞集落刺激因子组(P<0.05)，而干扰素γ水平高于非粒细胞集落刺激因子组(P<0.05)；③粒细胞集落刺激因子组移植后4周急性移植物抗宿主病阳性7例(16%)，非粒细胞集落刺激因子组移植后4周急性移植物抗宿主病阳性10例(40%)，两组患者急性移植物抗宿主病发生率差异有显著性意义(P=0.022)；④急性移植物抗宿主病阴性组CD4⁺CD5⁺Treg占CD4⁺T细胞比例、CD4⁺CD5⁺Treg占CD4⁺FoxP3⁺T细胞比例及血清白细胞介素35水平高于急性移植物抗宿主病阳性组(P<0.05)，而干扰素γ水平低于急性移植物抗宿主病阳性组(P<0.05)；⑤经Pearson单因素分析可知，CD4⁺CD5⁺Treg细胞、CD4⁺FoxP3⁺T细胞与白细胞介素35呈正相关(P<0.05)，而与干扰素γ均呈负相关；⑥粒细胞集落刺激因子动员异基因造血干细胞移植后能有效提高CD4⁺CD5⁺Treg细胞及其转录因子Foxp3水平，对提高恶性血液疾病患者异基因造血干细胞移植治疗效果及预防急性移植物抗宿主病具有一定的意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-8127-9573(向金峰)

关键词: 干细胞, 粒细胞集落刺激因子, 异基因造血干细胞移植, 恶性血液疾病, CD4⁺CD5⁺调节T细胞, 细胞因子

Abstract:

BACKGROUND: Acute graft-versus-host disease (aGVHD) is an inflammatory disease mediated by regulatory T cells. It is of certain significance to prevent and treat aGVHD by improving the levels of CD4⁺CD5⁺ regulatory T cells (CD4⁺CD5⁺Treg)and related inflammatory factors in the body.
OBJECTIVE: To investigate the effect of granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) on CD4⁺CD5⁺ regulatory T cells (CD4⁺CD5⁺Treg) and cytokines in children with hematological malignancies after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT).
METHODS: Seventy children with hematological malignancies undergoing allo-HSCT were enrolled. G-CSF was mobilized in the 45 cases (G-CSF group) before allo-HSCT transplantation. The other 25 cases were assigned to non-G-CSF group. Peripheral blood samples were collected at 4 weeks after allo-HSCT. Another 60 healthy children were selected as control group. The levels of T cells, serum interleukin-35 (IL-35) and interferon-γ (INF-γ) were measured by flow cytometry and ELISA, respectively. According to whether aGVHD occurred after allo-HSCT, the 70 cases were divided into aGVHD positive group and aGVHD negative group. The relationship between the changes of T cells and cytokines with aGVHD was analyzed.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The percentage of CD4⁺CD5⁺Treg in CD4⁺ T and CD4⁺FoxP3⁺ T cells as well as serum IL-35 level in children with hematological diseases were lower than those in the control group (P < 0.05), while the levels of INF-γ were significantly higher than that in the control group (P < 0.05). (2) The percentage of CD4⁺CD5⁺Treg in CD4⁺ T cells and CD4⁺FoxP3⁺ T cells as well as serum IL-35 level in the G-CSF group were lower than those in the non-G-CSF group (P < 0.05), while the levels of INF-γ was higher than that in the non-G-CSF group (P < 0.05). (3) There were 7 cases (16%) of aGVHD in the G-CSF group and 10 cases (40%) of aGVHD in the non-G-CSF group at 4 weeks after allo-HSCT, and the incidence of aGVHD was significantly different between the G-CSF and non-G-CSF groups (P=0.022). (4) The percentage of CD4⁺CD5⁺Treg in CD4⁺ T and CD4⁺FoxP3⁺ T cells as well as serum IL-35 level in the aGVHD negative group were higher than those in the aGVHD positive group (P < 0.05), while the levels of INF-γ were significantly lower than that in the aGVHD positive group (P < 0.05). (5) CD4⁺CD5⁺Treg and CD4⁺FoxP3⁺ T cells were positively correlated with the IL-35 level, but negatively correlated with the INF-γ level by Pearson single factor analysis. To conclude, G-CSF mobilization can significantly improve CD4⁺CD5⁺Treg cells and its transcription factor Foxp3 after allo-HSCT, which may be useful for improving the therapeutic effect of allo-HSCT and preventing aGVHD in patients with malignant hematological diseases.

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Key words: Hematopoietic Stem Cell Transplantation, Granulocyte Colony-Stimulating Factor, Hematologic Diseases, Cytokines, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

向金峰. 异基因造血干细胞移植后调节T细胞及相关细胞因子水平：粒细胞集落刺激因子的作用[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(1): 89-94.

Xiang Jin-feng. Effects of granulocyte-colony stimulating factor on regulatory T cells and related cytokines after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(1): 89-94.

图/表（结果） 3

参考文献

[1] 郭智,陈惠仁,刘晓东,等.单倍型异基因造血干细胞移植治疗儿童重型再生障碍性贫血[J].中华实用儿科临床杂志,2014,29(15): 1145-1148.

[2] 王晓宁,张梅,贺鹏程,等.非血缘异基因造血干细胞移植治疗白血病21例临床观察[J].西安交通大学学报:医学版,2015,36(2): 280-284.

[3] 王萌,徐衍,孙慧,等.移植物中CCR6＋及CCR7＋T细胞数量与异基因造血干细胞移植受者急性移植物抗宿主病发生的关系[J].郑州大学学报:医学版,2016,51(4):494-497.

[4] 程永贵,杨广民,肖中平.CIK 细胞对急性髓细胞白血病微小残留病作用的研究[J].吉林医学,2012,33(8):1571-1574.

[5] 张之南,沈悌.血液病诊断及疗效标准[M].3版.北京:科学出版社, 2008:103-121,131-139,147-148,157-163,220-228.

[6] Ruggeri L, Mancusi A, Burchielli E, et al. NK cell alloreactivity and allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Blood Cells Mol Dis. 2008;40(1):84-90.

[7] Koreth J, Schlenk R, Kopecky KJ, et al. Allogeneic stem cell transplantation for acute myeloid leukemia in first complete remission: systematic review and meta-analysis of prospective clinical trials. JAMA. 2009;301(22):2349-2361.

[8] Fernandez HF, Sun Z, Litzow MR, et al. Autologous transplantation gives encouraging results for young adults with favorable-risk acute myeloid leukemia, but is not improved with gemtuzumab ozogamicin. Blood. 2011;117(20): 5306-5313.

[9] Kim ST, Jung CW, Lee J, et al. Postremission therapy for acute myeloid leukemia in the first remission. Leuk Lymphoma. 2007;48(5):937-943.

[10] Jing Y, Li H, Zhao Y, et al. Efficacy of allogeneic and autologous hematopoietic SCT in patients with AML after first complete remission. Bone Marrow Transplant. 2013;48(3):383-389.

[11] 王荷花,冯四洲,王玫,等.急性白血病患者第一次完全缓解期自体和异基因造血干细胞移植疗效的比较[J].中华血液学杂志,2004, 25(7):389-392.

[12] Hamadani M, Awan FT, Copelan EA. Hematopoietic stem cell transplantation in adults with acute myeloid leukemia. Biol Blood Marrow Transplant. 2008;14(5):556-567.

[13] Loh YS, Koh LP, Tai BC, et al. Long-term follow-up of Asian patients younger than 46 years with acute myeloid leukemia in first complete remission: comparison of allogeneic vs. autologous hematopoietic stem cell transplantation. Leuk Lymphoma. 2007;48(1):72-79.

[14] Michallet AS, Chelghoum Y, Thiebaut A, et al. Autologous hematopoietic stem cell transplantation for adults with acute myeloid leukemia in complete remission: the Edouard Herriot Hospital experience. Hematology. 2006;11(3):157-164.

[15] 刘辉,常乃柏,顾惜春,等.自体造血干细胞移植治疗急性白血病的临床观察[J].临床血液学杂志,2009,22(1):24-26.

[16] 冯四洲,魏嘉璘,邹德惠,等.自体造血干细胞移植治疗急性白血病患者143例疗效分析[J].内科急危重症杂志,2005,11(3):112-115.

[17] Linn YC, Wang SM, Hui KM. Comparative gene expression profiling of cytokine-induced killer cells in response to acute myloid leukemic and acute lymphoblastic leukemic stimulators using oligonucleotide arrays. Exp Hematol. 2005;33(6):671-681.

[18] 薛重重,杨丽萍,徐新,等.血液肿瘤患者AHSCT后DC/CIK免疫治疗的疗效观察[J].中华全科医学,2012,10(3):341-342.

[19] 王玲,史春雷,李颖,等.恶性血液病自体造血干细胞移植后DC-CIK细胞预防复发探讨[J].青岛大学医学院学报,2010,46(2):142-144.

[20] 苏毅,易海,范方毅,等.荷载自体白血病抗原的DC-CIK细胞预防急性髓细胞性白血病自体造血干细胞移植后复发的临床研究[J].中国输血杂志,2010,23(12):1024-1028.

[21] Introna M, Borleri G, Conti E, et al. Repeated infusions of donor-derived cytokine-induced killer cells in patients relapsing after allogeneic stem cell transplantation: a phase I study. Haematologica. 2007;92(7):952-959.

[22] Nishimura R, Baker J, Beilhack A, et al. In vivo trafficking and survival of cytokine-induced killer cells resulting in minimal GVHD with retention of antitumor activity. Blood. 2008;112(6): 2563-2574.

[23] 罗云,张萍,张颖,等.异基因造血干细胞移植后序贯输注供者CIK细胞治疗9例复发/难治性血液肿瘤疗效的初步探讨[J].肿瘤, 2012, 32(7):546-550.

[24] Introna M, Franceschetti M, Ciocca A, et al. Rapid and massive expansion of cord blood-derived cytokine-induced killer cells: an innovative proposal for the treatment of leukemia relapse after cord blood transplantation. Bone Marrow Transplant. 2006;38(9):621-627.

[25] 童春容,耿彦彪,陆道培.自体细胞因子诱导的杀伤细胞治疗急性白血病的临床研究[J].北京医科大学学报,2000,32(5):473-477.

[26] 陈智超,李菁媛,姚军霞,等.DC-CIK细胞治疗自体外周血造血干细胞移植后急性髓性白血病的临床研究[J].临床内科杂志,2007, 24(9):596-598.

[27] 童春,郭智,楼金星,等.异基因造血干细胞移植后T淋巴细胞亚群监测的临床意义[J].中国实验血液学杂志,2016,24(1):167-172.

[28] 王亮,朱康儿,张涛,等.小鼠异基因造血干细胞移植后使用G-CSF对aGVHD的影响[J].中国病理生理杂志,2015,31(12): 2188-2194.

[29] 王利军,刘明娟,赵小利,等.异基因造血干细胞移植治疗45例骨髓增生异常综合征临床及预后分析[J].中国实验血液学杂志,2016, 24(2):502-509.

[30] 李猛,管立勋,谷振阳,等.rhG-CSF动员对异基因造血干细胞移植供者T淋巴细胞亚群S1P5表达的影响[J].中国实验血液学杂志, 2016,24(4):1132-1136.

[31] Khandelwal P, Emoto C, Fukuda T, et al. A Prospective Study of Alemtuzumab as a Second-Line Agent for Steroid-Refractory Acute Graft-versus-Host Disease in Pediatric and Young Adult Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 2016; 22(12):2220-2225.

[32] Wang J, Luan Z, Jiang H, et al. Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation in Thirty-Four Pediatric Cases of Mucopolysaccharidosis-A Ten-Year Report from the China Children Transplant Group. Biol Blood Marrow Transplant. 2016;22(11):2104-2108.

[33] Wang L, Zhang H, Guan L, et al. Mesenchymal stem cells provide prophylaxis against acute graft-versus-host disease following allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: A meta-analysis of animal models. Oncotarget. 2016;7(38): 61764-61774.

[34] Jiang X, Xu L, Zhang Y, et al. Rituximab-based treatments followed by adoptive cellular immunotherapy for biopsy-proven EBV-associated post-transplant lymphoproliferative disease in recipients of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Oncoimmunology. 2016;5(5):e1139274.

[35] Ye Y, Zheng W, Wang J, et al. Risk and prognostic factors of transplantation-associated thrombotic microangiopathy in allogeneic haematopoietic stem cell transplantation: a nested case control study. Hematol Oncol. 2016;5(2):78-80.

[36] Gassas A, Krueger J, Schechter T, et al. Safety and Role of Gastrointestinal Endoscopy in the Management of Gastrointestinal Acute GVHD in Children After Hematopoietic Stem Cell Transplantation. J Pediatr Hematol Oncol. 2016; 38(6):453-456.

引言

异基因造血干细胞移植是目前治疗恶性血液疾病的有效方法，异基因造血干细胞移植成功的关键在于供者来源的造血重建及免疫重建^[1]。但由于供者与受者间个体免疫学差异，移植后受者发生的急性移植物抗宿主病仍是影响异基因造血干细胞移植成功的关键因素，急性移植物抗宿主病的发生会导致造血干细胞移植后免疫功能重建延迟、抗感染能力下降及肿瘤抑制效应下降^[2]。

近年研究指出，调节T细胞(CD4⁺CD5⁺Treg)及其另一特征性标志物叉头样转录因子(Foxp3)在维持机体免疫应答稳定性及耐受性方面起到重要的作用^[3]。白细胞介素35是新近发现的由Treg分泌的抑制性细胞因子，对T细胞免疫反应起到负性调节作用^[4]。干扰素γ由有丝分裂原刺激T淋巴细胞产生，是一种具有广泛免疫调节作用的淋巴因子^[5]。

近年研究指出，急性移植物抗宿主病是调节T细胞介导的炎症性疾病^[6]，其发生与机体免疫功能调节异常有密切的关系，因此通过改善机体调节T细胞及其相关炎症因子水平对预防及治疗急性移植物抗宿主病具有一定的意义。粒细胞集落刺激因子属于天然造血生长因子，是异基因造血干细胞移植或祖细胞动员最常用的细胞因子，粒细胞集落刺激因子体内动员使供者外周血T细胞功能及数量发生一系列改变，尤其可使CD4⁺T细胞向Th2型细胞极化而影响急性移植物抗宿主病的发生率^[7]。本研究探讨粒细胞集落刺激因子对异基因造血干细胞移植后恶性血液疾病患儿CD4⁺CD5⁺Treg细胞及相关细胞因子水平的影响，为临床提高异基因造血干细胞移植成功率提供指导。

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材料方法

1.1 设计 回顾性病例资料分析。

1.2 时间及地点 于2014年6月至2016年6月在南阳市中心医院完成。

1.3 对象 纳入血液科收治的70例血液疾病患儿，其中男48例，女22例；年龄3-12岁，平均(5.9±0.8)岁；急性髓系细胞白血病18例，急性淋巴细胞白血病12例，慢性粒细胞白血病13例，非霍奇金淋巴瘤12例，多发性骨髓瘤10例，骨髓增生异常综合征5例；均为人类白细胞抗原系统(HLA)配型6个位点完全相合。

纳入标准：①符合2000年WHO血液疾病诊断标准；②均接受异基因造血干细胞移植治疗；③以粒细胞集落刺激因子为动员方案；④同胞全相合异基因外周血造血干细胞移植者；⑤供者均为自愿捐献，并签署知情同意书；⑥所有捐献者均获得南阳市中心医院医学伦理委员会批准。

排除标准：①移植前全身性感染者；②多器官功能衰竭者；③合并严重免疫性疾病者；④凝血功能障碍者。

另选取60例健康体检儿童为对照组，排除糖尿病、高血压、心血管疾病，男39例，女21例，年龄3-12岁，平均(6.2±0.5)岁，年龄及性别与移植患儿相匹配。

1.4 方法

1.4.1 预处理方法 采用改良马利兰/环磷酰胺(BU/CY)方案48例，具体如下：移植前9 d应用司莫司汀250 mg/m²，羟基脲 40 mg/kg；移植前8 d应用阿糖胞苷2 mg/m²，每12 h 1次，连用4 d；移植前5 d至移植前3 d应用马利兰4 mg/(kg•d)，移植前4 d至移植前3 d应用环磷酰胺1.8 g/m²。另外22例患者应用全身照射+环磷酰胺(TBI+CY)方案，移植前7 d行全身放疗7.5 Gy，肺部为6.5 Gy，移植前三四天应用环磷酰胺1.8 g/m²。

1.4.2 干细胞动员及采集 45例供者移植前经粒细胞集落刺激因子动员，设为粒细胞集落刺激因子组，另外25例直接采集骨髓，设为非粒细胞集落刺激因子组。粒细胞集落刺激因子组移植前5 d连续每天皮下输注5 µg/kg粒细胞集落刺激因子，第6天应用血细胞分离机采集外周血造血干细胞，并根据供者性别、身高、体质量、红细胞比容、单个核细胞百分比、白细胞计数等参数调整干细胞采集数量，循环10-12 L。若CD34细胞< 2×10²/kg需要再次采集，采集前静脉推注或口服10%葡萄糖酸钙注射液50-100 mL预防低血钙症。非粒细胞集落刺激因子组移植前不进行皮下输注粒细胞集落刺激因子，硬膜麻醉后直接采集骨髓，采髓量为0.8-1.5 L。

1.4.3 移植物抗宿主病预防 移植前4 d至移植前1 d每天静脉滴注环孢霉素3 mg/kg，移植后当天将剂量调整至每天1.5 mg/kg，移植前5 d口服霉酚酸酯30 mg/kg，分别于移植第1，3，8天静脉输注抗CD25单克隆抗体1 mg/kg，若移植后150-180 d未发生移植物抗宿主病则减停霉酚酸酯及环孢霉素。

1.4.4 T调节细胞及细胞因子测定

血液样本制备：粒细胞集落刺激因子组与非粒细胞集落刺激因子组于异基因造血干细胞移植后4周采集外周血6 mL，对照组儿童于体检当天收集外周血6 mL，每组分别将血液样本分装于A、B两支试管中，A试管用于测定T调节细胞，B试管用于测定血清细胞因子。

调节T细胞测定：取A试管，加入红细胞裂解液溶解红细胞后，滴入膜表面抗体，于37 ℃中避光孵育30 min，PBS洗涤离心后收集悬浮物待测。取400 µL新鲜肝素抗凝全血，用含体积分数为10%小牛血清的RPMI1640培养基稀释至1 mL，加入40 μg/L佛波酯，2.5 mg/L伊诺霉素，0.7 µL高尔基阻断剂，于37 ℃，体积分数为5% CO₂培养箱中孵育 4 h，孵育后采用红细胞裂解液将红细胞溶解，并加入膜表面抗体，于室温下避光孵育30 min，应用PBS洗涤液离心后收集细胞待测。上述待测细胞应用美国BD公司流式细胞仪测定，采用FCS express软件分析CD4⁺CD5⁺Treg占CD4⁺T细胞比例、CD4⁺CD5⁺Treg占CD4⁺FoxP3⁺T细胞比例。

1.4.5 血清白细胞介素35、干扰素γ水平测定 取B试管，经离心后留取上清液，应用ELISA法测定各组血清白细胞介素35、干扰素γ水平，白细胞介素35试剂盒由卡迈舒(上海)生物科技有限公司提供，干扰素γ试剂盒由上海恒远生化试剂公司提供，操作过程严格按照试剂盒说明书进行。

1.5 主要观察指标 ①记录70例接受异基因造血干细胞移植患儿急性移植物抗宿主病发生情况。急性移植物抗宿主病临床表现为消化道症状、皮疹及肝功能异常等，同时还累及肾脏、肺脏及其他器官组织，参照文献标准^[8]，根据累及器官严重程度将急性移植物抗宿主病分为Ⅰ-Ⅳ级。②CD4⁺CD5⁺Treg占CD4⁺T细胞比例、CD4⁺CD5⁺Treg占CD4⁺FoxP3⁺T细胞比例；③血清白细胞介素35、干扰素γ水平。

1.6 统计学分析 应用SPSS 19.0对结果进行统计学分析，计量资料采用x(_)±s表示，组间比较采用t 检验，计数资料比较采用χ²检验，调节T细胞与白细胞介素35、干扰素γ的关系应用Pearson相关因素分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

异基因造血干细胞移植是目前治疗恶性血液疾病的重要手段之一，但术后急性移植物抗宿主病是限制异基因造血干细胞应用的重要原因。急性移植物抗宿主病的发生是由于供者淋巴细胞识别受体组织相容性抗原后活化而对受者组织细胞进行攻击，其中CD4⁺T淋巴在这过程中起到重要的作用^[9-10]。目前根据分泌因子及细胞功能不同可将CD4⁺T分为Th1、Th2、Th17及Treg等细胞亚群，而Treg在抑制移植排斥反应及自身免疫疾病及介导免疫耐受性中起到重要的作用^[11-13]。目前多项研究指出，Treg百分比或Foxp3转录因子水平与异基因造血干细胞移植后急性移植物抗宿主病的发生有密切的关系^[14-15]。白细胞介素35是由Treg分泌的抑制性细胞因子，在Treg免疫调控中起到负调节作用。白细胞介素35在人体中不仅能促进Treg产生而且能抑制其免疫能力，同时对Th17细胞也具有增殖及抑制能力，可减少干扰素γ炎症因子分泌^[16-17]。干扰素γ可激活T淋巴细胞毒性，在发挥抗排斥效应同时可杀灭自身细胞，干扰素γ水平升高与急性移植物抗宿主病发生有密切的关系^[18-20]。

粒细胞集落刺激因子属于低分子糖蛋白，可作为骨髓移植或促进祖细胞产生的动员剂，近年被广泛应用在异基因造血干细胞移植中。有研究认为供者通过应用粒细胞集落刺激因子可有效抑制T细胞异种反应^[21-22]，能让T细胞处于免疫低反应状态，并可抑制T细胞分泌干扰素γ，促使CD4⁺T细胞向Th2极化，在异基因造血干细胞移植中起到重要的作用。本研究中血液疾病患儿CD4⁺CD5⁺Treg占CD4⁺T细胞比例、CD4⁺FoxP3⁺T细胞比例及血清白细胞介素35水平低于对照组，而干扰素γ水平高于对照组。粒细胞集落刺激因子组CD4⁺CD5⁺Treg占CD4⁺T细胞比例、CD4⁺CD5⁺Treg占CD4⁺FoxP3⁺T细胞比例及血清白细胞介素35水平低于非粒细胞集落刺激因子组，而干扰素γ水平高于非粒细胞集落刺激因子组，提示经粒细胞集落刺激因子动员供者外周血后异基因造血干细胞移植能有效上调CD4⁺CD5⁺Treg及CD4⁺FoxP3⁺T水平，下调干扰素γ水平，对改善受者移植后免疫功能具有重要的作用。考虑可能机制为粒细胞集落刺激因子可诱导CD4⁺T细胞表达粒细胞集落刺激因子受体，这种受体表达呈时间依赖性，并能重复刺激粒细胞集落刺激因子受体在CD4⁺T细胞上表达，从而起到上调CD4⁺CD5⁺Treg细胞的作用^[23-24]。

粒细胞集落刺激因子组移植后4周急性移植物抗宿主病阳性7例(16%)，非粒细胞集落刺激因子组移植后4周急性移植物抗宿主病阳性10例(40%)，两组患者移植后急性移植物抗宿主病发生率差异有显著性意义，进一步提示粒细胞集落刺激因子动员异基因造血干细胞移植后能有效提高CD4⁺CD5⁺Treg细胞及其转录因子Foxp3水平，从而能降低急性移植物抗宿主病发生^[25-28]。

通过检测异基因造血干细胞移植后发生急性移植物抗宿主病与未发生急性移植物抗宿主病患者外周血CD4⁺CD5⁺Treg细胞、CD4⁺FoxP3⁺T细胞及血清干扰素γ、白细胞介素35表达水平，结果显示，急性移植物抗宿主病阳性组CD4⁺CD5⁺Treg占CD4⁺T细胞比例、CD4⁺FoxP3⁺T细胞比例及血清白细胞介素35水平低于急性移植物抗宿主病阴性组(P < 0.05)，而干扰素γ水平高于急性移植物抗宿主病阴性组(P < 0.05)，提示CD4⁺CD5⁺Treg细胞及其转录因子Foxp3比例下调和相关细胞因子异常表达与恶性血液疾病异基因造血干细胞移植后急性移植物抗宿主病发生有密切的关系^[29-32]。有研究指出，急性移植物抗宿主病发生前一两周患者外周血CD4⁺CD5⁺Treg比例已明显下降^[33-34]，说明CD4⁺CD5⁺Treg比例在急性移植物抗宿主病发生前某个时间点已经下降将至最低。经Pearson单因素分析可知，CD4⁺CD5⁺Treg细胞、CD4⁺FoxP3⁺T细胞与白细胞介素35呈正相关，而与干扰素γ呈负相关，表明白细胞介素35、干扰素γ与Treg细胞有密切的关系，而Treg细胞在急性移植物抗宿主病发生中起到重要的作用。因此，异基因造血干细胞移植后检测外周血CD4⁺CD5⁺Treg比例及血清白细胞介素35、干扰素γ水平将有助于尽早识别急性移植物抗宿主病的发生，以便临床及时采取有效的预防控制措施^[35-36]。

综上所述，粒细胞集落刺激因子动员异基因造血干细胞移植后能有效提高CD4⁺CD5⁺Treg细胞及其转录因子Foxp3水平，对提高恶性血液疾病患者异基因造血干细胞移植治疗效果及预防急性移植物抗宿主病具有一定的意义。

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