脂联素基因修饰羊膜间充质干细胞移植对糖尿病大鼠胰岛再生的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0414

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
脂联素：作为一种胰岛素超敏化激素，能促进骨骼肌细胞的脂肪酸氧化和糖吸收，加强胰岛素抑制糖原异生作用，是机体脂质代谢和血糖稳态调控网络中的重要调节因子。
人羊膜间充质干细胞：主要由来源于羊膜的中胚层，研究发现人羊膜间充质干细胞可以向胰岛素分泌细胞分化，还具有免疫调节作用，为其通过免疫调节治疗1型糖尿病提供了可能性。大量研究表明羊膜间充质干细胞移植对糖尿病具有较好疗效，但是其作用机制有待进一步研究。

摘要
背景：脂联素作为目前惟一发现的对人体有保护性作用的脂源性细胞因子，其在糖尿病的发生发展中具有重要作用。
目的：探讨脂联素基因修饰羊膜间充质干细胞对糖尿病大鼠胰岛再生的影响及其机制。
方法：从98只SD大鼠中随机取15只不做任何处理，作为对照组，其余按60 mg/kg的剂量腹腔注射链脲佐菌素构建糖尿病模型，成功建模75只，遵循随机分组原则，随机分为糖尿病组、人羊膜间充质干细胞移植组、脂联素基因修饰的人羊膜间充质干细胞移植组，尾静脉分别注射生理盐水20 μL、2×10⁶ L^-1的人羊膜间充质干细胞悬液20 μL、脂联素基因修饰后的人羊膜间充质干细胞悬液20 μL，连续移植3 d。移植后第7，14，21，28天检测各组大鼠血糖、血清胰岛素水平，移植后第21天，采用RT-PCR、Western blot检测各组大鼠胰岛组织脂联素、Caspase3、Bax的表达，苏木精-伊红染色观察胰腺组织的病理变化，原位末端标记法观察胰岛细胞的凋亡情况。
结果与结论：①与对照组相比，糖尿病组大鼠血糖水平显著升高、胰岛素水平显著下降(P < 0.05)；与糖尿病组比较，人羊膜间充质干细胞移植组血糖水平下降(P < 0.05)，胰岛素水平升高(P < 0.05)；与人羊膜间充质干细胞移植组比较，脂联素基因修饰的人羊膜间充质干细胞移植组血糖水平进一步下降(P < 0.05)，胰岛素水平进一步升高(P < 0.05)；②脂联素基因修饰的人羊膜间充质干细胞移植组脂联素mRNA和蛋白的表达明显高于对照组、糖尿病组和人羊膜间充质干细胞移植组(P < 0.05)；③与糖尿病组相比，脂联素基因修饰的人羊膜间充质干细胞移植组Caspase-3、Bax的基因和蛋白表达显著降低(P < 0.01)，人羊膜间充质干细胞移植组亦降低(P < 0.05)；④脂联素基因修饰的人羊膜间充质干细胞移植组胰岛组织形态显著恢复，胰岛细胞凋亡最少；⑤结果表明，脂联素基因修饰羊膜间充质干细胞移植可以改善链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠血糖水平，促进糖尿病大鼠胰岛再生，可能是通过调节胰岛组织中Caspase3、Bax的表达，减少胰岛细胞凋亡实现的。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-5285-4273(李凤敏)

关键词: 干细胞, 人羊膜间充质干细胞, 脂联素, 大鼠, 移植, 糖尿病模型, 血糖, Caspase-3, Bax

Abstract:

BACKGROUND: Adiponectin is the only lipid-derived cytokine that exerts a protective effect on the human body, and it also plays an important role in the development and progression of diabetes mellitus.
OBJECTIVE: To explore the effect of adiponectin gene-modified human amniotic membrane mesenchymal stem cell (hAMSCs) transplantation on islet neogenesis and the relevant mechanism.
METHODS: Fifteen Sprague-Dawley rats without any processing were randomly selected from 98 Sprague-Dawley rats as control group. The remaining rats were used to establish diabetic models by intraperitoneal injection of 60 mg/kg streptozotocin, and the animal model was successfully prepared in 75 rats. Then, the model rats were randomized into diabetic, hAMSCs, adiponectin-modified hAMSCs groups, followed by 3-day caudal vein injection of normal saline (20 μL), 2×10⁶/L hAMSCs suspension (20 μL), and adiponectin-modified hAMSCs suspension (20 μL), respectively. Blood glucose and serum insulin levels of all rats were detected at 7, 14, 21, 28 days after transplantation. RT-PCR and western blot were used to test mRNA and protein expression of adiponectin, Caspase3 and Bax, respectively at 21 days after transplantation. Pathological changes of the rat pancreatic tissues were observed by hematoxylin-eosin staining. Apoptosis of islet cells was observed using TUNEL method.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the control group, the blood glucose level was obviously increased, while the serum insulin level was significantly decreased in the diabetic group (P < 0.05). Compared with the diabetic group, the blood glucose level was obviously decreased, while the serum insulin level was significantly increased in the hAMSCs group (P < 0.05). Compared with the hAMSCs group, the blood glucose level was further decreased, while the serum insulin level was further increased in the adiponectin-modified hAMSCs group (P < 0.05). (2) The expression of adiponectin at mRNA and protein levels was significantly higher in the adiponectin-modified hAMSCs group than the other groups (P < 0.05). (3) Compared with the diabetic group, the expression of Caspase-3 and Bax at mRNA and protein levels was significantly decreased in the adiponectin-modified hAMSCs group (P < 0.01) and in the hAMSCs group (P < 0.05). (4) In the adiponectin-modified hAMSCs group, the morphology of the islet was dramatically recovered and the number of islet cells was minimally reduced. To conclude, the adiponectin-modified hAMSCs transplantation can improve the blood glucose level and promote islet neogenesis in diabetic rats, probably by regulating the expression of Caspase-3 and Bax in the islet and reducing apoptosis in islet cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Amnion, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Adiponectin, Diabetes Mellitus, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

李凤敏，顾玲玲. 脂联素基因修饰羊膜间充质干细胞移植对糖尿病大鼠胰岛再生的影响[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(1): 77-82.

Li Feng-min, Gu Ling-ling. Effect of adiponectin gene-modified human amniotic membrane mesenchymal stem cell transplantation on islet neogenesis in diabetic rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(1): 77-82.

图/表（结果） 2

2.1 人羊膜间充质干细胞形态及鉴定结果 第3代人羊膜间充质干细胞培养两三天后细胞平铺超过瓶底80%以上，细胞呈集落样生长，核仁明显，结构清晰，细胞多呈梭形和多角形，少数呈星形和圆形，细胞表面光滑，分布较为均匀，可见明显漩涡状的细胞克隆，杂细胞基本消失(图1A)。CM-Dil 标记后显现出鲜艳的橘红色，且颜色均匀(图1B)。经流式细胞仪检测，人羊膜间充质干细胞稳定高表达CD44(97.63%)、CD29(96.75%)、CD105(98.45%)，而CD31(1.63%)、CD34(2.06%)、CD45(0.87%)检测均为极低表达(图1C)。

2.2 实验动物数量分析 参加实验SD大鼠98只，随机取15只不做任何处理，作为对照组，剩余83只进行造模，成功75只，8只造模失败，将75只随机分为糖尿病组、人羊膜间充质干细胞组、脂联素基因修饰的人羊膜间充质干细胞组，每组25只。

2.3 各组大鼠的血糖、血清胰岛素水平 与对照组相比，糖尿病组大鼠血糖水平显著升高；人羊膜间充质干细胞移植组大鼠血糖水平低于糖尿病组，差异有显著性意义(P < 0.05)；脂联素基因修饰人羊膜间充质干细胞组大鼠血糖水平明显低于糖尿病组，差异有非常显著性意义(P < 0.01)，见表1；脂联素基因修饰人羊膜间充质干细胞组血清胰岛素水平高于人羊膜间充质干细胞组(P < 0.05)，人羊膜间充质干细胞移植组血清胰岛素水平高于糖尿病组(P < 0.05)，但均低于对照组(P < 0.05)，见表2。

2.4 人羊膜间充质干细胞存活及分布情况 通过荧光显微镜下观察，脂联素基因修饰人羊膜间充质干细胞组的CM-Dil阳性细胞最多，人羊膜间充质干细胞组CM-Dil染色的细胞数明显低于脂联素基因修饰人羊膜间充质干细胞组，在对照组和糖尿病组均未发现CM-Dil染色的细胞，见图2。

2.5 大鼠胰岛组织脂联素、Caspase3、Bax的mRNA表达 脂联素基因修饰人羊膜间充质干细胞组脂联素mRNA表达水平显著高于对照组、糖尿病组和人羊膜间充质干细胞组，组间差异有显著性意义(P < 0.05)；糖尿病组的Caspase-3、Bax mRNA表达水平最高，人羊膜间充质干细胞组次之，脂联素基因修饰人羊膜间充质干细胞组显著低于糖尿病组，对照组表达水平最低，组间差异有显著性意义(P < 0.05)，见图3。

2.6 大鼠胰岛组织脂联素、Caspase3、Bax的蛋白表达 脂联素基因修饰人羊膜间充质干细胞移植组脂联素蛋白表达水平显著高于对照组、糖尿病组和人羊膜间充质干细胞移植组，组间差异有显著性意义(P < 0.05)；糖尿病组的Caspase-3、Bax蛋白表达水平最高，人羊膜间充质干细胞移植组次之，脂联素基因修饰人羊膜间充质干细胞移植组显著低于糖尿病组，对照组表达水平最低，组间差异有显著性意义(P <0.05)，见图4。

2.7 胰腺组织的病理变化 与对照组比较，糖尿病组胰岛β细胞数量明显减少，并出现不同程度的萎缩，人羊膜间充质干细胞移植组胰岛组织得到一定程度的恢复，脂联素基因修饰人羊膜间充质干细胞移植组胰岛组织形态恢复良好，见图5。

2.8 胰岛细胞的凋亡情况 糖尿病组细胞凋亡率最高，为(23.86±1.53)%，人羊膜间充质干细胞移植组的凋亡率[(19.75±1.20)%]低于糖尿病组但高于脂联素基因修饰人羊膜间充质干细胞移植组[(16.90±1.17)%]，差异有显著性意义(P < 0.05)，脂联素基因修饰人羊膜间充质干细胞移植组凋亡率最低，对照组未见凋亡细胞，见图6。

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年9月至2016年10月在天津医科大学动物实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 健康SD大鼠50只，1个月龄，体质量为215-220 g，购自中国医学科学院动物实验室，动物质量合格证号：SYXK(津)2013-0001。

1.3.2 主要试剂和仪器 胎牛血清、L-DMEM培养基、混合抗生素(青霉素和链霉素)购自GIBCO公司；胰蛋白酶和CM-Dil购于Sigma公司；胰岛素ELISA试剂盒(大鼠)购于Excell公司；多克隆脂联素及Caspase3、Bax兔抗体购于Proteintech公司；GAPDH抗体购于Bioworld公司；二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体)购于优维宁生物技术公司；RIPA裂解液购于碧云天公司；原位细胞凋亡检测试剂盒(TUNEL)购于贝克曼库尔特公司；阿霉素购于美罗华；二氧化碳培养箱购于上海人和科技有限公司；荧光显微镜购于上海仪器厂；冷冻切片机购于Leica公司。

1.4 方法

1.4.1 人羊膜间充质干细胞体外培养 经产妇知情同意及天津市中心妇产医院伦理委员会批准，从足月剖宫产新鲜胎盘剥离羊膜，用无菌手术刀将间质组织切割成面积约1 mm²大小，放于无菌操作台中，PBS洗涤，37 ℃，0.25%胰酶消化0.5 h，连续消化2次，PBS中和，吸取细胞悬液加至L-DMEM培养基中，置于37 ℃、体积分数5%CO₂的饱和湿度培养箱中。隔1 d更换1次培养液，除去未贴壁细胞，待细胞融合85%时，弃去培养基，吸取贴壁细胞，加至培养皿中，3 g/L胰酶消化5 min，用等体积的含体积分数为10%胎牛血清的低糖培养基终止消化，吹打成细胞悬液，1 300 r/min离心10 min，弃去上清非贴壁细胞，调整细胞浓度，进行传代培养。

1.4.2 人羊膜间充质干细胞的鉴定 取第3-5代细胞用0.125%胰蛋白酶消化，离心，用含5%BSA的PBS洗1次，弃上清，将细胞悬浮于含5%BSA的PBS中，分别加入下列鼠抗人单克隆抗体：CD29、CD44、CD105、CD31、CD34、CD45，4 ℃孵育30 min，上流式细胞仪检测。

1.4.3 脂联素基因电转染人羊膜间充质干细胞 将处于对数生长期的细胞，制成单细胞悬液，PBS清洗，胰酶消化，离心收集人羊膜间充质干细胞，用电穿孔缓冲液重悬，离心，静置5 min，清洗细胞3次，离心，重悬于电转液中，转移至电击杯，加入20 μg的质粒DNA，混匀，放置冰上30 min，以电压350 V/cm，电容25 μF，时间常数T为0.9 ms的电转化参数，进行电穿孔。将转染后的人羊膜间充质干细胞接种于培养皿中，内含体积分数为10%小牛血清，1%双抗的DMEM培养基，37 ℃、体积分数为5%CO₂孵箱内孵育。

1.4.4 CM-Dil 标记 将人羊膜间充质干细胞浓度调整为8×10⁸ L^-1，加入5 μL CM-DiL，置于培养箱中孵育25-30 min，离心弃上清，PBS重悬，重复标记2次，显微镜下观察细胞标记的情况，备用。

1.4.5 实验动物分组和造模 从98只SD大鼠中随机取15只不做任何处理，作为对照组，其余按60 mL/kg的剂量腹腔注射生理盐水溶解的链脲佐菌素构建糖尿病模型，成功建模75只，遵循随机分组原则，随机分为糖尿病组、人羊膜间充质干细胞移植组、脂联素基因修饰的人羊膜间充质干细胞移植组，每组25只。造模成功的标准：注射药物后72 h，检测大鼠空腹血糖值，大于16.7 mmol/L为糖尿病模型建模成功。

造模后72 h进行细胞移植，人羊膜间充质干细胞移植组大鼠尾静脉注射细胞浓度为2×10⁶ L^-1的人羊膜间充质干细胞悬液(CM-Dil标记)20 μL；脂联素基因修饰人羊膜间充质干细胞移植组大鼠尾静脉注射细胞浓度为2×10⁶ L^-1的脂联素基因修饰的人羊膜间充质干细胞悬液(CM-Dil标记)20 μL，糖尿病组大鼠尾静脉注射等量的生理盐水，各组大鼠均注射3 d，1次/d。

1.4.6 各组大鼠血糖水平、血清胰岛素水平 移植第7，14，21，28天(每个时间点3只大鼠)，各组大鼠行眼眶取血，滴至血糖试纸测量血糖。然后用乙醚麻醉大鼠，经大鼠腹主动脉取血，按胰岛素ELISA试剂盒说明书的方法，检测血清胰岛素水平。

1.4.7 荧光显微镜观测CM-Dil标记的人羊膜间充质干细胞存活及分布情况 移植后第21天(每组4只大鼠)，取胰岛组织，制作冰冻切片并进行DAPI染色，随机选取每张冷冻切片的3个视野进行拍照记录。

1.4.8 RT-PCR检测大鼠胰岛组织脂联素Caspase3、Bax mRNA表达 移植后第21天(每组3只大鼠)，取大鼠胰岛组织，加入含1 g/L亚铁离子的PBS多次反复冲洗，用匀浆器打匀，并过100 mm滤膜，备用。按Gbeo公司Trizol Total Isolation Reagent 说明书提取总RNA，以mRNA为模板，参照说明书的反转录酶法反转录合成cDNA，在扩增仪上进行RT-PCR。脂联素的上游引物为：5’- TCT AAG ATG AAG GAG ACC ATC -3’，下游引物为：5’- GCG GTA GTA GGA CAG GAA GTT GTT-3’，扩增目的基因片段长度为276 bp。Caspase3的上游引物为：5’-TCT TCC ACC GTT GCC AAT CT -3’，下游引物为：5’-TTC GCC TGC CAG GAA CAT C-3’，扩增目的基因片段长度为213 bp。Bax的上游引物为：5’-TGT GGT CTA TAA TGC GTT TTC C-3′，下游引物为：5’- GGC ACT AAT CAA GTC AAG GTC A-3′，扩增目的基因片段长度为189 bp。内参物GAPDH的上游引物为：5’-AGA AGG CTG GGG CTC ATT TG-3’，下游引物为：5’-AGG GGC CAT CCA CAG TCT TC-3’，扩增目的基因片段长度为103 bp。PCR反应：95 ℃变性30 s，95 ℃退火5 s，60 ℃ 30 s，40个循环，最终72 ℃延伸7 min。将PCR产物10 μL于1.2%琼脂糖凝胶电泳30 min，依据凝胶自动成像及分析系统，计算目的基因与内参照基因GAPDH的吸光度比值。

1.4.9 Western blot检测大鼠胰岛组织脂联素、Caspase3、Bax的蛋白表达 移植后第21天，取上述大鼠胰岛组织，加入100 μL含有蛋白抑制剂PMSF的RIPA细胞裂解液(预先冰浴10 min)，测定蛋白含量。4%聚丙烯酰氨凝胶(SDS-PAGE)电泳，15 mA电泳1 h后，取下凝胶，蛋白条带电转膜至PVDF膜，将转移完成的PVDF膜放入培养皿，加入5%脱脂奶粉，浸过PVDF膜即可，封闭1 h，加入多克隆脂联素及Caspase3、Bax兔抗体(1∶500) 4 ℃恒温过夜，取出PVDF膜，TBST冲洗5次，每次5 min。加入二抗，常温下振荡孵育2 h，取出PVDF膜，TBST冲洗多次，每次5 min。按照ECL说明书的操作步骤，对PVDF膜进行荧光染色，液体A和液体B等量混合后，加至PVDF膜正面反应1 min，暗室曝光、显影、定影，通过Alpha2200图像分析仪对各组条带扫描拍照，进行半定量分析。

1.4.10 苏木精-伊红染色观察胰腺组织的病理变化 移植后第21天(每组3只大鼠)，腹腔麻醉后，取胰腺组织，多聚甲醛固定，冷冻切片机横向切片，片厚为8 μm，贴于明胶包被的盖玻片上，-20 ℃保存，进行苏木精-伊红染色，显微镜400倍镜下观察病理变化。

1.4.11 采用原位末端标记法染色观察胰岛细胞的凋亡情况 移植后第21天(每组3只大鼠)，取胰腺组织，多聚甲醛固定，切片，室温下放置2 h，浸泡于二甲苯溶液中15 min，更换新鲜二甲苯，继续浸泡15 min，依次在无水乙醇、体积分数为95%，90%，80%，70%乙醇溶液中放置5 min，用蒸馏水水化，加入高压氧使抗原得以修复，加入甲醛灭活内源性过氧化物酶，加入5 μL TUNEL混合液和50 μL POD转化剂，放置于37℃湿盒中30 min，PBS冲洗3次，每次五至六分钟。DAB显色，苏木精复染，中性树胶封固，光学显微镜下观察胰岛细胞的凋亡情况。

1.5 主要观察指标 ①各组大鼠血糖、血清胰岛素水平；②各组大鼠胰岛组织脂联素、Caspase3、Bax的表达；③胰腺组织病理变化；④胰岛细胞的凋亡情况。

1.6 统计学分析 所有计量数据以x(_)±s表示，成组设计的均数之间采用t 检验方法，多组间数据比较采用方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。实验数据分析软件为SPSS 13.0。

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