骨髓间充质干细胞与骨髓单个核细胞治疗脑性瘫痪的疗效比较

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0413

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
骨髓间充质干细胞与骨髓单个核细胞的差异：骨髓间充质干细胞和骨髓单个核细胞虽然都为骨髓来源，但是其在细胞类型、分化程度、分泌的相关细胞因子等方面均有较大差异。首先，间充质干细胞为多能干细胞，具有较强的分化能力，可以分化成多种类型的成熟细胞，而骨髓单个核细胞为成熟的细胞。其次，间充质干细胞可以分泌包括神经营养因子在内的多种营养因子，而单个核细胞也可以分泌许多细胞因子，以影响周围细胞。
细胞移植治疗机制：①再生与分化机制。移植细胞通过归巢到受损区域分化成相应的神经元、少突胶质细胞或星形胶质细胞，骨髓间充质干细胞因其具备干细胞特性而比骨髓单个核细胞具有更强的分化潜能；②旁分泌机制。移植细胞可以分泌多种细胞因子，比如神经营养因子、抗炎因子、血管新生因子等，骨髓间充质干细胞较骨髓单个核细胞具有更强的分泌能力；③免疫调节机制。间充质干细胞能够参与调节人体免疫系统而抑制异常免疫反应；以上机制也部分解释了为什么骨髓间充质干细胞较骨髓单个核细胞对脑瘫患儿具有更好的治疗作用。

摘要
背景：骨髓间充质干细胞和骨髓单个核细胞都可以治疗脑性瘫痪。然而，这两者的疗效差异仍不清楚。
目的：对比骨髓间充质干细胞以及骨髓单个核细胞对于脑性瘫痪患儿粗大及精细运动功能的治疗作用。
方法：招募105例脑性瘫痪患儿并随机分配成3组：骨髓间充质干细胞组、骨髓单个核细胞组以及对照组。骨髓间充质干细胞组和骨髓单个核细胞组患儿均接受4次腰椎穿刺细胞移植，对照组采用Bobath法进行治疗，2 d治疗1次，持续3周。在治疗3，6，12个月后使用粗大运动量表和精细运动量表对各组患儿的粗大运动和精细运动功能进行量化评价。
结果与结论：①移植治疗后3个月，骨髓间充质干细胞组GMFM评分A功能区和FMFM评分A、C功能区得分均优于骨髓单个核细胞组和对照组(P < 0.05)；②移植治疗后6个月，骨髓间充质干细胞组GMFM评分A、B功能区得分及总分，FMFM评分A、B、C、D、E功能区得分及总分均优于骨髓单个核细胞组和对照组(P < 0.05)；③移植治疗后12个月，骨髓间充质干细胞组GMFM评分A、B、C功能区得分及总分，FMFM评分A、B、C、D、E功能区得分及总分均优于其他两组(P < 0.05)；④骨髓单个核细胞组和骨髓间充质干细胞组患儿分别有6例出现低颅压性头痛、6例出现低热；⑤结果表明，骨髓间充质干细胞和骨髓单个核细胞移植治疗小儿脑性瘫痪安全、有效、可行，骨髓间充质干细胞相较骨髓单个核细胞及康复治疗，无论在粗大运动还是精细运动功能方面都有显著优势。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-6572-3830(代广辉)

关键词: 干细胞, 移植, 脑性瘫痪, 骨髓间充质干细胞, 骨髓单个核细胞, GMFM评分, FMFM评分

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) and bone marrow mononuclear cells(BMMNCs) have been both used to treat spastic cerebral palsy. However, the differences in their therapeutic effects remain unknown.
OBJECTIVE: To compare the therapeutic effects of BMMSCs and BMMNCs in cerebral palsy children as well as on fine motor function.
METHODS: 105 children with spastic cerebral palsy were enrolled and randomly assigned to three groups: BMMSCs group, BMMNCs group and control group. Patients in the two transplantation groups received four intrathecal cell injections, and those in the control group received Bobath therapy, twice a day, for consecutive 3 weeks. The Gross Motor Function Measure (GMFM) and Fine Motor Function Measure (FMFM) were used to evaluate the therapeutic efficacy at 3, 6 and 12 months after transplantation.
RESULTS AND CONCLUSION: At 3 months after cell transplantation, scores in A dimension of GMFM and in A, C dimensions of FMFM in BMMSC group were all superior to those of BMMNC group and control group (P < 0.05). At 6 months after cell transplantation, scores in A, B dimensions of GMFM and in A, B, C, D and E dimensions of FMFM in BMMSC group were better than those of BMMNC group and control group (P < 0.05), and total scores of GMFM and FMFM were also better in the BMMSC group (P < 0.05). At 12 months after cell transplantation, scores in A, B and C dimensions of GMFM and A, B, C, D and E dimensions of FMFM scores in BMMSC group were all superior to those of BMMNC group and control group (P < 0.05) as well as the total GMFM and FMFM scores. There were six cases of low intracranial pressure headache in BMMNC group and six cases of low-grade fever in BMMSC group. In summary, both BMMSCs transplantation and BMMNCs transplantation are safe, effective and feasible for the treatment of spastic cerebral palsy in children, and moreover, BMMSCs transplantation is a better method than BMMNCs transplantation to improve gross and fine motor functions of spastic cerebral palsy children.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Cerebral Palsy, Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Cell Transplantation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

代广辉，刘学彬，张赞，程洪彬，王晓东，安沂华. 骨髓间充质干细胞与骨髓单个核细胞治疗脑性瘫痪的疗效比较[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(1): 70-76.

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图/表（结果） 4

2.1 参与者数量分析 自体BMMSC组有2例患儿、自体BMMNC组有1例患儿因家属放弃此次试验性治疗而被排除，即BMMSC组最终33例患儿(男18例，女15例)进入结果分析，而BMMNC组有34例患儿(男18例，女16例)进入结果分析。

2.2 各组的一般情况、GMFM评分及FMFM评分结果 见表1-3。BMMSC组、BMMNC组、对照组的基线(GMFM及其各功能区、FMFM及其各功能区)差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.3 患者入组流程图 见图1。

2.4 BMMSC组脑瘫患儿细胞移植治疗前后粗大运动功能的变化 见表4。治疗后3个月GMFM评分与移植前相比，A、B、C功能区得分均有显著改善(P < 0.05或P < 0.01)；GMFM总分也有明显提高(P < 0.01)；D、E功能区评分较移植前有所提高，但差异无显著性意义(P > 0.05)。治疗后6个月GMFM评分与移植前相比，A、B、C、D功能区得分有显著改善(P < 0.05或P < 0.01)；GMFM总分也显著提高(P < 0.05)；E区评分与移植前比较无显著变化(P > 0.05)。治疗后12个月GMFM评分与移植前相比，A、B、C、D、E功能区得分有显著改善(P < 0.05或P < 0.01)；GMFM总分也显著提高(P < 0.01)。

2.5 BMMNC组脑瘫患儿细胞移植治疗后粗大运动功能的变化 见表5。治疗后3个月GMFM评分与移植前相比，A、B、C功能区得分有显著改善(P < 0.05)；GMFM总分也有明显提高(P < 0.01)；D、E功能区评分较移植前有所提高，但差异无显著性意义(P > 0.05)。治疗后6个月GMFM评分与移植前相比，A、B、C功能区得分有显著改善(P < 0.05)；GMFM总分也显著提高(P < 0.05)；D、E功能区评分与移植前比较无显著变化(P > 0.05)。治疗后12个月GMFM评分与移植前相比，A、B、C功能区得分有显著改善(P < 0.05)；GMFM总分也显著提高(P < 0.01)。

对照组脑瘫患儿治疗后粗大运动功能的变化见表6。治疗后3个月GMFM评分与治疗前相比，A、B、C、D、E功能区得分、GMFM总分较康复治疗前有所提高，但差异无显著性意义(P > 0.05)。治疗后6个月GMFM评分与康复治疗前相比，A、B、C、D、E功能区得分、GMFM总分较康复治疗前有所提高，但差异无显著性意义(P > 0.05)。治疗后12个月GMFM评分与康复治疗前相比，A、B、C功能区得分有显著改善(P < 0.05)；GMFM总分也显著提高(P < 0.01)。D、E功能区得分提高差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.7 各组、各时间段GMFM评分对比 各组治疗后3个月，BMMSC组A功能区得分他两组比较差异有显著性意义 (P < 0.05)，BMMNC组和对照组之间差异无显著性意义(P > 0.05)；C功能区得分MSC组和BMMNC组、BMMNC组和对照组之间差异无显著性意义(P > 0.05)，BMMSC组和对照组之间差异有显著性意义(P < 0.05)；B、D、E功能区得分及GMFM总分各组之间差异无显著性意义(P > 0.05)。

各组治疗后6个月，BMMSC组A、B功能区得分MFM总分和其他两组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，BMMNC组和对照组之间差异无显著性意义(P > 0.05)；C功能区得分BMMSC组和BMMNC组、BMMNC组和对照组之间差异无显著性意义(P > 0.05)，BMMSC组和对照组之间差异有显著性意义(P < 0.05)；D、E功能区得分各组之间差异无显著性意义(P > 0.05)。

各组治疗后12个月，BMMSC组A、B、C功能区得分及GMFM总分和其他两组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，BMMNC组和对照组之间差异无显著性意义(P > 0.05)；D、E功能区得分各组之间差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.8 BMMSC组脑瘫患儿细胞移植治疗前后的精细运动功能的变化 见表7。细胞移植治疗后3个月FMFM评分与移植前相比，A、B、C、D功能区得分有显著改善(P < 0.05或P < 0.01)；FMFM总分也有显著改善(P < 0.01)；E功能区评分较移植前有所提高，但差异无显著性意义(P > 0.05)。治疗后6个月FMFM评分与移植前相比，A、B、C、D、E功能区得分有显著改善(P < 0.05或P < 0.01)；GMFM总分也显著提高(P < 0.01)；治疗后12个月FMFM评分与移植前相比，A、B、C、D、E功能区得分有显著改善(P < 0.05或P < 0.01)；FMFM总分也显著提高(P < 0.01)。

2.9 BMMNC组脑瘫患儿细胞移植治疗前后的精细运动功能的变化 见表8。细胞移植治疗后3个月FMFM评分与移植前相比，A功能区得分有显著改善(P < 0.05)；B、C、D、E功能区得分，FMFM总分较移植前有所提高，但差异无显著性意义(P > 0.05)。治疗后6个月FMFM评分与移植前相比，A、B、C、D、E功能区得分有显著改善(P < 0.05)；FMFM总分也显著提高(P < 0.05)；治疗后12个月FMFM评分与移植前相比，A、B、C、D、E功能区得分有显著改善(P < 0.05)；FMFM总分也显著提高(P < 0.01)。

2.10 对照组脑瘫患儿治疗前后的精细运动功能的变化 见表9。治疗后3个月FMFM评分与治疗前相比，A功能区得分有显著改善(P < 0.05)；B、C、D、E功能区得分，FMFM总分较治疗前有所提高，但差异无显著性意义(P > 0.05)。治疗后6个月FMFM评分与治疗前相比，A功能区得分有显著改善(P < 0.05)；B、C、D、E功能区得分，FMFM总分较治疗前有所提高，但差异无显著性意义(P > 0.05)；治疗后12个月FMFM评分与治疗前相比，A功能区得分、FMFM总分有显著改善(P < 0.05)。

2.11 各组、各时间段FMFM评分对比 各组治疗后3个月，BMMSC组A、C功能区得分和其他两组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，BMMNC组和对照组之间差异无显著性意义(P > 0.05)；B、D、E功能区得分及GMFM总分各组之间差异无显著性意义(P > 0.05)。

各组治疗后6个月，BMMSC组A、B、C、D、E功能区得分及GMFM总分和其他两组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，BMMNC组和对照组之间差异无显著性意义(P > 0.05)。

各组治疗后12个月，BMMSC组A、B、C、D、E功能区得分及GMFM总分和其他两组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，BMMNC组和对照组之间差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.12 不良反应 ①头晕头痛：BMMNC组有6例(6/33)患儿、BMMSC组中有6例(6/34)患儿术后48 h内出现低颅压反应，表现为轻度头晕头痛，偶伴恶心、呕吐，呕吐呈非喷射性。上述症状下床活动后加重，平卧时症状缓解或消失。嘱这些患者采取去枕平卧位、静脉点滴生理盐水后症状缓解和消失；②发热：BMMNC组有6例(6/33)患儿、BMMSC组中有6例(6/34)患儿在术后出现了发热，均在38.5 ℃以下，无需处理，均在数小时内下降至正常。

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引言

材料方法

1.1 设计 随机、平行、双盲法对照研究。经武装警察部队总医院医学伦理委员会批准，已于中国临床试验注册中心注册(世界组织(WHO)国际临床试验注册平台一级注册机构)，注册号(CHiCTR-TRC-12002568)。患儿家属签订知情同意书，并了解此研究的目的、意义、可能的收益以及存在的不良反应风险(如疼痛、发热、感染、运动功能的恶化以及其他无法预知的不良反应及其补救措施)。

1.2 时间及地点 2010年5月至2013年10月在武警总医院功能神经外科完成。

1.3 对象 招募2010年10月1日至2013年10月1日期间在武警总医院功能神经外科就诊的105例脑瘫患儿。所有患儿按照1︰1︰1的比例被随机分到BMMSC组、BMMNC组和对照组，随机化表格由SAS软件产生。BMMSC组35例，其中男19例，女16例，平均月龄为(49.55±31.95)(6-132)个月；BMMNC组35例，其中男20例，女15例，平均月龄为(49.10±29.39)(10-150)个月。对照组35例，其中男19例，女16例，平均月龄为(43.66±1.31)(7-140)个月。GMFCS量表用来对患儿脑瘫的严重程度进行评价，所有患儿的GMFCS评级为Ⅱ-Ⅴ级。在随机化后研究过程中，对BMMSC组患者、BMMNC组患者、手术者及手术参与者、协调员等进行盲法干预，使其不知道分组情况。设置调查员进行患者的分配情况。

纳入标准：①7个月-11岁确诊为脑瘫的患儿：②GMFCS评分Ⅱ-Ⅴ级；③入组前3个月内及治疗期间(细胞移植组)无其他相关治疗干扰，如康复训练、神经营养药物、中医、手术等；④家长自愿接受细胞移植治疗并同意配合随访。

剔除标准：①有严重的过敏病史或自身免疫性疾病；②有难治性惊厥病史；③AIDS、肝炎、梅毒血清学检查阳性；④患有神经系统遗传代谢性疾病；⑤有肿瘤和/或血液病病史；⑥其他严重的疾病，如脑瘤、精神心理疾病等。

1.4 方法

1.4.1 BMMNC的制备 家长签署知情同意书。患儿入手术室，取左侧卧位定位右髂后上嵴。常规碘酒乙醇消毒，利多卡因局麻下，骨穿针垂直刺入，穿过骨皮质进入骨髓腔。20 mL注射器先抽肝素盐水(100 U/mL)5 mL，接骨穿针后抽取骨髓血约15 mL，总量约20 mL。混匀后，严格无菌条件下迅速送至细胞室。20 mL稀释的骨髓加入到添加有15 mL Ficoll-Paque的50 mL离心管中，并根据手册指示进行离心，1 000 r/min离心5 min，收集单个核细胞并用生理盐水冲洗2次。

1.4.2 BMMSC的制备^[8] 取得BMMNC后用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液重悬细胞，以(2-4)×10⁶/cm²接种于培养瓶中，在37 ℃，体积分数为5%CO₂和体积分数为95%空气的培养箱中培养，每3-5 d更换1次培养基。经过10 d的培养，贴壁细胞用胰酶消化并在新的培养瓶中进一步扩增。获取第3代BMMSC进行冷冻，并使用流式细胞仪进行鉴定。结果证实CD105、CD73、CD44表达≥95%，而CD45、CD34、CD31、CD146和HLA-DR表达则低于2%。在进行细胞移植前1周，冻存的BMMSC进行解冻并进一步传代扩增。第4-6代细胞用于细胞移植。

1.4.3 细胞移植^[11] 常规检查排除手术禁忌证后，局部麻醉下定位于L₃_-₄或L₄_-₅椎间隙行腰椎穿刺术，确认穿刺针进入蛛网膜下腔后，将1.0-2.0 mL细胞混悬液(含1×10⁷个细胞)缓慢注入蛛网膜下腔。每隔5-7 d移植1次，连续行4次腰椎穿刺细胞移植术为1个疗程。共治疗1个疗程。

1.4.4 对照组治疗方式 对照组患儿采用Bobath治疗法(neuro-developmental treatment，NDT)进行治疗。治疗方式和Knox等^[12]所报道的一致，具体如下：①反射抑制法；②调整关键身体部位；③促进姿势反射，诱发患儿的最大身体潜能，形成功能性活动的运动姿势，并促进学习和理解；④拍击法。对照组患者每2 d接受1次治疗，持续3周为1个疗程，共治疗1个疗程。该治疗过程均由2名经验丰富的康复医师进行。

1.4.5 疗效评价 粗大运动功能评分(the gross motor function measure, GMFM)和精细运动功能评分(fine motor function measure, FMFM)被用作细胞治疗疗效的评价工具。所有患者在治疗前、治疗后1，3，12个月进行随访。所有的量化评价均由两位专业的康复训练师进行。

GMFM评分内容：GMFM评分一共包括5个功能区，各功能区代表功能及分数：A区：卧位与翻身，17项，共51分；B区：坐位，20项，共60分；C区：爬行与跪，14项，共42分；D区：站立位，13项，共39分；E区：行走与跑跳，24项，共72分。

FMFM评分内容：FMFM评分一共包括5个功能区，各功能区代表功能及分数：A区：视觉运动，7项，共21分；B区：上肢关节运动能力，8项，共24分；C区：抓握能力，8项，共24分；D区：操作能力，10项，共30分；E区：手眼协调能力，12项，共36分。

1.5 主要观察指标 治疗前及治疗后患儿GMFM评分以及FMFM评分。

1.6 统计学分析 计量资料以x(_)±s表示，3组之间数据比较采用SNK法(Student-Newman-Keuls，SNK)分析。P < 0.05为差异有显著性意义。所有统计学分析均采用SPSS 16.0软件(Version 16.0 for Windows，SPSS，Chicago，IL)进行。

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讨论

脑瘫是一系列影响到运动神经生长，并以永久性、不可逆的活动受限为特点的运动功能失调性疾病，严重影响运动功能和姿势的发育。因其发病病因的复杂性和不可逆性，脑瘫的治疗一直都是国际上神经系统疾病的一个巨大的挑战^[13]。近年来，随着细胞技术的发展，多项临床研究表明干细胞移植在治疗脑外伤^[11]、脑出血^[14]、脑卒中^[15]、脊髓损伤^[16]、共济失调等多种神经系统疾病是安全有效的^[17-18]，这些令人鼓舞的结果为细胞治疗脑瘫开辟了新的领域。另外，儿童时期大脑神经的可塑性是最强的，同样为细胞治疗脑瘫提供了良好的契机^[19]。相继有研究使用脐带间充质干细胞^[10]、胚胎干细胞^[6]、脐血干细胞^[5]、骨髓间充质干细胞以及骨髓单个核细胞等用于脑瘫的临床研究^[4^，^20]，并均取得了一定的效果。其中，自体BMMSC和BMMNC由于易于采集，免于排斥反应和无伦理道德限制而广泛用于治疗多种神经系统疾病。两种细胞采集来源一致，培养方式不同，试验对自体BMMSC和自体BMMNC对脑瘫治疗效果进行对比分析，从而指导以后免于重复治疗。

实验结果表明，在粗大运动方面，BMMSC组和BMMNC组患儿细胞移植治疗后3个月便有显著的进步(A、B、C功能区得分和GMFM总分)，这和Sharma等^[4]采用BMMNC以及Chen等^[21]采用自体骨髓来源的神经干细胞样细胞治疗脑瘫所获得的显效时间一致。治疗6个月后，BMMSC移植组A、B功能区得分及GMFM总分均好于其他两组，而BMMNC组和对照组之间差异无显著性意义；治疗12个月后，BMMSC组A、B、C功能区得分及GMFM总分均好于其他两组。以上结果表明，在粗大运动方面，自体BMMSC和BMMNC移植后3个月均可以显著提高患儿的粗大运动功能，且优于对照组；然而，随着时间的延长，BMMSC对粗大运动功能的改善，特别在A、B、C功能区得分及GMFM总分方面，相较BMMNC具有更强的持续性，而BMMNC在移植后6个月和12个月与对照组比较对粗大运动的改善没有差别，也说明了BMMNC对粗大运动改善的持续作用差。在精细运动改善方面，自治疗后6个月，FMFM各功能区得分以及总分方面，BMMSC组均优于BMMNC和对照组，进一步证明了BMMSC对脑瘫患儿运动改善方面的持续性优于BMMNC。

GMFM功能表中D、E功能区的疗效无显著性意义，造成这一现象的原因，作者分析有以下几种可能：①从A区到E区，完成相应动作所需要的肌肉力量和协调性是逐渐增加的，因而患儿的改善也是从A区逐渐扩大到E区；②由于许多入组患者年龄较小，本身就无法完成D区和E区的功能，从而造成D、E两个区的神经功能评分在移植前后的变化无统计学差异。这有待于下一步的相关研究得以证实。

对于细胞移植的治疗机制研究大多通过动物实验获得，主要有以下3种机制至关重要：①再生与分化机制。移植细胞通过归巢到受损区域分化成相应的神经元、少突胶质细胞或星形胶质细胞^[22-24]，BMMSC因其具备干细胞特性而比BMMNC具有更强的分化潜能；②旁分泌机制。移植细胞可以分泌多种细胞因子，比如神经营养因子、抗炎因子、血管新生因子等^[25-27]，BMMSC较BMMNC具有更强的分泌能力；③免疫调节机制。间充质干细胞能够参与调节人体免疫系统而抑制异常免疫反应^[28-29]；以上机制也部分解释了为什么BMMSC较BMMNC对脑瘫患儿具有更好的治疗作用。

BMMSC和BMMNC虽然都为骨髓来源，但是其在细胞类型、分化程度、分泌的相关细胞因子等方面均有较大差异。首先，间充质干细胞为多能干细胞，具有较强的分化能力，可以分化成多种类型的成熟细胞，而骨髓单个核细胞为成熟的细胞。其次，间充质干细胞可以分泌包括神经营养因子在内的多种营养因子，而单个核细胞也可以分泌许多细胞因子，以影响周围细胞。间充质干细胞从细胞的分化、外分泌的因子类型和数量等多方面均强于单个核细胞，这也从一个方面解释了此次研究结果的差异性^[30-31]。

许多临床研究报道了BMMSC和BMMNC的治疗作用没有伴随相关严重的并发症出现^[31-32]，本研究中所有细胞移植组患儿除了低热和低颅压外，也未出现严重的不良反应，与其他临床研究一致。患儿接受BMMSC以及BMMNC均不会发生较严重不良反应。接受自体BMMSC移植中有6例发生了轻微的发热症状，BMMNC组中有6例发生发热反应。同样低颅压症状的出现与腰穿手术有关，而与细胞无关。

总之，BMMSC移植能够显著改善脑瘫患儿的粗大运动功能得分和精细运动功能，且相较BMMNC以及康复治疗，无论在粗大运动还是精细运动功能方面都有显著提高。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程