骨髓间充质干细胞与血管内皮生长因子165基因转染人脐静脉内皮细胞共移植促进缺血皮瓣血管的生成

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0409

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (1): 46-52.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0409

• 干细胞移植 stem cell transplantation • 上一篇下一篇

骨髓间充质干细胞与血管内皮生长因子165基因转染人脐静脉内皮细胞共移植促进缺血皮瓣血管的生成

先德彬，明华伟，徐荣胜，夏德林

西南医科大学附属口腔医院口腔颌面外科，四川省泸州市 646000

修回日期:2017-08-09 出版日期:2018-01-08 发布日期:2018-01-08
通讯作者: 夏德林，博士，教授，西南医科大学附属口腔医院口腔颌面外科，四川省泸州市 646000
作者简介:先德彬，男，1990年生，四川省泸州市人，汉族，在读硕士，主要从事口腔颌面部疾病的诊断与治疗。

Promoting angiogenesis by con-transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells and human umbilical vein endothelial cells transfected with vascular endothelial growth factor 165 gene

Xian De-bin, Ming Hua-wei, Xu Rong-sheng, Xia De-lin

Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Affiliated Stomatological Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China

Revised:2017-08-09 Online:2018-01-08 Published:2018-01-08
Contact: Xia De-lin, M.D., Professor, Chief physician, Master’s supervisor, Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Affiliated Stomatological Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
About author:Xian De-bin, Studying for master’s degree, Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Affiliated Stomatological Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
血管内皮生长因子：是特异作用于血管内皮细胞的一类糖蛋白，以同源二聚体的形式存在，具有强烈的促内皮细胞增殖作用，促进新血管的形成，血管内皮生长因子被认为是特异性最高的一种促血管化生长因子，其中血管内皮生长因子165是分泌型可溶性蛋白，能直接作用于血管内皮细胞促进血管内皮细胞增殖，增加血管通透性，是目前研究血管生成的热点因子。
组织工程骨：是指将分离的自体高浓度成骨细胞、骨髓基质干细胞或软骨细胞等，经体外培养扩增后种植于一种天然或人工合成的、具有良好生物相容性、可被人体逐步降解吸收的细胞支架或细胞外基质上，这种生物材料支架可为细胞提供生存的三维空间，有利于细胞获得足够的营养物质，进行气体交换，排除废料，使细胞在预制形态的三维支架上生长，然后将这种细胞杂化材料植入骨缺损部位，在生物材料逐步降解的同时，种植的骨细胞不断增殖，从而达到修复骨组织缺损的目的。

摘要
背景：如何促进大块组织工程骨早期血管化是目前研究的热点。通过细胞共培养以及添加生物活性因子来促进血管生成均是很好地促进早期血管化的方法。
目的：探讨骨髓间充质干细胞与血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor，VEGF165)基因转染的人脐静脉内皮细胞共移植在体内促进血管生成的能力，为构建血管化组织工程骨修复大段骨缺损提供理论依据和实验基础。
方法：50只SD大鼠完全随机分入5组，每组10只，于SD大鼠背部中线上建立一个4 cm×1.5 cm大小的缺血皮瓣模型，分别移植骨髓间充质干细胞与VEGF165基因转染的人脐静脉内皮细胞(A组)、单独转染VEGF165基因的人脐静脉内皮细胞(B组)、骨髓间充质干细胞与未转染VEGF165基因的人脐静脉内皮细胞(C组)、未转染VEGF165基因的人脐静脉内皮细胞(D组)、DMEM培养基(E组)。ELISA检测外周血VEGF水平，组织学观察其皮瓣存活状况及微血管密度。
结果与结论：①术后A组皮瓣存活质量较其他4组高；②A组、B组术后第2，4，7，14天外周血中的VEGF持续高表达且逐渐升高，第7天时达到峰值，第14天时较术后第2天明显下降。不同时期A组外周血中VEGF水平明显高于其他4组，差异有显著性意义(P < 0.05)；③术后第11天，A组皮瓣存活率高于其他4组，差异有显著性意义(P < 0.05)；④术后第11天，A组微血管密度远远大于其他4组，差异有显著性意意义(P < 0.05)；⑤结果表明，骨髓间充质干细胞与VEGF165基因转染人脐静脉内皮细胞共移植可促进缺血皮瓣血管化，提高缺血皮瓣存活率。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-7218-6084(先德彬)

关键词: 血管内皮生长因子165, 骨髓基质干细胞, 脐静脉内皮细胞, 基因转染, 血管生成, 缺血皮瓣, 组织工程骨, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: How to promote the early vascularization of large tissue-engineered bone has become the hotspot of current research. Cell co-culture and the addition of bioactive factors to promote angiogenesis are very good methods to promote early vascularization.
OBJECTIVE: To explore the ability of angiogenesis by co-transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) and human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) which were transfected with vascular endothelial growth factor 165 (VEGF165) gene in vivo, to move forward a single step to offer theoretical basis and experimental basis to build vascularized tissue-engineered bone which can be used to repair large segmental bone defects.
METHODS: We built an ischemic skin flap with 4 cm×1.5 cm in the back of Sprague-Dawley rats, and then BMSCs+VEGF165-transfected HUVECs (group A), VEGF165-transfected HUVECs (group B), BMSCs+non-transfected HUVECs (group C), non-transfected HUVECs (group D), DMEM (group E) were respectively transplanted. ELISA method was used to detect peripheral blood VEGF level. Histologically, survival and microvessel density of the flap were observed.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The flap survival quality of group A was better than that in the other groups. VEGF exhibited high expression continuously high expression at 2, 4, 7, 14 days after transplantation, and reached the peak at 7 days, but the expression level at 14 days was obviously lower than that at 2 days postoperatively. The VEGF level of group always exceeded that in group B at different time points (P < 0.05). The flap survival rate and microvessel density of group A was significantly higher than that in the other groups at 11 days postoperatively (both P < 0.05). In summary, co-transplantation of BMSCs and VEGF165-transfected HUVECs can promote survival of an ischemic flap in vivo through pro-angiogenic actions.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Umbilical Veins, Endothelial Cells, Vascular Endothelial Growth Factors, Transfection, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

先德彬，明华伟，徐荣胜，夏德林. 骨髓间充质干细胞与血管内皮生长因子165基因转染人脐静脉内皮细胞共移植促进缺血皮瓣血管的生成[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(1): 46-52.

Xian De-bin, Ming Hua-wei, Xu Rong-sheng, Xia De-lin. Promoting angiogenesis by con-transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells and human umbilical vein endothelial cells transfected with vascular endothelial growth factor 165 gene[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(1): 46-52.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析 50只SD大鼠均进入结果分析，中途无脱落。

2.2 大体观察结果 见图3。

术后第1天：移植细胞4组大鼠背部缺血皮瓣水肿范围较空白对照组小，水肿程度也较空白对照组轻，各组皮瓣均未出现花斑状瘀斑。

术后第2天：各组大鼠背部皮瓣开始出现花斑状瘀斑，而移植细胞4组瘀斑明显少于空白对照组。

术后第3天：各组大鼠背部缺血皮瓣远蒂端开始发暗变黑，移植细胞4组变黑面积较空白对照组小。

术后第4天至第7天：各组大鼠皮瓣发暗变黑部位开始变硬并逐渐收缩，开始转变为黑色硬痂壳。少部分缝线出现松动、脱落现象，空白对照组4只大鼠切口裂开，伤口周围红肿。

术后第8天至第11天：各组皮瓣存活区域与坏死区域已明显分界，存活区域皮瓣毛发生长旺盛，去除毛发后见皮肤红润，质地柔软无收缩。坏死区域皮肤毛发停止生长，色泽变暗变黑、皮肤明显皱缩、质地较硬、弹性极差、切割组织后不出血。处死大鼠后取材时发现空白对照组有3只大鼠皮瓣基底部积液(暗红色血性液体)，移植细胞4组皮瓣基底部未见积液；BMSCs+VEGF165-HUVEC组皮瓣成活质量明显较其他组高。

2.3 皮瓣存活率 术后第11天，各组大鼠背部皮瓣存活率分别为：BMSCs+VEGF165-HUVEC组(86.4±5.5)%，VEGF165-HUVEC组(62.5±4.7)%，BMSCs+HUVEC组(52.3±4.2)%，HUVEC组(45.8±3.6)%，空白对照组(32.4±1.7)%。除VEGF165-HUVEC组和BMSCs+HUVEC组差异无显著性意义，其余各组之间比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4，5。

2.4 皮瓣术后各组大鼠外周血血清中VEGF蛋白表达水平 BMSCs+VEGF165-HUVEC组、VEGF165-HUVEC组大鼠术后第2，4，7，14天外周血中VEGF持续高表达且逐渐升高，第7天时达到峰值，第14天时较术后第2天明显下降。不同时期BMSCs+VEGF165-HUVEC组外周血中VEGF水平明显高于VEGF165-HUVEC组，差异有显著性意义(P < 0.05)。BMSCs+HUVEC组、HUVEC组、空白对照组各个时期血清中VEGF水平无明显变化，差异无显著性意义(P > 0.05)。不同时期BMSCs+VEGF165-HUVEC组外周血中VEGF水平明显高于BMSCs+HUVEC组、HUVEC组、空白对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1，图6。

2.5 组织学检测结果 术后第11天，各组大鼠皮瓣组织苏木精-伊红染色及内皮细胞CD31免疫组织化学染色见图7，8。5组微血管密度计数(条/mm²)分别为：BMSCs+ VEGF165-HUVEC组63.4±5.7，VEGF165-HUVEC组56.2± 5.2，BMSCs+HUVEC组42.5±3.4，HUVEC组28.3±2.8，空白对照组19.7±1.3。BMSCs+ VEGF165-HUVEC组、BMSCs+HUVEC组、HUVEC组、空白对照组微血管密度计数比较差异有显著性意义(P < 0.05)；BMSCs+ VEGF165-HUVEC组、VEGF165- HUVEC组、HUVEC组、空白对照组微血管密度计数比较，差异有显著性意义(P < 0.05)。BMSCs+VEGF 165-HUVEC组中毛细血管密度远大于其他4组。

参考文献

[1] Schindeler A, McDonald MM, Bokko P, et al. Bone remodeling during fracture repair: The cellular picture. Semin Cell Dev Biol. 2008;19(5): 459-466.

[2] Carmeliet P, Jain RK. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature. 200;407(6801):249-257.

[3] Lee SH, Coger RN, Clemens MG. Antioxidant functionality in hepatocytes using the enhanced collagen extracellular matrix under different oxygen tensions. Tissue Eng. 2006;12(10):2825-2834.

[4] Kneser U, Stangenberg L, Ohnolz J, et al. Evaluation of processed bovine cancellous bone matrix seeded with syngenic osteoblasts in a critical size calvarial defect rat model. J Cell Mol Med. 2006;10(3): 695-707.

[5] Zelzer E, Olsen BR. Multiple roles of vascular endothelial growth factor (VEGF) in skeletal development, growth, and repair. Curr Top Dev Biol. 2005;65:169-187.

[6] Unger RE, Sartoris A, Peters K, et al. Tissue-like self-assembly in cocultures of endothelial cells and osteoblasts and the formation of microcapillary-like structures on three-dimensional porous biomaterials. Biomaterials. 2007;28(27):3965-3976.

[7] 李彪.VEGF 165基因修饰HUVECs复合BMSCs促组织工程骨血管生成的体外实验研究[D].泸州:四川医科大学,2015:1-59.

[8] Kubota Y, Kishi K, Satoh H, et al. Transplanted endothelial progenitor cells augment the survival areas of rat dorsal flaps. Cell Transplant. 2003;12(6):647-657.

[9] Devine SM. Mesenchymal stem cells: will they have a role in the clinic. J Cell Biochem Suppl. 2002;38:73-9.

[10] Minguell JJ, Conget P, Erices A. Biology and clinical utilization of mesenchymal progenitor cells. Braz J Med Biol Res. 2000;33(8): 881-887.

[11] 冯祥生,潘银根,谭家驹,等.异种(猪)脱细胞真皮与自体表皮复合移植研究[J].中华整形外科杂志,2000,16(1):41-43,69.

[12] Ryan JW, Ryan US. Endothelial surface enzymes and the dynamic processing of plasma substrates. Int Rev Exp Pathol. 1984;26:1-43.

[13] Grellier M, Ferreira-Tojais N, Bourget C, et al. Role of vascular endothelial growth factor in the communication between human osteoprogenitors and endothelial cells. J Cell Biochem. 2009;106(3): 390-398.

[14] Guillotin B, Bareille R, Bourget C, et al. Interaction between human umbilical vein endothelial cells and human osteoprogenitors triggers pleiotropic effect that may support osteoblastic function. Bone. 2008; 42(6):1080-1091.

[15] Li H, Daculsi R, Grellier M, et al. Role of neural-cadherin in early osteoblastic differentiation of human bone marrow stromal cells cocultured with human umbilical vein endothelial cells. Am J Physiol Cell Physiol. 2010;299(2):C422-430.

[16] Villars F, Bordenave L, Bareille R, et al. Effect of human endothelial cells on human bone marrow stromal cell phenotype: role of VEGF. J Cell Biochem. 2000;79(4):672-685.

[17] Grellier M, Bordenave L, Amédée J. Cell-to-cell communication between osteogenic and endothelial lineages: implications for tissue engineering. Trends Biotechnol. 2009;27(10):562-571.

[18] Grellier M, Granja PL, Fricain JC, et al. The effect of the co-immobilization of human osteoprogenitors and endothelial cells within alginate microspheres on mineralization in a bone defect. Biomaterials. 2009;30(19):3271-3278.

[19] Kaigler D, Krebsbach PH, Polverini PJ, et al. Role of vascular endothelial growth factor in bone marrow stromal cell modulation of endothelial cells. Tissue Eng. 2003;9(1):95-103.

[20] Kaigler D, Krebsbach PH, West ER, et al. Endothelial cell modulation of bone marrow stromal cell osteogenic potential. FASEB J. 2005; 19(6):665-667.

[21] Xu J, Liu X, Chen J, et al. Cell-cell interaction promotes rat marrow stromal cell differentiation into endothelial cell via activation of TACE/TNF-alpha signaling. Cell Transplant. 2010;19(1):43-53.

引言

由于炎症、肿瘤、创伤及先天畸形等因素所致的大型颌骨缺损目前仍是临床诊治的难点。缺损不但造成患者咀嚼、呼吸、吞咽、语音等功能障碍，而且面部支撑结构丧失导致容貌毁损严重影响了患者的生活质量。现代修复重建外科要求在功能重建的同时尽最大可能地恢复外形，功能与外形并重。组织工程骨移植是目前国内外研究如何修复骨缺损的热点^[1]，但是临床应用时却发现效果并不理想，主要原因是组织工程骨中心部位不能及时实现早期血管化，继而发生缺血坏死导致修复失败。研究表明，体内组织生长厚度大于100-200 μm就超过了氧气在体内扩散的极限距离，此时需新生血管来为其供给氧气及营养物质^[2]，组织工程骨组织在体内同样遵循此原则。组织工程骨移植入体内后，其早期营养主要来源于组织液的渗透以及血液的融附，若单凭周围渗透的组织液只能营养100 μm以内的种子细胞^[3]。复合在材料中央的种子细胞供血和供氧受到限制，其增殖、分泌以及分化等生理功能将受到影响甚至死亡，导致组织工程骨移植修复失败^[4]。体外构建血管化组织工程骨修复材料为临床大段骨缺损的修复重建提供了一种新的选择，而细胞因子及种子细胞是构建血管化组织工程骨必不可少的两个重要因素。

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是Senger等在1983年首先发现的一种蛋白质，是从肿瘤细胞中发现的一种能使小静脉对血液中大分子物质通透性增高的血管通透因子。在所有的生长因子中，VEGF被认为是作用最直接、特异性最高的一种促血管化生长因子^[5]。

以往认为成骨细胞与内皮细胞共培养是组织工程骨共培养经典模式之一^[6]。然而体外培养血管内皮细胞的要求较高，且成骨细胞与血管内皮细胞均为终末分化细胞，它们的增殖能力有限。因此，越来越多的研究者将目光转向人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)与骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)的共培养模式。课题组前期体外实验已经证实：以Ad-GFP缺陷性腺病毒为载体将VEGF165基因转染至HUVEC后将其与BMSCs体外共培养，细胞增殖、迁移、成血管能力比未转染基因共培养组强^[7]。

实验制备大鼠背部缺血皮瓣动物模型，将BMSCs与VEGF165基因转染的HUVEC共移植至缺血皮瓣局部，观察二者在体内的促血管生成能力，为构建血管化组织工程骨用于体内修复大段骨缺损提供理论依据和实验基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 完全随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年6月至2017年1月在西南医科大学口腔颌面再生与修复研究实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 健康清洁级雌性SD大鼠50只，6-8周龄，体质量180-200 g。适应性饲养约2周，室温控制在26 ℃左右，称质量符合实验标准后进入手术准备阶段。所有大鼠在同样条件下以相同的标准全价饲料喂养，每日换水、加料。所有实验动物由西南医科大学实验动物中心提供。健康清洁级雌性SD大鼠2只，5周龄，体质量约100 g，用于原代培养骨髓间充质干细胞。

1.3.2 实验用主要试剂、仪器 DMEM、小牛血清、Trypsin 1: 250 (胰酶)购买于HyClone公司；EGM-2购买于Lonza公司；VEGF抗原ELISA检测试剂盒购买于深圳晶美生物工程有限公司；大鼠CD31抗体(一抗)、羊抗兔IgG(二抗)购买于北京博奥森生物技术有限公司；HUVEC购买于Sciencell公司；pHBAd-MCMV-GFP-VEGF165由汉恒生物有限公司包装、构建及鉴定；普通无菌手术器械包由西南医科大学附属第一医院手术室提供；倒置相差显微镜、光学显微照相系统购买于日本Olympus公司；37 ℃ CO₂培养箱购买于德国Heraeus公司。

1.4 实验方法

1.4.1 BMSCs培养 取5周龄SD大鼠2只，处死后分离出股骨及胫骨，获取骨髓液用于分离培养BMSCs(图1A)，并对其计数、定容。

1.4.2 腺病毒介导的VEGF165基因体外转染 HUVEC 在前期体外实验中通过VEGF165基因感染HUVEC的MOI摸索^[7]，分别使用MOI=3，10，30，50滴度的病毒液进行了预转染，发现当MOI=30时转染效率较高，细胞增殖能力好，死亡细胞数较少。故实验采用MOI=30进行基因转染。VEGF165基因转染前后HUVEC形态见图1B，C。

1.4.3 实验动物分组 实验动物随机分为5组，每组10只：①BMSCs与VEGF165基因转染HUVEC联合移植组(BMSCs+VEGF165-HUVEC组)；②VEGF165基因转染HUVEC单独移植组(VEGF165-HUVEC组)；③BMSCs与未转染VEGF165基因HUVEC联合移植组(BMSCs+HUVEC组)；④未转染VEGF165基因的HUVEC单独移植组(HUVEC组)；⑤空白对照组，即只注射DMEM培养基。

1.4.4 大鼠背部随意皮瓣动物模型的构建

术前准备：术前用电子秤称质量后给予戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉，麻醉成功后将大鼠俯卧位放置于加热型大鼠手术固定台上，采用手推子联合8%硫化钠于背部去除毛发约6 cm×4 cm大小区域。在大鼠背部正中设计蒂位于颈部，距离枕骨下端1 cm处的单蒂皮瓣，用手术标记笔标出皮瓣位置。并于设计的皮瓣中轴线上分别距离皮瓣蒂部1，2，3 cm处标记注射位点(图2A)。所有动物术前无需禁食、禁饮。

手术造模：术前SD大鼠称质量后用戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉，麻醉成功后将大鼠俯卧位放置于加热型大鼠手术固定台上，固定绳固定大鼠四肢，松紧适度，避免四肢缺血坏死。消毒铺巾后在大鼠背部按已设计的皮瓣标志线切开皮肤、皮下组织，锐性分离掀起皮瓣，皮瓣内包括背部浅筋膜层，解剖在背部肌膜的浅面进行。在背部肌膜浅面翻起1个蒂部离枕骨下缘1 cm处的长宽为4.0 cm×1.5 cm的随意皮瓣(图2B)，且该缺血皮瓣中不含轴心血管，边分离边结扎创面活跃出血点，生理盐水冲洗术区、纱布蘸干后复位皮瓣，然后用5-0丝线原位分段连续缝合(图2C)，术后创缘四周用妥布霉素软膏涂抹。所有手术均由同一组实验人员完成，SD大鼠术后分笼饲养，术中注意保护实验大鼠眼睛，避免强光刺激同时注意保暖。

1.4.5 移植细胞 细胞移植当天倒去全部培养基，PBS洗涤2次，胰酶消化后收集GFP阳性细胞并重悬，计数、定容至1×10⁹ L^-1用于细胞移植。皮瓣建模术后麻醉未醒前在大鼠背部随意皮瓣皮下局部注射移植细胞，术后即刻消毒大鼠背部缺血皮瓣中轴线上的上述3个标记位点，经皮肤45°进针，穿过深筋膜有落空感后将注射针退回至缺血皮瓣皮下组织层。分别将含细胞数量约5×10⁵个BMSCs和VEGF 165-HUVEC(1︰1)、VEGF165-HUVEC、BMSCs和HUVEC(1︰1)、HUVEC、DMEM 500 μL用微量注射器在术前标记的皮瓣中轴线上距离皮瓣蒂部 1，2，3 cm处均匀注射到皮瓣基底部^[8]。

1.4.6 大体观察 皮瓣术后1-11 d，每天观察大鼠背部皮瓣颜色及外观形态、水肿、坏死及存活情况并照相记录。

1.4.7 皮瓣存活率检测 缺血皮瓣建模术后第11天，大体观察已能明显分辨皮瓣坏死区域与存活区域。皮瓣坏死标准：皮瓣色泽变暗变黑、组织明显皱缩、质地较硬、弹性极差、毛发停止生长、切割变黑区域后不出血。大鼠经乙醚麻醉后俯卧于手术台上，用Canon 600D数码相机进行皮瓣拍照，图像导入计算机后采用 Image-Pro Plus 6.0(中文版)图像分析软件计算各组皮瓣的存活率。

1.4.8 不同时期各组外周血VEGF水平测定 于皮瓣术后第2，4，7，14天经眼眶后静脉丛采血0.5-1.0 mL，立即将其转移入离心管内，1 000×g、3 000 r/min离心10 min，将血清和红细胞迅速分离，分装冻存于-20 ℃冰箱，用于ELISA法检测各组术后不同时间点VEGF的表达水平。采血时应注意使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中尽量避免任何刺激。

1.4.9 组织学观察 术后第11天背部皮瓣拍照后，各组随机抽取5只大鼠麻醉过量后处死，刮去皮瓣新生毛发，分别于皮瓣存活区域4个转角处及存活区域中心共5点(图2D)切取直径约5 mm大小皮肤，厚约2 mm，体积分数为10%甲醛固定后进行组织学检测，包括苏木精-伊红染色及内皮细胞的CD31免疫组化染色，用来检测皮瓣的微血管密度。在每组25张CD31免疫组化切片中随机抽取10张，于200倍光镜下每张随机计算20个视野中血管断面数目，计算微血管密度^[8]。

1.5 主要观察指标 ①大体观察皮瓣外观形态、水肿、坏死及存活情况；②术后第11天，各组大鼠背部皮瓣存活率；③术后各组大鼠外周血血清VEGF水平；④各组大鼠皮瓣组织的苏木精-伊红染色及内皮细胞的CD31免疫组织化学染色，计数微血管密度。

1.6 统计学分析 所得数据均采用x(_)±s形式表示。应用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析，各组皮瓣存活率、VEGF蛋白表达水平及微血管密度计数数据比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

随着国内外学者对组织工程学技术修复大段骨缺损研究的不断深入，先后出现了多种促组织工程骨血管化的体内方案，如血管束植入、带血管蒂肌瓣包裹、带血管蒂骨膜瓣包裹、带血管蒂筋膜瓣包裹、带肌肉骨瓣等方法，但是以上这几种促血管化方案都需要再次或多次手术，无形中增加了手术创伤及手术时间，患者术后需要较长时间来恢复，其临床应用往往受到限制。

研究表明，成骨细胞与血管内皮细胞共培养时发现，成骨细胞持续表达VEGF mRNA，从而上调VEGF的表达，VEGF一方面促进内皮细胞的分裂、增殖以及分化形成血管芽，另一方面上调内皮细胞表达骨形态发生蛋白2，骨形态发生蛋白2反过来作用于成骨细胞促进成骨，同时促进成骨细胞表达VEGF mRNA，两者起到级联放大的相互促进作用。然而体外培养血管内皮细胞的要求较高，且成骨细胞与血管内皮细胞均为终末分化细胞，它们的增殖能力有限。BMSCs具有干细胞共性，即拥有多向分化的潜能，在特定的诱导条件下可以分化为成骨细胞、成脂细胞、成神经细胞等，增殖能力极强，且来源广泛，取材方便^[9-10]。HUVEC由于来源丰富，取材、操作方便，不像胚胎干细胞涉及伦理问题，且具有干细胞的功能，能够无限次(理论上)增殖传代。因此，越来越多的研究者将目光转向HUVEC与BMSCs的共培养模式。

生长因子是血管生成中最核心的因素之一，参与形成复杂的网络系统调控血管的发生与形成。目前，生长因子的应用形式有重组蛋白及基因转染两种方式。但重组蛋白的体内半衰期短，如果直接将其应用于损伤局部会很快被周围组织溶解，降解为无活性的片段，无法持续、稳定地发挥作用；静脉给药不能大量定位至损伤部位，且需要多次给药，同时也存在被降解的问题。而通过基因转染的方法将目的基因导入宿主细胞可解决此难题，从而能够持续、稳定地发挥生物学效应。

前期体外实验证实，以Ad-GFP缺陷性腺病毒为载体将VEGF165基因转染至HUVEC后将其与BMSCs体外共培养，共培养后HUVEC的增殖、移行、成血管能力比未转染基因共培养组强^[7]。而且空载体转染组对细胞的增殖、移行、成血管能力无明显影响。然而，由于体内外微环境差异较大，影响血管生成的因素千差万别，为最终能构建出血管化组织工程骨修复大段骨缺损尚需要进一步的体内实验数据支持。因此，实验采用大鼠背部缺血皮瓣动物模型，将BMSCs与VEGF165基因转染的HUVEC共移植至动物体内，观察二者在体内的促血管生成能力，为构建血管化组织工程骨用于体内修复大段骨缺损提供理论依据和实验基础。随意皮瓣由于没有知名血管供血，其长宽比例就成为设计皮瓣时的限制因素。在肢体和躯干部位，长宽之比以1.5︰1为最安全，最好不要超过2︰1。通常情况下4 cm×1.5 cm的缺血皮瓣，其长宽比例为2.67︰1，远超过1.5︰1，且皮瓣无轴心血管，即使术中给予良好的保护及创缘精确对位缝合，其局部也是处于极度缺血的状态，从而导致缺血皮瓣不能存活，最终坏死。因此实验选择该缺血皮瓣动物模型来验证BMSCs与VEGF165基因转染HUVEC共移植在体内是否有促进血管生成的能力。

冯祥生等^[11]研究表明，皮片移植后其营养来源按发生先后可分为3个阶段。早期即移植后一两天，主要依靠创面毛细血管扩张，渗出血浆以供应皮片营养；中期即移植后3-5 d，皮片中血管网结构与创面基底残存血管断端吻合，提供血液供应；后期即移植后一两周，新生血管形成，皮片获得较充足的血供。因此，实验选择术后第11天处死大鼠取材，行苏木精-伊红染色及免疫组化来检测皮瓣微血管密度，微血管密度是评价血管生成的定量指标。CD31是一种新型的微血管标记物，其显示血管内皮细胞特异性最高，优于内皮细胞其他的表面标记物，而且HUVEC高表达成熟内皮细胞表面标志CD31，低表达内皮祖细胞及造血干细胞表面标志CD34及血管黏附分子CD106^[12]。因此，实验采用CD31免疫组织化学染色来标记HUVEC，计算微血管密度。

术后11 d应用Image-Pro Plus 软件计算各组皮瓣存活率，最终结果显示BMSCs+VEGF165-HUVEC组>VEGF 165-HUVEC组>HUVEC组>空白对照组，同时BMSCs+ VEGF165-HUVEC组>BMSCs+HUVEC组>HUVEC组>空白对照组，差异有显著性意义；通过大体观察可见BMSCs+VEGF165-HUVEC组皮瓣成活质量较其他4组明显提高。HUVEC组与空白对照组比较能够证明HUVEC在体内有一定的成血管能力，BMSCs+HUVEC组与HUVEC组比较发现BMSCs与HUVEC共移植比单独移植在体内的促血管作用增强，通过CD31免疫组化测得的微血管密度也同时印证该结果。BMSCs与HUVEC通过直接接触培养的模式，一方面可以促进共培养体系中BMSCs向成骨细胞方向分化，进而促进新骨形成，另一方面还可以使共培养的HUVEC与BMSCs一起迁移以及其自组装进网络结构^[13-15]。Villars等^[16]研究表明，BMSCs与HUVEC以非直接接触共培养时，发现VEGF165在BMSCs中的合成和分泌增加，进而促进HUVEC的分裂、增殖、迁移以及毛细血管状结构的形成；两者在直接接触共培养条件下，可上调BMSCs表达VEGF165。本实验结果显示，BMSCs与HUVEC共移植后体内VEGF蛋白表达水平并未明显增加，BMSCs+HUVEC组、HUVEC组、空白对照组各个时期血清中VEGF水平无明显变化，这种区别可能是HUVEC和BMSCs自身能分泌多种细胞生长因子，如VEGF、FGF等，在一定程度上能够促进局部血管化，但分泌细胞因子的量很少，在血液循环过程中被稀释。由于实验检测外周血血清中VEGF水平，在缺血皮瓣局部的VEGF水平要比血清水平会更高。

通过VEGF165-HUVEC组与HUVEC组的VEGF水平比较发现，VEGF165基因转染后在体内能够高表达VEGF蛋白，通过两组皮瓣存活率及微血管密度差异的比较推断VEGF在体内发挥了促血管生成的作用。BMSCs+VEGF 165-HUVEC组不同时期VEGF水平较VEGF165-HUVEC组、BMSCs+HUVEC组高，说明VEGF165基因转染HUVEC后与BMSCs共移植比单独共移植或单独转染基因移植后的VEGF蛋白表达明显提高；BMSCs+VEGF 165-HUVEC组与VEGF165-HUVEC组皮瓣存活率及微血管密度差异推断出转染基因的HUVEC与BMSCs共移植在体内的促血管生成能力比单独转染基因组强；BMSCs+VEGF165-HUVEC组与BMSCs+HUVEC组的皮瓣存活率及微血管密度差异推断出转染基因的HUVEC与BMSCs共移植在体内的促血管生成能力比单独共移植组强。Grellier等^[17]认为，BMSCs和HUVEC共培养时，两者之间不仅可以通过相邻细胞膜分子间的黏附和紧密连接—神经钙黏连蛋白(N-Cadherin)相互联系，而且其间的信号分子能通过相互邻近的细胞质间以自由扩散的方式形成缝隙连接来进行信息交换；BMSCs和HUVEC在共培养条件下还能通过从细胞外基质中释放可扩散性因子产生的旁分泌作用或靶细胞膜上的特定受体来相互联系。以往的实验研究发现，共培养的HUVEC中，尿激酶类纤溶酶原激活剂以及VEGF受体2(VEGFR 2/KDR)分泌增加，VEGF165在BMSCs中的表达同时也上调，VEGF165进而活化HUVEC中尿激酶类纤溶酶原激活剂，尿激酶类纤溶酶原激活剂与血管内皮钙黏连蛋白(VE-Cadherin)可能一起启动了共培养细胞的自组装网络的形成以及细胞的迁移^[18]。Kaigler等^[19]在体外凝胶促血管生成的模型研究中发现，共培养的BMSCs能分泌VEGF来促进内皮细胞的分裂、增殖分化形成血管芽状结构。进一步的实验研究表明共培养的血管内皮细胞可以释放骨形态发生蛋白2，一方面促进成骨分化^[20]，另一方面还可以促进成骨及其前体细胞分泌VEGF，VEGF反过来作用于血管内皮细胞，促进内皮细胞的增殖、分化及血管生成。

由于BMSCs具有多向分化的生物学特性，在不同的诱导环境下可以向不同的细胞系分化，有研究表明，BMSCs在特定的培养条件下可以向血管内皮细胞方向分化。那么，BMSCs和HUVEC共移植入体内后，HUVEC是否会分泌相关细胞因子并诱导BMSCs向内皮细胞分化呢? Xu等^[21]将微血管内皮细胞与BMSCs直接接触共培养，两种细胞直接接触后通过肿瘤坏死因子α转化酶这种分子信号的产生，从而诱导BMSCs向内皮细胞分化。然而， HUVEC属于大血管内皮细胞，关于腺病毒介导VEGF165基因转染HUVEC后是否可促进BMSCs向内皮细胞分化还需要进一步的验证。

结论：实验验证了BMSCs与VEGF165基因转染HUVEC共移植可促进缺血皮瓣血管化，其在体内有显著促血管生成的能力，提高缺血皮瓣存活率。但是两种细胞以什么样的比例来移植才能更好地发挥体内促血管生成作用呢？此问题可作为以后实验研究的一个方向。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

骨髓间充质干细胞与血管内皮生长因子165基因转染人脐静脉内皮细胞共移植促进缺血皮瓣血管的生成

Promoting angiogenesis by con-transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells and human umbilical vein endothelial cells transfected with vascular endothelial growth factor 165 gene

PDF

可视化

被引次数

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 2

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[2]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[3]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[4]	刘聪, 刘肃. miR-17-5p调控低氧诱导因子1α介导脂肪细胞分化及血管生成的分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1069-1074.
[5]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[6]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[7]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[8]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[9]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[10]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[11]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[12]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[13]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[14]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[15]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.