过表达基质细胞衍生因子1基因促进骨髓间充质干细胞增殖和迁移

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0408

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
基质细胞衍生因子1(stromal cell derived factor，SDF-1)：主要是由骨髓基质细胞产生的CXC类趋化蛋白，是已知惟一能与受体CXCR4结合的天然趋化因子。SDF-1有6种亚型，包括SDF-1α、SDF-1β、SDF-1γ、SDF-1δ、SDF-1ε和SDF-1ψ，是同一基因经不同剪切作用的产物，以SDF-1α亚型为主，但未发现它们在功能及表达上的区别。SDF-1与其特异性受体CXCR4结合后形成的SDF-1/CXCR4轴是促进骨髓间充质干细胞向损伤组织归巢的重要生物轴，是干/祖细胞在归巢过程中的一个重要环节。
过表达基因：已经证实骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤的机制与其可以增加脊髓神经细胞数量，减少胶质瘢痕和空洞形成有关。同时，国内外科学家发现基因治疗联合干细胞移植的方法可以提高单纯干细胞移植的疗效，使得人们对脊髓损伤的治疗看到了新的希望。

摘要
背景：基质细胞衍生因子1(stromal cell derived factor，SDF-1)/CXCR4轴不仅能够促进骨髓间充质干细胞向损伤组织迁移，而且具有抑制骨髓间充质干细胞凋亡、增加骨髓间充质干细胞存活率及增殖活性等作用。
目的：建立慢病毒介导的稳定过表达SDF-1α的骨髓间充质干细胞系，在体外观察其对骨髓间充质干细胞增殖和迁移的影响。
方法：构建过表达SDF-1α重组慢病毒载体(pNL-SDF-1α-IRES₂-EGFP)，并以空载体质粒pNL-IRES₂-EGFP、基因沉默质粒GV-118-SDF-1α-siRNA作为实验对照，分别转染293T细胞和骨髓间充质干细胞，建立稳定过表达SDF-1α的骨髓间充质干细胞系：SDF-1α-BMSCs组、null-BMSCs组和siRNA-BMSCs组；采用RT-PCR、Western Blot方法检测SDF-1α mRNA和蛋白的表达水平；MTT法检测骨髓间充质干细胞的增殖能力；Transwell迁移实验检测SDF-1α对骨髓间充质干细胞迁移能力的影响。
结果与结论：①成功构建pNL-SDF-1α-IRES₂-EGFP质粒，经测序结果表明pNL-SDF-1α-IRES₂-EGFP重组质粒构建成功；②慢病毒转染48 h后可见293T细胞和各组骨髓间充质干细胞强烈表达EGFP；③SDF-1α-BMSCs组高效表达SDF-1α，siRNA-BMSCs组SDF-1α表达明显被抑制；④SDF-1α-BMSCs组的细胞增殖能力增强，SDF-1α可明显促进骨髓间充质干细胞的跨膜迁移。在抗SDF-1α多抗作用后各组细胞迁移指数明显下降；⑤结果可见，慢病毒载体可介导外源性基因SDF-1α在大鼠骨髓间充质干细胞中高效表达，并促进骨髓间充质干细胞的增殖和迁移。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-9711-2604(陈少强)

关键词: 干细胞, 细胞培养与分化, 慢病毒, 基质细胞衍生因子, 骨髓间充质干细胞, 过表达基因, 细胞增殖, 迁移, 福建省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The stromal cell-derived factor-1 (SDF-1)/C-X-C chemokine receptor type 4 (CXCR4) signaling pathway cannot only improve the migration ability of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs), but also restrain BMSCs apoptosis, increase BMSCs survival and improve the proliferation activity of BMSCs.
OBJECTIVE: To construct a rat BMSCs line with SDF-1α overexpression and to explore its influence on the proliferation and migration of BMSCs in vitro.
METHODS: The SDF-1α overexpression vector (pNL-SDF-1α-IRES₂-EGFP) was constructed. The lentivirus particles were packaged by transferring pNL-SDF-1α-IRES2-EGFP, pNL-IRES₂-EGFP and GV-118-SDF-1α-siRNA into 293T cells. The BMSCs lines with SDF-1α overexpression in SDF-1α-BMSCs group, null-BMSCs group and siRNA-BMSCs group were established by transfecting SDF-1α-lentiviru, null-lentivirus and siRNA-lentivirus into BMSCs respectively. The expression of SDF-1α at mRNA and protein levels in BMSCs was evaluated by RT-PCR and western blot assay, respectively. The influence of SDF-1α on proliferation and migration of BMSCs were evaluated by MTT and Transwell migration experiment respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: The pNL-SDF-1α-IRES₂-EGFP recombinant plasmid was successfully constructed, which was proved by sequencing results. EGFP was strongly expressed in 293T cells and BMSCs in all groups after 48 hours in lentivirus transfection. SDF-1α at mRNA and protein levels were highly expressed in the SDF-1α-BMSCs group, but the expression was significantly inhibited in the siRNA-BMSCs group. The proliferative ability of BMSCs was strengthened in the SDF-1α-BMSCs group, and SDF-1α was found to significantly promote the transmembrane migration of BMSCs. The migration index of BMSCs incubated with anti-SDF-1α multi-antibodies was restrained markedly. To conclude, the lentivirus vector cannot only infect BMSCs efficiently but also make SDF-1 expresse stably in BMSCs. The overexpression of SDF-1α can improve the proliferation and migration abilities of BMSCs.

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Key words: Chemokine CXCL12, Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Lentivirus Infections, Cell Proliferation, Cell Movement, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 3

2.1 SDF-1α目的基因的获取结果 所提取大鼠肝脏组织总RNA的A₂₆₀/A₂₈₀为1.96，RNA质量浓度为2 168 mg/L。1.0%琼脂糖凝胶电泳后可以清楚地看到3条条带，分别为28s rRNA、18s rRNA及5s rRNA。RT-PCR后行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳图上在300 bp处可见一条明亮的清晰条带，与预期的特异SDF-1α基因片段270 bp相符(图1)。

2.2 过表达SDF-1α质粒的构建与鉴定结果 SDF-1α基因及pNL-IRES₂-EGFP质粒用EcoRⅠ及NheⅠ双酶切后，分别行1.0%及0.8%琼脂糖凝胶电泳，电泳图上在300 bp和10 kb处可见两条明亮的清晰条带(图2，3)，300 bp处条带即为目的基因片段，10 kb处的条带与载体的基因大小相符。连接产物转化后挑取克隆，进行PCR初步鉴定，电泳图结果显示，在300 bp处可见一条明亮的清晰条带，与预期的特异SDF-1α基因片段270 bp相符。重组质粒PCR鉴定阳性后用EcoRⅠ及NheⅠ双酶切鉴定，电泳图上可见300 bp的目的条带及10 kb的载体条带(图4)。将重组质粒送上海铂尚生物技术有限公司进行测序鉴定，测序结果与SDF-1α基因序列，即从起始密码ATG到终止密码TAA序列完全相同。

2.3 骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定结果 培养24 h后细胞逐渐贴壁，其他血细胞通过换液逐渐除去，此时贴壁细胞共同特点是呈单核细胞状，细胞形态不一，可有梭形、多角形或星芒状突起，为单个或多个细胞的克隆，细胞增殖迅速。培养12-14 d，细胞90%以上融合，融合细胞都呈梭形，原代可获得(1.0-2.0)×10⁶个骨髓间充质干细胞。体外扩增5代后细胞数约为1×10¹¹个。流式细胞仪检测10份第2代细胞样本，结果显示：CD34、 CD45表达阴性，CD29、CD90表达阳性。

2.4 慢病毒SDF-1α基因载体感染细胞及过表达SDF-1α骨髓间充质干细胞系的建立情况 3种质粒共同转染293T细胞后，可在倒置荧光显微镜下观察到大量293T细胞表达EGFP，EGFP阳性率可达95%以上(图5)。病毒感染骨髓间充质干细胞72 h后，可在倒置荧光显微镜下观察到EGFP表达(图6)，表明慢病毒转染载体成功将SDF-1α目的基因转入大鼠骨髓间充质干细胞。

RT-PCR检测结果显示，SDF-1α-BMSCs组SDF-1α mRNA的表达高于null-BMSCs组(P < 0.05)，而siRNA-BMSCs组低于null-BMSCs组(P < 0.05)，各组骨髓间充质干细胞表达SDF-1α mRNA情况见表1和图7。

Western Blot检测结果显示，SDF-1α-BMSCs组SDF-1α蛋白分子的表达高于null-BMSCs组(P < 0.05)，而siRNA- BMSCs组低于null-BMSCs组(P < 0.05)，各组骨髓间充质干细胞表达SDF-1α蛋白情况见表1和图8。说明过表达SDF-1α基因能提高骨髓间充质干细胞中SDF-1α的表达，SDF-1α沉默能抑制其表达，成功建立过表达SDF-1α骨髓间充质干细胞系。

2.5 过表达SDF-1α对骨髓间充质干细胞增殖的影响 感染第1天时，各组吸光度值差异无显著性意义(P > 0.05)，其余时间点各组吸光度值差异均有显著性意义(P < 0.05)。各组吸光度值见表2和图9，SDF-1α-BMSCs组高于null- BMSCs组(P < 0.05)，而siRNA-BMSCs组低于null-BMSCs组(P < 0.05)，说明过表达SDF-1α基因能提高骨髓间充质干细胞的增殖能力。

2.6 过表达SDF-1α对骨髓间充质干细胞迁移的影响 在Transwell小室上进行体外迁移实验中，聚碳酸酯膜下表面的迁移细胞用结晶紫染色后呈浅紫色，见图10。图中可见SDF-1α-BMSCs组迁移指数高于null-BMSCs组，而siRNA-BMSCs组低于null-BMSCs组，3者之间差异均有显著性意义(P < 0.01)。SDF-1α-BMSCs组及null-BMSCs组在抗SDF-1α多抗作用后迁移指数明显下降，与抗体阻断前差异有显著性意义(P < 0.05)；而siRNA-BMSCs组抗体阻断后与阻断前迁移指数差异无显著性意义，见表3。

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引言

脊髓损伤后丧失大量的神经元，是损伤脊髓缺乏修复能力和修复因素(如神经营养因素)的重要原因，同时神经元坏死后形成的胶质瘢痕和空洞阻碍了轴突的生长，也是治疗脊髓损伤最棘手的问题^[1]。近几年来，随着神经生物学和干细胞技术的发展，通过细胞移植来增加脊髓神经细胞数量、减少胶质瘢痕和空洞的形成已成为可能，因此细胞移植有望成为一种治疗脊髓损伤的新方法。骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)是骨髓内的非造血干细胞，具有来源广泛、取材容易、在体外长期培养过程中始终保持其多向分化潜能、体内移植反应弱、克服了有关伦理学及免疫排斥问题等优点，是组织工程和细胞移植治疗的最佳种子细胞^[2-3]。在体外，骨髓间充质干细胞不仅可以分化为成骨细胞、心肌细胞、软骨细胞、脂肪细胞等间质细胞^[4-5]，而且在一定条件下还可以分化为神经细胞，对移植治疗帕金森病、阿尔茨海默病、脑卒中等神经系统疾病具有重要价值^[6]。近年来研究发现移植骨髓间充质干细胞能通过损伤脊髓的血-脊髓屏障，迁移至脊髓损伤区^[7]，能够在损伤脊髓内分化为神经元样细胞，表达NeuN和GFAP等神经细胞的特异性标记，取代已死亡的神经细胞^[8]；诱导体内神经干细胞向神经元分化，提高神经干细胞的分化率，并增加分化后神经元的存活率^[9]；能形成“细胞束”与宿主的神经细胞相联系，并通过与宿主神经细胞建立广泛的传入和传出联系重建神经通路^[10-11]；增加脊髓血管密度，增多血流量，改善微环境，从而促进损伤脊髓神经功能的恢复^[12]。课题组前期研究实验也证实，移植骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤能明显促进损伤脊髓形态和神经功能的恢复，同时对骨髓间充质干细胞移植的时间窗选择、移植方法、骨髓间充质干细胞分化为功能性神经细胞的可能性和改善损伤脊髓神经功能部分机制等进行了研究探讨^[13-23]。然而，目前所取得的研究成果多数是局限在动物模型上，而且，骨髓间充质干细胞移植后的低“归巢”率、低存活率和低分化率严重制约了骨髓间充质干细胞移植在临床上的应用。

基质细胞衍生因子1(stromal cell derived factor，SDF-1)与其特异性受体CXCR4结合后形成的SDF-1/CXCR4轴是促进骨髓间充质干细胞向损伤组织归巢的重要生物轴，是干/祖细胞在归巢过程中的一个重要环节^[24-30]。SDF-1/CXCR4轴不仅能够促进移植骨髓间充质干细胞向损伤组织迁移，而且具有抑制骨髓间充质干细胞凋亡、增加骨髓间充质干细胞存活率及增殖活性等作用，从多方面提高其向损伤组织的归巢效率。SDF-1有6种单体形式，包括SDF-1α、SDF-1β、SDF-1γ、SDF-1δ、SDF-1ε和SDF-1ψ，是同一基因经不同剪切作用的产物。实验拟在前期工作的基础上进一步探讨骨髓间充质干细胞向损伤脊髓归巢的可能机制，并通过分子生物学方法探索增加骨髓间充质干细胞归巢率和生存率的可行方法；通过构建过表达SDF-1α慢病毒载体，用于感染骨髓间充质干细胞，使SDF-1α目的基因在骨髓间充质干细胞中持续表达，观察其对骨髓间充质干细胞增殖和迁移能力的影响，为临床上进一步研究骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤提供理论依据。

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材料方法

1.1 设计 细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年9月至2016年9月在福建医科大学神经生物学研究中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 选用清洁级健康雄性SD大鼠10只，两三个月龄，体质量150-250 g，由福建医科大学实验动物中心提供。

1.3.2 实验用主要试剂 pNL-IRES₂-EGFP(美国Dulane大学陈一平教授惠赠)；DH5α感受态细胞(北京TransGen Biotech公司)；限制性内切酶(EcoRⅠ、NheⅠ)(NEB公司)；GV-118-SDF-1α-siRNA慢病毒(上海吉凯基因化学技术有限公司)；293T细胞(福建医科大学章涛教授惠赠)；Lipofectamine2000(美国Invitrogen公司)。

1.3.3 实验用主要仪器 CO₂细胞培养箱(Thermo Forma 3111型，美国Thermo Fisher公司)；PCR仪(5331，德国 Eppendorf 公司)；倒置荧光显微镜(Axio observer A1，德国ZEISS公司)；Transwell小室(美国Millipore公司)；流式细胞仪(Epics XL，美国Beckman公司)；微量分光光度计(ND2000C，美国Thermo Fisher公司)；酶标仪(Bio-Rad680，美国Bio-Rad公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 SDF-1α目的基因的获取 根据Gene-Bank所公布的SDF-1α基因的蛋白质编码区序列设计引物，在目的片段上下游分别添加酶切位点EcoRⅠ和NheⅠ，由上海生工生物有限公司合成，正义序列：酶切位点保护碱基(CG)、酶切位点(EcoRⅠ)、序列为5’-CTA GCT AGC ATG GAC GCC AAG GT-3’，反义序列：酶切位点保护碱基(CG)、酶切位点(NheⅠ)、序列为SDF-1α-R5’-CCG GAA TTC CTT ACT TGT TTA AGG CT-3’。目的基因PCR扩增：采用Trizol法提取大鼠肝脏组织的总RNA，以总RNA为模板，反转录合成cDNA第一链，凝胶电泳后回收目的基因产物。回收的DNA于-20 ℃保存，用微量分光光度计测定A₂₆₀/A₂₈₀值和DNA浓度。

1.4.2 过表达SDF-1α质粒的构建与鉴定 将凝胶电泳后回收目的基因产物与抽提的pNL-IRES₂-EGFP质粒进行EcoRⅠ和NheⅠ双酶切后进行连接反应，其产物转化DH5α感受态细胞并进行细菌培养。挑取10个细菌培养后生长饱满的菌落进行PCR扩增与测序鉴定，PCR鉴定呈阳性的克隆即为构建成功的目的质粒pNL-SDF-1α-IRES₂- EGFP。

1.4.3 慢病毒基因载体的包装、收集和浓缩 采用脂质体Lipofectamine2000将大量抽提的目的质粒、包装质粒(pHELPER)和包膜质粒(pVSVG)以 1︰1︰1 的质量比例共同转染293T细胞用于生产病毒，包装构建SDF-1α基因载体慢病毒。按照上述相同方法分别将质粒pNL-IRES₂- EGFP和GV-118-SDF-1α-siRNA转染293T细胞，构建空载体慢病毒和SDF-1α基因沉默载体慢病毒，作为实验对照组。转染后48，72 h收集病毒上清，采用超滤离心法，进行病毒的浓缩，采用梯度稀释法进行病毒滴度测定。所收集的病毒分别命名为pNL-SDF-1α-IRES₂-EGFP、pNL- IRES₂-EGFP及GV-118-SDF-1α-siRNA。

1.4.4 密度梯度离心法分离、培养、传代与鉴定骨髓间充质干细胞 大鼠用氯胺酮(60 mg/kg)腹腔注射麻醉，浓碘伏消毒。取双侧四肢骨，剪除干骺端，暴露骨髓腔，用10 mL培养液(含1×10⁴ U肝素)冲洗骨髓腔。将所获骨髓缓慢加入已含3 mL Ficoll-Paque分离液的试管内梯度离心(2 000 r/min， 30 min)，吸取富含粒细胞中间界面层，PBS洗涤3次，制成单细胞悬液接种。培养条件为37 ℃、饱和湿度、体积分数为5%CO₂，培养液为完全低糖DMEM(含体积分数为10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 g/L链霉素)。每3 d或4 d更换1次培养液，去除未贴壁细胞，至细胞融合时用0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞、传代并检测CD34、CD45、CD29、CD90表面标记物的表达。

1.4.5 pNL-SDF-1α-IRES₂-EGFP、pNL-IRES₂-EGFP及GV-118-SDF-1α-siRNA感染骨髓间充质干细胞及过表达SDF-1α的骨髓间充质干细胞系的建立 感染前1 d，将骨髓间充质干细胞以1.5×10⁵个/孔的密度接种于6孔板，置于37 ℃、体积分数为5% CO₂培养箱中培养。18-24 h后观察细胞生长状态，待细胞生长到70%融合时进行感染。弃去旧培养基，分别将3种质粒pNL-SDF-1α-IRES₂-EGFP、pNL-IRES₂-EGFP和GV-118-SDF-1α-siRNA的病毒上清液以3个感染复数(MOI)感染骨髓间充质干细胞，并加入polybrene(终质量浓度为6 mg/L)。每种病毒接种2孔，在37 ℃、体积分数为5% CO₂培养箱中培养。12 h后弃去含病毒的培养基，更换为2 mL新鲜的完全低糖DMEM培养基，37 ℃、体积分数为5% CO₂培养箱中培养。感染72 h收获过表达SDF-1α的骨髓间充质干细胞系：过表达SDF-1α基因骨髓间充质干细胞(SDF-1α-BMSCs组)、转染空载体骨髓间充质干细胞(null-BMSCs组)和SDF-1α基因沉默骨髓间充质干细胞(siRNA-BMSCs组)。采用RT-PCR和Western Blot方法分别检测各组骨髓间充质干细胞的SDF-1α mRNA和蛋白的表达水平。

1.4.6 MTT法评价过表达SDF-1α对骨髓间充质干细胞增殖的影响 取各组第3代骨髓间充质干细胞接种于96孔板中，每孔体积100 μL，细胞数为1×10³，每组30孔，每天相同时间每组各取5孔细胞，加入MTT溶液20 μL(5 g/L)，37 ℃、体积分数为5% CO₂培养箱孵育4 h后用全自动酶标仪在490 nm波长测定各孔吸光度值，连续7 d，取其均值，并绘制生长曲线。

1.4.7 细胞迁移实验检测过表达SDF-1α对骨髓间充质干细胞迁移的影响 当各组第3代骨髓间充质干细胞基本长满孔底时，更换无血清无抗生素的低糖DMEM培养基。24 h后，用1 mL 0.25%胰酶-EDTA消化细胞，用无血清培养基终止消化，吹打细胞成细胞悬液。将Transwell小室放置于24孔板。下室加入含体积分数为20%胎牛血清的低糖DMEM培养基或无血清低糖DMEM培养基(对照组)，上室加入100 μL细胞浓度为5×10⁸ L^-1的无血清SDF-1α-BMSCs，null-BMSCs，siRNA-BMSCs细胞悬液。37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中孵育4 h。孵育完成后，将上室培养基吸弃，放于空孔，用棉棒擦洗3次。0.5%结晶紫染液染色5 min，双蒸水清洗3遍。将小室置于载玻片上，在显微镜下计算迁移细胞数，每孔计算5个高倍视野(×100)的细胞均数。为了消除不同实验中对照孔所引起的迁移背景不同，结果用迁移指数表示(迁移指数=实验组迁移细胞数/对照组迁移细胞数)。将SDF-1α-BMSCs，null-BMSCs，siRNA-BMSCs用无血清低糖DMEM制成细胞浓度为5×10⁸ L^-1的细胞悬液，分别取1 mL细胞悬液与30 μg抗SDF-1α在37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中孵育2 h，之后再将抗体孵育后的细胞按照上面的步骤进行迁移实验。

1.5 主要观察指标 ①SDF-1α目的基因的获取结果；②过表达SDF-1α质粒的构建与鉴定结果；③慢病毒感染细胞情况；④细胞增殖以及体外迁移能力。

1.6 统计学分析 所有数据均以x(_)±s表示，用Microsoft Excel 软件制作柱形图，采用SPSS 13.0统计软件包对所得数据进行t 检验和单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

SDF-1主要是由骨髓基质细胞产生的CXC类趋化蛋白，是已知惟一能与受体CXCR4结合的天然趋化因子。SDF-1有6种亚型，包括SDF-1α、SDF-1β、SDF-1γ、SDF-1δ、SDF-1ε和SDF-1ψ，是同一基因经不同剪切作用的产物，以SDF-1α亚型为主，但未发现它们在功能及表达上的区别^[31]。Yu等^[32]通过RT-PCR方法检测SDF-1亚型的组织分布，发现SDF-1α在肝、胰和脾上表达最高。SDF-1α与其受体CXCR4结合后相互作用，在血管形成、癌症转移和HIV感染上发挥重要的作用。研究已经表明，骨髓间充质干细胞具有定向迁移到靶向组织并定植的能力，特别是在这些组织发生损伤之后^[33-35]，而SDF-1/CXCR4生物轴在骨髓间充质干细胞向损伤组织定向迁移过程中起到关键的作用^[24-30]。因此，实验选择SDF-1α基因作为目的基因，探讨过表达SDF-1α对骨髓间充质干细胞增殖和迁移的影响。根据Gene-Bank所公布的SDF-1α基因片段约270 bp，实验结果显示，电泳图上在300 bp处可见一条明亮的清晰条带，与预期的特异SDF-1α基因片段基本相符。后面进一步将重组质粒进行测序鉴定，测序结果与SDF-1α基因序列完全相同，说明采用RT-PCR方法从大鼠肝脏成功克隆SDF-1α基因编码区片段。

基因导入系统可分为病毒载体系统和非病毒载体系统。目前较为常用的病毒载体包括慢病毒载体、反转录病毒载体、腺相关病毒载体、腺病毒载体，其中慢病毒载体不仅可感染分裂期和非分裂期细胞，且表达时间长，低免疫原性，在基因治疗和组织工程中具有广泛的应用^[36]，所以实验选用第2代自我失活的慢病毒质粒载体系统。实验将带有绿色荧光蛋白标记和EcoRⅠ、NheⅠ两个酶位切点的表达载体pNL-IRES₂-EGFP与目的基因SDF-1α的cDNA连接，成功构建表达载体。连接产物转化DH5α感受态细胞并扩增后，经EcoRⅠ、NheⅠ双酶切鉴定，RT-PCR产物和克隆扩增产物的电泳结果显示该基因的大小约为300个碱基，测序结果表明实验所获得的与pNL-IRES₂-EGFP相连接的cDNA与Gene-Bank所公布的SDF-1α基因片段一致，正是所需要的目的基因。用所构建的目的基因载体转染293T细胞和骨髓间充质干细胞，均发现有绿色荧光蛋白表达，说明pNL-IRES₂-EGFP表达载体性能可靠。

作者前期研究表明，移植骨髓间充质干细胞能够促进损伤脊髓形态和神经功能的恢复，与文献报道相符^[13-23]。然而，骨髓间充质干细胞移植后的低“归巢”率、低存活率和低分化率严重制约了骨髓间充质干细胞移植在临床上的应用。SDF-1与其特异性受体CXCR4结合后形成的

SDF-1/CXCR4轴是促进骨髓间充质干细胞向损伤组织归巢的重要生物轴，是干/祖细胞在归巢过程中的一个重要环节^[24-30]。SDF-1/CXCR4轴不仅能够促进移植后的骨髓间充质干细胞向损伤组织迁移，而且具有抑制骨髓间充质干细胞凋亡、增加骨髓间充质干细胞存活率及增殖活性等作用，从多方面提高骨髓间充质干细胞向损伤组织的归巢效率。实验设置3组：过表达SDF-1α基因骨髓间充质干细胞(SDF-1α-BMSCs组)、转染空载体骨髓间充质干细胞(null-BMSCs组)和SDF-1α基因沉默骨髓间充质干细胞(siRNA-BMSCs组)。采用RT-PCR和Western Blot方法分别检测各组骨髓间充质干细胞的SDF-1α mRNA和蛋白的表达水平。结果表明，SDF-1α慢病毒载体转染的骨髓间充质干细胞有绿色荧光蛋白表达，RT-PCR和Western Blot检测结果显示，SDF-1α-BMSCs组SDF-1α mRNA和蛋白分子的表达高于null-BMSCs组(P < 0.05)，而siRNA-BMSCs组低于null-BMSCs组(P < 0.05)，证实过表达SDF-1α基因能提高骨髓间充质干细胞中SDF-1α mRNA和蛋白分子的表达，SDF-1α沉默能抑制其表达，说明实验成功建立了过表达SDF-1α的骨髓间充质干细胞体系。

在与细胞增殖有关的细胞信号通路中，ERK信号通路具有重要的作用。ERK1/2在细胞内广泛表达，可被细胞因子、趋化因子等促有丝分裂因子所磷酸化，被磷酸化激活后的ERK1/2，可进一步磷酸化包括蛋白激酶、受体、细胞骨架蛋白和转录因子等一系列底物，从而产生调节细胞增殖的作用^[37-39]。目前研究已证实，SDF-1α可磷酸化小鼠星形胶质细胞内ERK信号，促使细胞周期由G₀期进入S期和M期，并可促进Cyclin A2、Cyclin B1等细胞周期相关蛋白的表达，具有明显的促细胞增殖作用^[40]。实验在成功建立过表达SDF-1α骨髓间充质干细胞体系的基础上，应用MTT法检测各组骨髓间充质干细胞的吸光度值，结果差异均有显著性意义(P < 0.05)，SDF-1α-BMSCs组高于null-BMSCs组(P < 0.05)，而siRNA-BMSCs组低于null-BMSCs组(P < 0.05)，证实过表达SDF-1α基因能提高骨髓间充质干细胞的增殖能力，推测可能是SDF-1α通过ERK信号通路促进骨髓间充质干细胞的增殖，有待今后的研究中进一步得以证实和阐明。

实验利用Transwell小室进行骨髓间充质干细胞体外迁移实验，通过上调及下调SDF-1α基因，观察骨髓间充质干细胞在体外迁移的能力变化，结果显示，SDF-1α-BMSCs组骨髓间充质干细胞体外迁移的细胞数显著多于null-BMSCs组(P < 0.05)，而siRNA-BMSCs组低于null-BMSCs组(P < 0.05)。在加入抗SDF-1α干预后，可见各组骨髓间充质干细胞体外迁移的数量显著减少(P < 0.05)。因此推测，SDF-1α在骨髓间充质干细胞的迁移中可能起到重要的作用。目前研究证实，SDF-1与其受体CXCR4结合后可激活细胞内许多的下游信号转导通路，而其中最主要的通路有G蛋白依赖型信号通路和G蛋白非依赖型信号通路，最终影响到细胞的迁移、黏附和基因转录^[41]；同时有研究表明，SDF-1本身也可通过激活PI3K/Akt信号通路促进骨髓间充质干细胞的迁移，在给予蛋白激酶B激动剂或低氧诱导下，均被证实SDF-1通过PI3K/Akt信号通路促进骨髓间充质干细胞的迁移^[42]。实验着重研究过表达SDF-1α对骨髓间充质干细胞迁移能力的影响，而SDF-1α是通过哪些信号途径影响骨髓间充质干细胞的迁移？是否还有其他因子参与影响骨髓间充质干细胞的迁移？还需要进一步深入的研究。

综上所述，慢病毒载体可介导外源性基因SDF-1α在大鼠骨髓间充质干细胞中高效表达，并促进骨髓间充质干细胞的增殖和迁移。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程