黑色素瘤干细胞标志物研究及其相关治疗：认识与针对性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0406

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
肿瘤干细胞niche：又称为微环境，是一种特殊的存储干细胞的区域，肿瘤干细胞一旦离开其niche就会分化为祖细胞，进而发展为肿瘤细胞。Niche构成复杂，包括间充质细胞、淋巴细胞、细胞因子、细胞外基质、血管网络等多种成分。
肿瘤干细胞niche的作用：一方面它能够产生外源性因子，如Wnts，BMP，Notch等，用于维持干细胞的自我更新并调节其增殖和凋亡，另一方面它也能调控干细胞向祖细胞的分化，使得干细胞处于不同的分化状态。此外，niche还具有保护功能，使得肿瘤干细胞免受遗传毒性和药物毒性的损伤，从而产生对药物的抵抗性。Niche的数量相对有限，当肿瘤干细胞niche的数量增加时，niche内部的肿瘤干细胞群落也会随之增加，反之若niche数量减少则肿瘤干细胞群落也随之减少甚至消失。

摘要
背景：黑色素瘤是一种高度恶性的皮肤肿瘤，临床上缺乏有效的治疗手段。
目的：就目前已发现的黑色素瘤干细胞标记物及其相关的治疗手段做一综述。
方法：使用计算机在PubMed数据库和中国知网数据库检索2010年1月至2016年12月关于黑色素瘤干细胞标志物以及黑色素瘤干细胞治疗的相关文献，中文检索关键词为“黑色素瘤干细胞，标志物，治疗”，英文检索关键词“melanoma，cancer stem cell，marker，therapy”。
结果与结论：共纳入符合标准的文献40篇。利用肿瘤干细胞表面标志物从肿瘤组织中筛选和分离出肿瘤干细胞对研究肿瘤的生长发展、侵袭转移以及复发耐药的机制至关重要。黑色素瘤干细胞尚无公认的标记物，目前研究较多的有CD20、CD133、CD271、ABCB5和SOX10。黑色素瘤干细胞的相关治疗则主要集中在针对其表面标志物、异常信号通路和微环境等方面。当前，对黑色素瘤干细胞标记物的认识仍十分有限，且其相关性研究也存在着针对性不强的问题，需待更进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-5371-6198(吴星)

关键词: 黑色素瘤, 肿瘤干细胞, 标记物, 靶向治疗, CD133, CD271, ABCB5, 微环境, 信号通路, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: Melanomas, a highly malignant tumor of the skin, have no effective therapy to date.
OBJECTIVE: To review the melanoma stem cell markers identified and existing therapies.
METHODS: We retrieved database of CNKI and PubMed for articles addressing melanoma stem cell markers and targeted therapies, which were published from January 2010 to December 2016. The key words were “melanoma, cancer stem cell, marker, therapy” in Chinese and English, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: Forty articles were included in the final review. It is important to separate cancer stem cells from tumor cells by tumor stem cell markers for the study of tumor growth, recurrence, metastasis and drug resistance. There are still no generally recognized markers of melanoma stem cells, but the generally studied markers are CD20, CD133, CD271, ABCB5 and SOX10. To date, we have a poor understanding of melanoma stem cell markers, and further investigations on the markers and targeted therapies are warranted.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Melanoma, Neoplastic Stem Cells, Biological Markers, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

吴星，袁定芬. 黑色素瘤干细胞标志物研究及其相关治疗：认识与针对性[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(1): 152-157.

Wu Xing, Yuan Ding-fen. Melanoma stem cell markers and targeted therapies: awareness and pertinence[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(1): 152-157.

图/表（结果） 2

2.1 肿瘤干细胞 早在1867年就有人提出了肿瘤干细胞的概念，但是由于当时科学技术水平有限，未能分离出肿瘤干细胞。1977年在骨髓瘤细胞的体外软琼脂培养基克隆形成实验中，Hamhurger等^[4]发现只有不到0.2%的细胞能形成克隆，不到4%的细胞能在NOD/SCID小鼠脾内形成肿瘤，有人提出将这小部分具有成瘤能力的细胞称为肿瘤干细胞。1997年，Bonnet等^[5]首次从急性髓性白血病中分离出CD34⁺/CD38^-表型细胞，且将其移植至NOD/SCID小鼠可以引起急性髓性白血病的发生，而其他细胞均不能引起急性髓性白血病的发生，从而证实了肿瘤干细胞的存在。2001年，Reya等^[6]正式提出了肿瘤干细胞的概念。在肿瘤组织中存在着一小部分具有干细胞特性的肿瘤细胞亚群，它们具有自我更新能力以及多向分化潜能，在肿瘤的形成和生长过程中起着重要作用，称之为肿瘤干细胞^[7]。

2.2 肿瘤干细胞的起源 肿瘤干细胞起源目前尚未完全清楚，大致有以下3种学说：①肿瘤干细胞来源于成体干细胞。致癌性的突变使得正常成体干细胞内自我更新及分化增殖的调控机制过度激活从而转变为肿瘤干细胞。Lenkiewicz等^[8]证实脑肿瘤的肿瘤干细胞标志物CD133、nestin等与神经干细胞标志物相同。此外，部分乳腺癌的肿瘤干细胞表型也与其干细胞表型一致；②肿瘤干细胞来源于已分化的细胞(祖细胞甚至是终末分化细胞)。在外界因素的作用下，已分化的细胞可以去分化获得干细胞的特性，成为肿瘤干细胞。如转染MOZ-TIF2癌基因给祖细胞能够诱导产生急性髓性白血病；③肿瘤干细胞来源于细胞融合。Moore等^[9]发现在慢性幽门螺杆菌感染的C57BL/6小鼠中，造血干细胞选择性地迁移至胃上皮，诱导胃癌的发生，说明肿瘤干细胞可能由正常的干细胞和突变的分化细胞融合产生。

2.3 肿瘤干细胞的分离 当前最常用的筛选和分离肿瘤干细胞的方法是通过其细胞表面标记物利用流式细胞分选术或磁性活化细胞分选术进行^[10]。①流式细胞分选术，又称荧光活化细胞分选术，是利用ABCG2能够高效地将DNA荧光染料Hoechst33343泵出细胞外的特性，经流式细胞仪分选出Hoechst33343拒染的ABCG2高表达的侧群细胞。侧群细胞存在于大多数肿瘤细胞系中，拥有较强的生长繁殖能力并且具有多向分化潜能，因此不少研究者将侧群细胞作为部分肿瘤的肿瘤干细胞进行相关研究，如急性髓性白血病、脑肿瘤、前列腺癌、乳腺癌、肝癌、视网膜母细胞瘤等；②磁性活化细胞分选术，又称为免疫磁珠分选术，是利用磁珠免疫标记的特异性单克隆抗体与肿瘤干细胞表面特异性的抗原相结合，再在外部磁场的作用下，与特异性单克隆抗体结合的肿瘤干细胞经免疫磁珠吸附在磁式分选柱上，而未与特异性单克隆抗体结合的肿瘤干细胞则无法停留在磁场中，最后通过洗柱、收集，从而得到肿瘤干细胞。肺腺癌以及胶质瘤的肿瘤干细胞就是利用这种方法获得的。

2.4 黑色素瘤干细胞 随着对肿瘤干细胞相关研究的不断深入，人们在多种肿瘤组织和肿瘤细胞系中发现了肿瘤干细胞的存在，如乳腺癌、脑肿瘤、结肠癌等。Fang等在黑色素瘤中首次发现一种在胚胎干细胞培养基中表达CD20的无黏附力的球形细胞，其在一定的培养条件下可分化成黑素细胞、骨软骨形成细胞、脂肪形成细胞等多种细胞系，且在体外连续传代培养超过8个月后仍保持分化能力，说明其具有自我更新及多向分化潜能，被认为是黑色素瘤干细胞^[11]。SCID/NOD小鼠实验也证实黑色素瘤干细胞具有较强的成瘤能力。与定位于毛囊隆突部位的黑素干细胞对比研究更进一步揭示了黑色素瘤干细胞的生物学特性，如黑素干细胞的标志物CD133在黑色素瘤干细胞中表达增加，提示它们之间存在一定的联系。文辉才等^[12]利用无血清培养基培养人恶性黑色素瘤A375细胞系，获得黑色素瘤球体细胞(图1)，其具有干细胞特性，迁移能力和致瘤能力强，高表达免疫标记CD20、CD133，说明恶性黑色素瘤存在肿瘤干细胞。

2.5 黑色素瘤干细胞的标志物 利用肿瘤干细胞表面标志物从肿瘤组织中筛选和分离出肿瘤干细胞对研究肿瘤的生长发展、侵袭转移以及复发耐药的机制至关重要。尽管目前已研究发现的肿瘤干细胞表面标记物有很多，如脑肿瘤的CD133，卵巢癌的CD44等，但黑色素瘤干细胞尚无公认的标记物，现将常见的几种恶性黑色素瘤干细胞的表面标记物归纳如下^[13]，其功能见表1。

2.5.1 CD20 是一种非糖基化磷蛋白，通常表达于B淋巴细胞表面，对B淋巴细胞的增殖和分化都有调节作用。由于大部分的B淋巴细胞瘤表面都有CD20的表达，且其易与抗体结合并极少脱落，长期以来CD20是治疗B淋巴细胞瘤的理想靶点^[14]。随着黑色素瘤干细胞研究的不断深入，CD20再次以黑色素瘤干细胞标志物的身份进入了人们的视野。有研究发现在黑色素瘤细胞系中存在具有多能干细胞特性的细胞亚群，该亚群持续表达CD20。此外，将CD20⁺细胞植入SCID小鼠体内可形成肿瘤，并能分化成黑素细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞、间质细胞等多个细胞谱系^[15]。CD20⁺细胞占黑色素瘤细胞总数的比例并不多，只有2%左右，但利用抗CD20单克隆抗体靶向治疗黑色素瘤的疗效却较非靶向治疗的疗效更佳，提示CD20⁺黑色素瘤细胞可能是其发生发展的根源^[16]。近来Song等^[17]用包裹长春新碱抗CD20脂质体靶向杀伤WM266-4黑色素瘤细胞系，发现其细胞毒性明显强于游离的长春新碱，且未产生肿瘤耐药，说明CD20有可能成为未来治疗黑色素瘤的新靶点。

2.5.2 CD133 是目前研究较多、同时也争议较多的肿瘤干细胞标志物之一。CD133又称Prominin-1，最早是作为造血干细胞的特异性标志物被发现，但随后陆续发现CD133⁺细胞在脑胶质瘤、结肠癌、胰腺癌、肝癌等多种肿瘤中表现出类似干细胞的特性，提示CD133可能是肿瘤干细胞的一个重要标志物^[18]。研究发现只有CD133⁺细胞能使NOD/SCID小鼠形成肿瘤，而其他细胞均不能，说明这种细胞具有成瘤能力。此外，shRNA下调CD133会降低黑色素瘤细胞的增殖、克隆形成及迁移能力^[19]。Zimmerer等^[20]发现CD133⁺细胞可通过血管生成拟态、肿瘤特异性的微环境以及下游相关信号通路的激活等方式来促进黑色素瘤的生长。Madjd等^[21]也发现它与黑色素瘤的高侵袭性及不良预后密切相关。然而质疑声依然层出不穷，有研究者认为CD133的表达是由其启动子区域的GpG甲基化所调节，而启动子区域的GpG甲基化常在高分化的肿瘤中发生，因此GpG甲基化导致的CD133表达下调与其在肿瘤干细胞中的作用相关性不大。其次，在细胞分化过程中CD133的mRNA表达及其在细胞表面表达水平是不会随之改变的，但是随着干细胞的分化CD133却会随之发生糖基化，这使得其在已分化的细胞中被掩盖而不能被抗体检测到^[22]。因此，对于CD133是否能作为黑色素瘤干细胞的标志物，仍需进一步研究。

2.5.3 ABCB5 是ATP结合盒(ATP-binding cassette，ABC)转运蛋白家族中的一员，在CD133阳性的黑色素瘤细胞中高表达，被认为是黑色素瘤干细胞的标志物之一，并与黑色素瘤干细胞的化疗耐药密切相关。ABCB5介导阿霉素在黑色素瘤细胞中的外排转运，封闭ABCB5后能显著提高G3361黑色素瘤细胞中阿霉素的储积，使LD₅₀下降43%，从而导致G3361黑色素瘤细胞对阿霉素的耐药明显下降，说明ABCB5参与了黑色素瘤干细胞化疗耐药的机制^[23]。ABCB5与黑色素瘤转移也具有一定的相关性，Ma等^[24]在黑色素瘤患者的外周血中发现了ABCB5⁺循环黑色素瘤细胞，将该细胞移植至NOD/SCID/IL2小鼠可以使其产生远处转移，且转移程度与ABCB5⁺循环黑色素瘤细胞的数量成正比。近来又有研究发现ABCB5可能经IL-1β/IL8/CXCR1通路在黑色素瘤干细胞的多个环节发挥作用，包括：①表达CXCR1维持黑色素瘤干细胞的缓慢细胞周期；②分泌白细胞介素8维持黑色素瘤干细胞高致瘤性及分化潜能；③分泌白细胞介素8介导黑色素瘤对达卡巴嗪的耐药；此外，ABCB5⁺黑色素瘤干细胞还表达免疫共刺激/共抑制分子(如CTLA4、PD-1/PD-L1等)，提示ABCB5在黑色素瘤干细胞中作用复杂，值得更进一步研究^[25]。

2.5.4 CD271 又称为p75NTR，是一种低亲和力的神经生长因子受体(Low Affinity Nerve Growth Factor Receptor，LNNGFR0)，属于肿瘤坏死因子受体家族中的一员，在骨髓间充质干细胞、黑色素瘤细胞、滤泡树突状细胞等中均有表达，对神经组织的生长、发育及分化具有极其重要的作用。CD271常作为神经嵴干细胞(NCSC)的表面分子标记物，由于黑色素瘤干细胞具有与神经嵴干细胞相似的特性，因此CD271也被认为可能是黑色素瘤干细胞的标记物之一。研究证实CD271⁺黑色素瘤细胞确实较CD271^-黑色素瘤细胞更具有成瘤能力，且与黑色素瘤在体内转移尤其是在周围神经转移相关。此外，将CD271⁺黑色素瘤细胞在NOD/SCID小鼠中连续异种移植5次以上其仍具有自我更新及多向分化能力^[26]。用shRNA敲除CD271后黑色素瘤细胞迅速消失了其致瘤性、异质性及可塑性。全基因组分析也发现CD271⁺细胞表达干细胞相关基因OCT4、NANOG、NES等。同时有研究者认为CD271⁺黑色素瘤细胞的干细胞特性可能与CD271/SOX10网络有关，但具体机制目前尚未明确^[27]。部分研究对此持怀疑态度，他们发现尽管处于缓慢生长周期的CD271⁺黑色素瘤细胞具有较强的成瘤能力，但处于快速生长周期的CD271⁺黑色素瘤细胞成瘤能力却较弱，而且CD271在黑色素瘤细胞中的表达也并不稳定，作为标记物效率不高^[28]。

2.5.5 SOX10 SOX10基因位于染色体22q13.1，它与SOX8、SOX9共同组成SOXE，而SOXE是神经嵴发育所需的转录因子，因此它在调控神经嵴细胞的生存和保持神经嵴细胞的多向分化潜能中发挥了重要作用。近来也发现SOX10同样是在黑素细胞向恶性转化过程中的一个关键转录因子，它能调控小眼相关转录因子(MITF)的表达，而小眼相关转录因子在促进早期胚胎神经嵴发育为黑素细胞中至关重要^[29]。研究发现SOX10能直接与黑色素瘤抑制蛋白(MIA)的启动子结合，通过调节MIA增强黑色素瘤细胞的侵袭性。此外，它还能协同PAX3激活酪氨酸酶受体MET提高黑色素瘤细胞抗凋亡的能力^[30]。Shakhova等^[31]将表达SOX10的黑色素瘤细胞和shRNA介导SOX10沉默的黑色素瘤细胞分别注入NOD/SCID小鼠，发现SOX10组形成了肿瘤(11/14)，而SOX10沉默组没有形成肿瘤(0/16)，说明SOX10在黑色素瘤的形成中发挥了作用。同时，SOX10在黑色素瘤前哨淋巴结微转移灶的阳性率也接近于100%，明显强于S100、HMB45、melan A等其他黑色素瘤标志物，与黑色素瘤的转移密切相关^[32]。因此，SOX10有成为黑色素瘤干细胞标志物的潜力。

2.6 黑色素瘤干细胞的相关治疗 肿瘤干细胞具有极强的耐药性和DNA损伤修复能力，能够逃避放疗、化疗等常规的肿瘤治疗手段，是肿瘤复发和转移的根源。因此，黑色素瘤干细胞有望成为治疗黑色素瘤的新方向。

2.6.1 针对黑色素瘤干细胞表面标志物进行治疗 黑色素瘤干细胞表面特异性标志物的表达与其他细胞间存在差异，因此将其作为治疗靶点，不仅能消灭黑色素瘤干细胞，同时又能保护正常的细胞不受干扰，从而达到最佳疗效。Rappa等^[33]利用CD133单克隆抗体作用于EMX-I黑色素瘤细胞，发现其通过产生细胞毒作用抑制黑色素瘤细胞的增殖，从而减缓黑色素瘤的增长。同时也发现经shRNA介导EMX-I黑色素瘤细胞表面CD133的下调能减少黑色素瘤在肺部及脊髓的转移。Schatton等^[34]在异种移植形成黑色素瘤的裸鼠中应用ABCB5单克隆抗体，经58 d的观察发现其通过诱导抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependent cell mediated cytotoxicity，ADCC)抑制了黑色素瘤的生长。以上研究均证实了针对黑色素瘤干细胞表面标志物的治疗存在着巨大的潜能。然而，由于肿瘤干细胞具有能够产生不同细胞亚群的异质性，可能仅仅针对一种肿瘤干细胞表面标志物来进行治疗存在一定的缺陷，因此，研究者们正在尝试采用针对不同特异性表面标志物的组合方法来治疗黑色素瘤。

2.6.2 针对黑色素瘤干细胞异常信号通路的治疗 在许多研究肿瘤干细胞信号调控机制的研究中已经证实，是由于维持正常干细胞自我更新以及分化的信号通路中某些关键的基因发生突变导致通路过度激活或紊乱，从而促使了肿瘤的发生。黑色素瘤干细胞中的异常信号通路主要有Wnt、Hedgehog、Notch等，因此针对这些信号通路的靶向治疗极有可能是治疗黑色素瘤的可行性手段^[35]。阻断Wnt信号通路中关键基因β-catenin的过度激活或其抑制APC基因的失活可以降低β-catenin在细胞内的聚积，从而抑制肿瘤干细胞的自我更新以及增殖分化的能力，恢复肿瘤干细胞对于放化疗的敏感性。在Hedgehog信号通路中，当其通路成员发生突变或错误表达时，会激活该通路，经诱导上皮-间充质细胞的相互转换、介导基质-上皮细胞的相互作用以及调控干细胞自我更新，促进肿瘤的发展。有研究者将环杷明、GANT61等Hedgehog信号通路的抑制剂作用于黑色素瘤，发现 ALDH高表达的黑色素瘤干细胞数量显著减少，同时沉默Hedgehog信号通路的GLT1和SMO基因也发现了ALDH高表达的黑色素瘤干细胞显著减少^[36]。靶向Notch的单克隆抗体也是最近研究的热门，它能降低肿瘤组织中肿瘤干细胞的数量，同时又能抑制其致瘤性。但是长期使用有引起血管瘤的风险，必需间隔给药，防止其肠道毒性。

2.6.3 针对黑色素瘤干细胞微环境治疗 干细胞的微环境包括血管、间质细胞、炎症细胞、细胞因子、细胞外基质等，它是干细胞赖以生存的庇护所，使得干细胞免受分化刺激、凋亡刺激以及其他刺激的影响，与肿瘤的发生发展和复发转移密切相关^[37]。干细胞与干细胞微环境之间相互作用，能够产生多种生物学效应，包括：①干细胞经整合素、钙黏蛋白等黏附分子介导定位于干细胞的微环境；②干细胞微环境中的细胞因子可以调控干细胞的自我更新和增殖分化；③干细胞微环境为干细胞提供保护性环境，使其不受外界因素的干扰。一旦在某些因素的刺激下，干细胞微环境成分或者功能发生改变，就可以促使干细胞异常增殖并向恶性转归，从而发展为肿瘤干细胞，导致肿瘤的产生。因此，针对黑色素瘤干细胞微环境进行治疗显得至关重要。

SDF-1/CXCR4信号轴是黑色素瘤淋巴转移微环境中的重要组成部分，在化疗耐药的CD133⁺黑色素瘤细胞中联合应用CXCR4抑制剂AMD3100和达卡巴嗪可明显抑制黑色素瘤在淋巴结及肺部的转移^[38]。此外，有研究证实抗血管内皮生长因子的埃罗替尼和贝伐单抗可通过减少微环境中血管的数量抑制肿瘤生长。Hirsch等^[39]也发现二甲双胍可以影响转移微环境中黑色素瘤干细胞的动态分布进而改变肿瘤的恶性进程。所以，将黑色素干细胞微环境作为靶点在治疗黑色素瘤方面具有很好的前景。

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