脐带间充质干细胞条件培养液联合透明质酸修复小鼠皮肤损伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0405

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
透明质酸：又名玻尿酸，是一种酸性黏多糖，由D-葡萄糖醛酸、N-乙酰氨基-D-葡萄糖以β-1，3糖苷键和β-1，4糖苷键交替连接形成。透明质酸以其独特的分子结构和理化性质，广泛分布于人体各部位，在机体内具有调节血管壁通透性，调节蛋白质、水电解质的扩散及转运，促进创伤愈合等多种重要的生理功能，同时，因透明质酸具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被广泛应用于化妆品中。
皮肤损伤修复：皮肤损伤无时无刻不在发生，严重的烧伤或慢性溃烂严重影响患者的生活质量，甚至威胁生命。随着间充质干细胞研究的不断深入，为皮肤损伤修复提供了新的思路，将间充质干细胞分泌因子与传统的生物材料相结合，有利于进一步深层次研究干细胞在组织损伤修复中的作用机制，参与临床皮肤损伤的治疗。

摘要
背景：已有文献报道，间充质干细胞可通过分泌大量生物活性因子有效促进组织的损伤修复过程。
目的：观察脐带间充质干细胞条件培养液联合透明质酸修复小鼠皮肤损伤的效果。
方法：将40只BALB/c小鼠随机分成4组：生理盐水对照组、干细胞条件培养液组、透明质酸组、干细胞条件培养液+透明质酸凝胶组。全层皮肤切除当天即进行治疗，用无菌棉签分别蘸取生理盐水、脐带间充质干细胞条件培养液、透明质酸、脐带间充质干细胞条件培养液+透明质酸凝胶液各0.5 mL，均匀涂抹于皮肤创面上，每天早、中、晚各涂抹治疗1次，连续涂抹治疗7 d，测量创面的大小，计算创面愈合率。取干细胞条件培养液+透明质酸凝胶组和生理盐水对照组造模后第5天的创面组织，通过免疫组化和qRT-PCR实验检测损伤修复相关因子的表达。
结果与结论：①与生理盐水对照组相比，各治疗组创面面积均有不同程度缩小。脐带间充质干细胞条件培养液+透明质酸凝胶组创面愈合率明显高于其他治疗组(P < 0.01)；②与生理盐水对照组相比，干细胞条件培养液+透明质酸凝胶组血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶9蛋白呈强阳性表达；③脐带间充质干细胞条件培养液+透明质酸凝胶组血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β、基质金属蛋白酶9的mRNA表达明显高于生理盐水对照组(P < 0.01)；④结果表明，脐带间充质干细胞条件培养液联合透明质酸凝胶液能加速小鼠皮肤创面修复，治疗效果明显优于单纯使用干细胞条件培养液或透明质酸凝胶液。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-6529-8907(楼敏铭)

关键词: 干细胞, 脐带间充质干细胞, 条件培养, 透明质酸, 凝胶, 小鼠, 皮肤, 损伤创面, 修复

Abstract:

BACKGROUND: Numerous studies have shown that mesenchymal stem cells (MSCs) can effectively promote tissue repair by secreting various bioactive factors.
OBJECTIVE: To observe the effects of umbilical cord cord mesenchymal stem cells conditioned media (UCMSCs-CM) combined with hyaluronic acid (HA) on the repair of skin wounds in mice.
METHODS: The UCMSCs-CM was collected, and added with HA to prepare the gel solution. Forty mice were selected to prepare animal models of full-thickness skin wound. According to different treatments, the mice were randomly divided into four groups, blank control group (0.5 mL of normal saline), UCMSCs-CM group (0.5 mL of UCMSCs-CM), HA group (0.5 mL of HA), UCMSCs-CM+HA group (0.5 mL of UCMSCs-CM+0.5 mL of HA). Each mouse received three treatments a day (in the morning, at noon and at night), for continuous 7 days. The wound size was measured and the wound healing rate was calculated. The factors related to skin repair were detected by immunohistochemstry and qRT-PCR methods.
RESULTS AND CONCLUSION: After treatment, the wound size was reduced to different extents in the treatment groups as compared with the blank control group. The UCMSCs-CM combined with HA significantly improved the wound healing rate as compared with the other groups (P < 0.01). Strongly positive expression of the factors related in skin injury, such as vascular endothelial growth factor and matrix metalloproteinase 9 protein, were found in the UCMSCs-CM+HA group; moreover, the mRNA levels of basic fibroblast growth factor, transforming growth factor β and matrix metalloproteinase 9 protein were significantly higher in the UCMSCs-CM+HA group than the blank control group (P < 0.01). To conclude, UCMSCs-CM combined with HA can accelerate skin wound repair in mice, and exhibit better effects than the UCMSCs-CM or HA alone, which provides theoretical support for stem cells combined with biological scaffolds in skin wound repair.

Key words: Umbilical Cord, Mesenchymal Stem Cells, Culture Media, Conditioned, Hyaluronic Acid, Skin, Wounds and Injuries, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

楼敏铭，王宏伟，马洁. 脐带间充质干细胞条件培养液联合透明质酸修复小鼠皮肤损伤[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(1): 20-25.

Lou Min-ming, Wang Hong-wei, Ma Jie. Umbilical cord mesenchymal stem cell conditioned medium combined with hyaluronic acid for mouse skin repair[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(1): 20-25.

图/表（结果） 1

2.1 脐带间充质干细胞的分离培养与鉴定 脐带沃顿胶组织贴壁培养8 d左右时，可见组织块周围有细胞爬出，且呈放射状生长；培养至第16天，镜下可见较多形态均一，呈纤维状、漩涡状生长的细胞，见图1A。

当细胞生长至80%-90%融合时，进行消化传代培养，取生长状态良好的第3代细胞进行流式分析，检测培养细胞表面标志物的表达。结果显示细胞高表达CD73、CD90、CD105(>95%)，极低表达CD14、CD19、CD34、CD45、HLA-DR(<0.5%)，符合间充质干细胞的特性，见图1B。

2.2 实验动物数量分析 小鼠造模以及涂抹治疗过程中均无死亡，进入结果分析40只小鼠。

2.3 小鼠创面愈合率 涂抹第7天，与生理盐水对照组相比，各治疗组创面面积均有不同程度的缩小，其中干细胞条件培养液+透明质酸凝胶治疗组的创面几乎完全愈合，见图2A。分别计算治疗第3天和第5天的创面愈合率，结果显示，干细胞条件培养液+透明质酸凝胶治疗组的创面愈合率明显高于其他治疗组，见图2B。

2.4 干细胞条件培养液和透明质酸凝胶液对小鼠创面组织损伤修复相关因子表达的影响 由于干细胞条件培养液+透明质酸凝胶组创面愈合效果显著优于其他治疗组，因此，取干细胞条件培养液+透明质酸凝胶组和生理盐水对照组第5天的创面组织，通过免疫组化检测损伤修复相关因子的表达，进一步探究其作用机制。免疫组化结果显示，与生理盐水对照组相比，干细胞条件培养液+透明质酸凝胶组血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶9蛋白呈强阳性表达(图3A)，且血管内皮生长因子在上皮细胞和表皮细胞均呈强阳性表达，基质金属蛋白酶9在基质中呈强阳性表达。

取干细胞条件培养液+透明质酸凝胶组和生理盐水对照组第5天的创面组织，qRT-PCR检测血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、转化生长因子β、基质金属蛋白酶9 mRNA的表达，结果显示，与生理盐水对照组相比，干细胞条件培养液+透明质酸凝胶组除表皮生长因子的表达上调无统计学意义外，血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β、基质金属蛋白酶9 mRNA的表达均上调且差异有显著性意义(图3B)。

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引言

创伤、大面积烧伤、糖尿病或其他慢性疾病等均会造成严重的皮肤组织缺失，目前临床上常用自体、异体皮肤移植或通过组织工程人工替代物等方法进行修复，但这些方法存在供区新的创伤、供体来源有限和免疫排斥等问题。因此，皮肤损伤修复一直是亟需解决的问题。近年来，随着干细胞技术的不断发展，间充质干细胞在皮肤损伤修复方面的应用备受关注^[1-4]。

脐带来源间充质干细胞因其取材方便、免疫原性低、不存在伦理学争议等特点，被广泛应用于科学研究^[5-6]。研究表明，脐带间充质干细胞培养上清中含有多种分泌因子，主要包括3大类：第一类，细胞外基质成分，如各种胶原蛋白和弹性蛋白等；第二类，生长因子类，如转化生长因子、肝细胞生长因子、血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子等；第三类，炎症因子及趋化因子类，如前列腺素E2、白细胞介素6、白细胞介素8等，可通过旁分泌途径在损伤修复、组织再生、机体免疫调节等方面具有重要作用^[7-10]。

透明质酸又称玻尿酸，是由D-葡萄糖醛酸、N-乙酰氨基-D-葡萄糖以β-1，3糖苷键和β-1，4糖苷键交替连接形成的直链高分子酸性黏多糖，1934年由美国哥伦比亚大学眼科教授Meyer和Palmer在牛眼晶状体中发现^[11-13]。透明质酸广泛分布于生物体内，在皮肤、脐带、脑、软骨和关节滑液等组织中均有分布，是大多数结缔组织的重要细胞外成分之一，参与组织的损伤修复过程。由于透明质酸具有很好的生物可吸收性、生物相容性、保水性等特性，以及无抗原性、通常不发生免疫排斥反应等特点，被广泛应用于医药、食品和化妆品、组织工程等领域^[14-17]。

将透明质酸凝胶及脐带间充质干细胞条件培养液联合应用于皮肤损伤，旨在将两者修复过程中的作用最大化，在方便涂抹治疗的同时，干细胞条件培养液中的各种因子也能更好地作用于受损皮肤，发挥作用。

实验制备全层皮肤切除小鼠模型，首次将脐带间充质干细胞条件培养液与透明质酸配制成凝胶状液体，将其涂抹于创面，观察其修复小鼠皮肤损伤的效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 随机对照分组实验。

1.2 时间及地点 于2016年3至10月在天津市康婷生物工程有限公司完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 健康雌性BALB/c小鼠40只，8周龄左右，体质量30-40 g，购于北京市维通利华实验动物技术有限公司。按治疗药物不同，将40只小鼠随机分成4组：生理盐水对照组、脐带间充质干细胞条件培养液组、透明质酸凝胶组、脐带间充质干细胞条件培养液+透明质酸凝胶组，每组10只。

1.3.2 实验用试剂和仪器 α-MEM培养基(Hyclone公司)；血清替代物UItraGTO^TM(美国Helios公司)；透明质酸钠(山东福瑞达公司)；兔抗鼠血管内皮生长因子抗体(Abcam公司)；DAB显色试剂盒(碧云天公司)；Trizol(Invitrogen公司)；M-MLV反转录酶、Real-time PCR试剂盒(TaKaRa公司)；细胞培养瓶(Corning公司)；电子天平(梅特勒公司)；二氧化碳培养箱(Thermo公司)；倒置显微镜(Nikon公司)；流式细胞仪CantoⅡ(美国BD Biosciences)；离心机ST16R(Thermo公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 脐带间充质干细胞的分离与培养 取健康剖宫产孕妇脐带组织(产妇本人签署知情同意书，申明所取脐带仅可用于科学研究)。将脐带在超净台内剪成3-5 cm小段，用生理盐水充分洗涤，去除脐静脉及动脉内的残存血液，剔除静脉、动脉。将脐带沃顿胶剪碎成0.5-1.0 mm³的组织块，均匀平铺在T75培养瓶底部，置于37 ℃，饱和湿度，体积分数为5% CO₂培养箱中，一两个小时后，待组织块略干燥能牢固贴于瓶壁上时，缓慢加入10 mL含5%血清替代物的α-MEM培养基，使培养液浸泡组织块，放入培养箱中，每隔7 d换液1次，待细胞克隆长至80%-90%融合时，用0.05%胰酶消化传代至新培养瓶中。

1.4.2 流式鉴定 取生长状态良好的第3代脐带间充质干细胞，消化，PBS清洗细胞2次，1 000 r/min离心10 min；PBS重悬细胞，分装至流式管，每管1×10⁶个细胞，加入1 mL血清，室温固定细胞30 min；2 000 r/min离心6 min，弃上清，加入流式抗体标记细胞，室温避光孵育30 min，每管加1 mL PBS，2 000 r/min离心6 min，清洗细胞2遍，流式细胞仪检测。

1.4.3 脐带间充质干细胞条件培养液的制备 取生长状态良好的第3代脐带间充质干细胞铺至T75细胞培养瓶中，待细胞生长至70%-80%融合度时，弃去原培养基，加入8 mL PBS清洗细胞表面，重复清洗3次，吸尽残留的PBS，加入10 mL无血清替代物的α-MEM培养基继续培养，72 h后收集培养上清液，离心后用0.22 µm滤膜过滤，-20 ℃保存。

1.4.4 脐带间充质干细胞条件培养液和透明质酸混合凝胶液的制备 称取1 mg透明质酸粉末，加入至1 mL脐带间充质干细胞条件培养液中，漩涡振荡使其充分溶解，制成凝胶状液体。

1.4.5 小鼠皮肤损伤模型的制备 用1%戊巴比妥钠按50 mg/kg的剂量腹腔注射麻醉小鼠，剪短小鼠背部脊椎两侧被毛，用8%硫化钠脱毛，脱毛位置用碘酒进行消毒，用沾有印泥的直径为8 mm的圆筒在脱毛位置印上圆环，用镊子夹起圆环中心皮肤，沿圆环剪除全层皮肤，形成机械损伤创面，模型制备当天记为第0天。造模完成后，进行单笼饲养。

1.4.6 治疗 全层皮肤切除当天即进行治疗，用无菌棉签分别蘸取生理盐水、干细胞条件培养液、透明质酸、干细胞条件培养液+透明质酸凝胶液各0.5 mL，均匀涂抹于小鼠的皮肤创面上，直至被创面全部吸收，每天早、中、晚各涂抹治疗1次，连续涂抹治疗7 d。

1.4.7 创面愈合率测定 每隔1 d用游标卡尺测量小鼠创面的大小，计算创面面积和创面的愈合率，创面的愈合率= (治疗前创面大小-治疗后创面大小)/治疗前创面大小× 100%。

1.4.8 免疫组化 取造模后第5天的创面皮肤组织进行石蜡切片固定及包埋，经切片、拷片(65 ℃，2 h)、脱蜡、水化后，用山羊血清封闭30 min，滴加一抗(兔抗鼠血管内皮生长因子，基质金属蛋白酶9抗体)后4 ℃孵育过夜、PBS冲洗后滴加二抗(HRP标记山羊抗鼠二抗)37 ℃孵育1 h，PBS冲洗后，DAB显色，镜下掌握显色程度，自来水冲洗，苏木精复染2 min，自来水冲洗，盐酸乙醇分化3次，每次2 s，自来水冲洗，分别置于梯度乙醇(体积分数为50%，70%，85%，95%，100%)浸泡0.5-1.0 min，置于二甲苯中浸泡10 min，更换二甲苯后再浸泡10 min，滴加1或2滴中性树胶，盖玻片从一端倾斜盖下，防止气泡产生，显微镜观察拍照。

1.4.9 qRT-PCR 取造模治疗后第5天的创面皮肤，放入组织研磨器中，加一定量的液氮研磨，待组织充分研磨后，加入1 mL Trizol，提取创面皮肤组织总RNA并反转录成cDNA，实时定量PCR扩增目的片段，同时扩增GAPDH作为内参。引物序列如下：血管内皮生长因子：正义5’-TAT TCA GCG GAC TCA CCA GC-3’，反义5’-AAC CAA CCT CCT CAA ACC GT-3’；碱性成纤维细胞生长因子：正义5’-CCG AAC AAG GCT CTT CCT CCT-3’，反义5’-CAT CCC GCA GCC AGT TGA T-3’；转化生长因子β：正义5’-AGG GCT ACC ATG CCA ACT TC-3’，反义5’- CCA CGT AGT AGA CGA TGG GC-3’；表皮生长因子：正义5’- GTT AGC ACC ATC CCT CAT CCC-3’，反义5’- AGG CTC CGG GAG AGT TCT TT-3’；基质金属蛋白酶9：正义5’- CCA GCC GAC TTT TGT GGT CT-3’；反义5’- CTT CTC TCC CAT CAT CTG GGC-3’；GAPDH：正义5’- ACC CAG AAG ACT GTG GAT GG-3’，反义5’-CAC ATT GGG GGT AGG AAC AC-3’。结果以相对GAPDH的表达量显示。

1.5 主要观察指标 ①脐带间充质干细胞的形态学特征；②小鼠创面愈合率；③创面组织中修复相关因子的表达。

1.6 统计学分析 组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t 检验，统计所用软件为SPSS 17.0，P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义。

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讨论

皮肤创面修复是一个复杂而有序的生物学过程，主要包括止血期、炎症期、增生期及细胞外基质的重塑等一系列连续过程。其中涉及多种细胞和生长因子的参与和互相协调。感染、组织缺氧等因素影响创面的修复过程，导致修复时间延长或创面的难以愈合，因此，如何加快创面的愈合及提高创面的愈合质量仍是临床组织修复领域急需解决的一大难题^[18-19]。

间充质干细胞是广泛存在于骨髓、脐带、脂肪、牙髓等组织的一类成体干细胞，具有多向分化潜能，在特定培养条件下，可以向软骨细胞、骨细胞、脂肪细胞等细胞诱导分化^[20-21]。近年来，随着对间充质干细胞的不断研究深入，发现间充质干细胞可向损伤组织定向迁移，参与组织的损伤修复过程，其机制可能与间充质干细胞的多向分化、旁分泌多种细胞因子及抗炎等作用有关^[22-26]。因此，干细胞移植作为一种新型的治疗手段为组织修复带来了希望^[27]。

脐带间充质干细胞由于其来源简单，不受伦理道德及法律的制约，被广泛应用于科学研究^[28-29]。实验采用组织贴块的方法分离培养获得脐带源间充质干细胞，经流式细胞术检测显示脐带间充质干细胞高表达CD73、CD90、CD105，极低表达CD14、CD19、CD34、CD45、HLA-DR，且体外诱导能向成骨和成脂细胞分化(结果未显示)，符合间充质干细胞的特性。收集饥饿培养72 h的脐带间充质干细胞条件培养液，与透明质酸混合配制成凝胶液，用于小鼠全层皮肤切除的治疗。结果显示脐带间充质干细胞条件培养液+透明质酸凝胶组能显著缩短小鼠创面的愈合时间，提高创面愈合率，促进损伤创面的修复，且效果明显优于单纯使用干细胞条件培养液或透明质酸。

血管内皮生长因子是体内最强的血管生成因子，在组织修复过程中，通过诱导血管内皮细胞的增殖和迁移，促进血管的生成，为组织修复提供营养，与创面的愈合密切相关^[30-32]。基质金属蛋白酶9一方面可以降解和重塑细胞外基质的动态平衡，另一方面，基质金属蛋白酶9还可通过促进血管内皮生长因子的表达，参与血管生成。与生理盐水对照组相比，干细胞条件培养液+透明质酸凝胶组小鼠创面皮肤组织中血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶9均呈强阳性表达，同时促进血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β、基质金属蛋白酶9 mRNA的表达，提示脐带间充质干细胞条件培养液联合透明质酸凝胶液可能通过增强创面组织的血管形成及其他相关因子的表达，从而促进皮肤创面的愈合，但其具体机制仍有待于进一步研究。

综上所述，脐带间充质干细胞条件培养液联合透明质酸凝胶液能加快创面的愈合速度，提高创面的愈合率，并通过激活创面组织中血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶9的表达，促进创面组织血管的形成，同时，促进其他相关因子的表达，加速创面愈合，为开发新型创伤修复膏及临床治疗慢性创面的修复提供新的方法及依据。

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