中药骨痹通消颗粒干预激素性股骨头坏死模型兔的细胞凋亡

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0303

摘要/Abstract

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文题释义：
骨痹通消颗粒：一种中药颗粒，立足中医补肾生骨、通血活络、骨筋并重等治疗理论，选择从整体上调节机体的内环境，进而达到补肾壮骨，活血通络等功效，用来对股骨头坏死等骨科疾病的治疗。
激素性股骨头坏死：是因长期大剂量应用糖皮质激素而引起的，以骨的活性成分(骨细胞，骨髓造血细胞及脂肪细胞)死亡为主要病理改变的病理过程不可逆转，最终导致股骨头塌陷，髋关节疼痛，功能障碍，致残率高，属骨伤科的难治之症。

摘要
背景：股骨头坏死属于中医“骨痿”范畴，其疼痛是风寒瘀血阻滞造成的。而中药骨痹通消颗粒具有补肾壮骨、活血通络等功效，临床应用有效果，但其治疗机制尚不清晰。
目的：分析中药骨痹通消颗粒对激素性股骨头坏死的治疗效果，并研究其对细胞凋亡的影响，为中药骨痹通消颗粒的临床应用提供一定的实验依据。
方法：纳入54只健康家兔，随机分为对照组、模型组和治疗组，每组18只。对照组不作处理，模型组与治疗组均制备激素性股骨头坏死模型，造模成功后模型组生理盐水灌胃，治疗组给予骨痹通消颗粒灌胃治疗，1次/d，持续12周。治疗后4，8，12周，各组分别处死6只动物，取出双侧股骨头，检测股骨头坏死空骨陷窝率、细胞凋亡指数，并置于光镜下进行观察。
结果与结论：①治疗后不同时间点对照组与治疗组股骨头坏死空骨陷窝率显著低于模型组(P < 0.05)；②光镜观察可见，对照组的股骨头坏死空骨陷窝情况基本维持不变；模型组第 4 周时存在明显的骨空陷窝，并随着时间的延长，数量逐渐增多，断裂现象明显；治疗组第 4 周时存在一定的骨空陷窝，随时间延长，空骨陷窝进一步减少；③治疗后不同时间点，对照组与治疗组的细胞凋亡指数显著低于模型组(P < 0.05)；④结果提示，中药骨痹通消颗粒治疗激素性股骨头坏死家兔模型效果显著，可有效减少细胞凋亡，并改善坏死部位的病理变化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-1134-635X(周正新)

关键词: 激素性股骨头坏死, 中药骨痹通消颗粒, 细胞凋亡指数, TUNEL法, 空骨陷窝, 甲基强的松龙

Abstract:

BACKGROUND: Osteonecrosis of the femeral head (ONFH) is an atrophic debility of bones in Chinese medicine, the pain of which is caused by cold-induced blood stasis. Gubi Tongxiao Granule has the effects of reinforcing the kidney to strength the bone and promoting blood circulation to remove obstruction in the channels. Its clinical efficacy is satisfactory, but the underlying mechanism is unclear.
OBJECTIVE: To explore the curative efficacy of Gubi Tongxiao Granule for steroid-induced ONFH, and its effect on cell apoptosis, thus providing references for its clinical application.
METHODS: Fifty-four healthy rabbits were randomly divided into model, treatment and control (no intervention) groups (n=18 per group). The animal model of steroid-induced ONFH was established in the modeling and treatment groups, and then administered normal saline and Gubi Tongxiao Granule via gavage, respectively, once daily, for 12 consecutive weeks. At 4, 8 and 12 weeks after treatment, six animals in each group were sacrificed, and the bilateral femoral heads were removed. The empty bone lacuna rate and apoptotic index were determined, and the histological changes were observed under light microscope.
RESULTS AND CONCLUSION: The empty bone lacuna rate in the control and treatment groups was significantly lower than that in the model group at different time points after treatment (P < 0.05). There was no obvious change in necrotic empty bone lacuna in the control group. At 4 weeks after treatment, the empty bone lacunas were obvious in the model group, and increased in numbers and even broken with time increasing. At 4 weeks after treatment, empty bone lacunas were visible and increased in numbers in the treatment group. The apoptotic index in the control and treatment groups was significantly lower than that in the model group (P < 0.05). These results indicate that Gubi Tongxiao Granule is effective for steroid-induced ONFH in rabbits, can effectively inhibit cell apoptosis and improve the pathological changes of the necrotic area.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Drugs, Chinese Herbal, Models, Animal, Femur Head Necrosis, Apoptosis, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

周正新，李文华，朱磊，韩士鼎. 中药骨痹通消颗粒干预激素性股骨头坏死模型兔的细胞凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(20): 3190-3194.

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图/表（结果） 1

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引言

股骨头坏死病程进展快，致残率较高，是骨科领域常见的难治性疾病，严重降低了人们的生活质量^[1]。股骨头坏死可以分为不同的类型，包括创伤性以及非创伤性，其中，激素性股骨头坏死是一种十分常见的非创伤性股骨头坏死^[2]。随着临床治疗过程中各种糖皮质激素等的广泛应用，导致大量激素积累与人体中，引发激素性股骨头坏死的出现^[3]。随着医疗技术的飞速发展，激素药物在临床应用也越来越广泛，比如说激素药物在治疗血液疾病、呼吸系统疾病、肾病、皮肤病等方面的疾病时，都有着很好的疗效。但在药物使用过程中，许多患者会忽视其不良反应^[4]。对于长期服用激素的药物患者来说，尤为要预防股骨头坏死的发生。

近年来，众多中医理论与疗法开始被积极的应用于激素性股骨头坏死的临床治疗之中^[5-8]。以往的一些研究发现，激素性股骨头坏死的发生与发展过程，与细胞凋亡存在十分密切的联系^[9-10]。但是，关于该病中医治疗的研究中，大多侧重于对相关治疗方案、临床效果等的分析研究，针对不同中药治疗激素性股骨头坏死对细胞凋亡的影响，相关的研究和报道相对较少。

股骨头坏死主要疼痛症状可为隐性钝痛，急性发作可出现剧痛，究其原因是风寒瘀血阻滞造成的“不通则痛”。中医认为股骨头坏死的原因为外因和内因，且内因外因相互作用，使人体阴阳失去平衡，气血的失恒及暴力所伤，六淫所伤，邪毒所伤，先天禀赋不足，后天失养，劳伤过度而生疾，亦称髀枢痹、骨痹、骨萎。中药骨痹通消颗粒对动物模型进行治疗的过程中，立足中医补肾生骨、通血活络、骨筋并重等治疗理论，选择从整体上调节机体的内环境，进而达到补肾壮骨，活血通络等功效，最终获得良好的治疗效果，改善动物体内的骨头坏死空骨陷窝率等指标。为此，当前研究选择制备的激素性股骨头坏死家兔模型，分析中药骨痹通消颗粒对模型的治疗效果，并研究其对细胞凋亡的影响，进而为中药骨痹通消颗粒的临床应用提供一定的实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点于2018年1月至4月在安徽中医药大学第一附属医院实验中心完成。

1.3 材料

实验动物：54只健康成年雄性家兔，体质量为0.8- 1.5 kg，由安徽中医药大学第一附属医院实验中心提供，批号为20170604。均置于相同的环境下适应性饲养。

实验药物：丹参15 g、川芎10 g、当归10 g、赤芍12 g、淫羊藿12 g、川断10 g、何首乌12 g、补骨脂15 g、肉桂4 g、土鳖虫10 g、水蛭3 g和甘草6 g，由安徽中医药大学第一附属医院制成骨痹通消颗粒。

实验试剂及仪器：糖皮质激素甲基强的松龙，青霉素钠均购自安徽中医药大学第一附属医院药房。光学显微镜(上海信裕生物技术有限公司)、计算机全自动脱水机(上海信裕生物技术有限公司)、切片机(上海常斤生物科技有限公司)、隔水式电热恒温培养箱(国药控股湖南有限公司)、病理组织漂烘仪(北京中山生物技术有限公司)、DAB显色剂(上海威奥生物科技有限公司)、枸橼酸缓冲液(武汉博士德生物工程有限公司)、伊红(深圳市博林达科技有限公司)、苏木素(上海晶天生物科技有限公司)；凋亡细胞检测试剂盒(Biotium，美国)。

1.4 方法

1.4.1 实验分组对入组动物按照数字表法随机分为3组，其中对照组18只，模型组18只，治疗组18只。

1.4.2 激素性股骨头坏死模型的制备^[11-12] 对照组作为对比标准，正常饲养不作特殊处理。模型组与治疗组均制备激素性股骨头坏死模型。模型制备方法为：对兔右臀部进行剃毛，对局部皮肤进行常规消毒，应用马血清 10 mL/kg，经兔耳缘静脉注射，间隔3周后，马血清减量为7.5 mL/kg，经兔耳缘静脉再次注射；间隔2周后。腹腔注射甲基强的松龙(45 mg/kg)连续3 d，1次/d之后 7.5 mg/kg，1次/周，连续10周，每次注射前均对动物进行体质量测量。每周均于动物左臀部肌注青霉素钠以预防感染，注射剂量每只4x10⁴ U，连续干预10周。

1.4.3 分组处理造模制备成功后模型组实施生理盐水定期灌胃，治疗组实施中药骨痹通消颗粒治疗，按动物与人每千克体质量等效剂量折算系数W=3.3×兔体质量×(人剂量/人体质量)。治疗组：骨痹通消颗粒灌胃，344 mg/kg；模型组：10 mL生理盐水灌胃。均对动物实施药物灌胃操作，1次/d，持续12周。

1.4.4 标本采集治疗后4，8及12周，各组耳缘静脉注射空气栓塞法分别处死6只动物。取出双侧股骨头，迅速放入40 g/L多聚甲醛中予以固定处理^[14]。之后，使用体积分数10% EDTA进行脱钙处理，并进行石蜡包埋，使用切片机制备组织切片。检测股骨头坏死空骨陷窝率，在100倍放大倍率下，随机选5个视野，每个视野计数50个骨陷窝，分别数出空缺骨陷窝数，求出空缺骨陷窝占骨陷窝的百分数，即为空缺骨陷窝率。并置于光镜下进行观察^[15-16]。

1.4.5 细胞凋亡情况检测^[17-18] 按细胞凋亡检测试剂盒说明的方法进行。对所获得各组动物组织标本利用PBS进行洗涤，洗涤结束后使用40 g/L多聚甲醛进行固定处理。常规制备组织切片，使用凋亡细胞检测试剂盒，利用TUNEL法进行细胞凋亡检验。严格按照试剂盒的说明书进行各项操作。利用DAB显色试剂盒进行显色处理，并使用苏木精实施复染。获得理想染色效果之后，置于高倍视野(×400)下进行观察。观察切片情况，进行相应的细胞计数，并计算不同切片的细胞凋亡指数。在100倍放大倍率下，随机选5个视野，每个视野计数50个骨细胞，分别数出凋亡骨细胞数，求出凋亡骨细胞占骨细胞的百分数，即为骨细胞凋亡率。

1.5 主要观察指标 ①各组细胞空骨陷窝率；②股骨的组织学观察；③各组细胞凋亡指数。

1.6 统计学分析应用SPSS 19.00软件进行统计处理。计量资料的表示方法为x(_)±s，组间比较使用方差分析中的 SNK-q方法。计数资料的表示方法为n(%)，组间比较实施χ²检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

近年来，中医理论与疗法开始被积极的应用于激素性股骨头坏死的治疗之中。在中医古籍中并没有发现激素性股骨头坏死的病名记载，该病通常按照“痹病”来辨证论治，据其病位，病机和临床证候特点，被认为应属于祖国医学中“骨蚀”、“骨痿”等范畴。田能等^[19]在对激素性股骨头坏死患者进行治疗的过程中，选择使用健脾活血方进行治疗，观察发现，其可显著改善患者体内血管内皮生长因子的表达水平，获得理想的治疗效果。当前研究结果显示，治疗4，8，12周，对照组的股骨头坏死空骨陷窝率基本维持不变，模型组的骨陷窝率呈现出不断提高的情况，治疗组骨陷窝率呈现出不断下降的情况。表明中药骨痹通消颗粒治疗激素性股骨头坏死家兔模型可以有效改善动物坏死部位组织形态学情况。中药骨痹通消颗粒对动物模型进行治疗的过程中，立足中医补肾生骨、通血活络、骨筋并重等治疗理论，选择从整体上调节机体的内环境，进而达到补肾壮骨，活血通络等功效，最终获得良好的治疗效果，改善动物体内的骨头坏死空骨陷窝率等指标。

有学者研究发现，激素性股骨头坏死与细胞凋亡之间存在十分密切的联系^[20]。细胞内存在的众多因子产生生化改变，通过酶激活、特定基因调控、相应信号转导等方式进行共同调节，最终使细胞产生凋亡。细胞凋亡过程受多种不同基因及蛋白合成调控，属主动性死亡^[21]。在当前研究中，即利用TUNEL技术，对不同组别动物的组织标本细胞凋亡情况进行准确的统计和比较。相应的实验结果显示，治疗后不同时间点对照组与治疗组细胞凋亡指数显著低于模型组。提示，利用中药骨痹通消颗粒对激素性股骨头坏死家兔模型进行治疗，可以有效减少动物模型股骨头处的细胞凋亡情况。分析激素性股骨头坏死的病理情况，在大量应用激素之后，会对机体骨细胞以及成骨细胞的凋亡产生一定的影响，加快其凋亡，进而导致机体出现骨质疏松等一系列症状^[22-24]。针对激素性股骨头坏死患者，受到其体内骨细胞凋亡情况的影响，会导致成骨细胞以及破骨细胞的相互偶联作用出现异常改变，发生一定的功能缺陷。这一情况下，破骨细胞无法被完全被激活，骨质吸收出现异常。相应的，紧随其后的由成骨细胞介导的骨质重建过程也会明显受阻。而通过对患者实施一定的中药骨痹通消颗粒治疗，依据活血、祛瘀及生新的原则，提出了活血化瘀、补肾壮骨的治法^[25-29]，有效的缓解激素引起的血管内皮损害、降低血黏稠度、抑制血小板聚集、明显改善患者凝血功能和微循环，进而显著改善患者体内的细胞凋亡情况，有效抑制细胞凋亡^[30-35]。

综上所述，当前动物实验可以初步证实，中药骨痹通消颗粒治疗激素性股骨头坏死家兔模型效果确切。该治疗方案在减少细胞凋亡，改善动物坏死部位组织形态学等方面具有肯定的效果，可以为药物的临床应用提供一定的参考依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程