激素联合脂多糖诱导股骨头缺血坏死模型兔的骨质变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.28.015

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (28): 4518-4522.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.28.015

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激素联合脂多糖诱导股骨头缺血坏死模型兔的骨质变化

喻钧伦¹，唐曦²，黄雨²，杨璐希²，吴少平²

¹德阳市人民医院放射科，四川省德阳市 618000；²成都医学院第一附属医院放射科，四川省成都市 610500

修回日期:2017-07-22 出版日期:2017-10-08 发布日期:2017-11-10
通讯作者: 吴少平，硕士，教授，成都医学院第一附属医院放射科，四川省成都市 610500
作者简介:喻钧伦，男，1988年生，四川省邛崃市人，2015年重庆医科大学毕业，硕士，医师，主要从事影像诊断工作。
基金资助:
四川省教育厅资助项目(15ZB0243)

Changes in bone mineral density in a rabbit model of steroid-induced osteonecrosis of the femoral head

Yu Jun-lun¹, Tang Xi², Huang Yu², Yang Lu-xi², Wu Shao-ping²

¹Department of Radiology, People’s Hospital of Deyang City, Deyang 618000, Sichuan Province, China; ²Department of Radiology, the First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College, Chengdu 610500, Sichuan Province, China

Revised:2017-07-22 Online:2017-10-08 Published:2017-11-10
Contact: Wu Shao-ping, Master, Professor, Department of Radiology, the First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College, Chengdu 610500, Sichuan Province, China
About author:Yu Jun-lun, Master, Physician, Department of Radiology, People’s Hospital of Deyang City, Deyang 618000, Sichuan Province, China
Supported by:
the Project of Sichuan Provincial Education Department, No. 15ZB0243

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
骨体积分数(BV/TV)：又称相对骨体积，即BV(骨体积)与TV(选取ROI体积)的比值，单位%，是描述松质骨微结构的一个非常重要的参数。根据Micro-CT图像重建的三维图形数据，通过选取合适的阈值，就可以获取可靠的骨体积分数。
显微CT(micro computed tomography，微计算机断层扫描技术)：又称微型CT、小动物CT，是一种非破坏性的3D成像技术，可以在不破坏样本的情况下清楚了解样本的内部显微结构。它与普通临床的CT最大的差别在于分辨率极高，可以达到微米(μm)级别，因此具有良好的“显微”作用。

摘要
背景：前期研究采用激素联合脂多糖已成功构建股骨头缺血坏死兔模型。
目的：进一步观察激素性股骨头坏死早期骨质的动态变化。
方法：成年新西兰大白兔24只，随机分为实验组(n=12)和对照组(n=12)。实验组采用激素联合脂多糖改良技术建立激素性股骨头缺血坏死兔模型，对照组相同部位注射等体积生理盐水，饲养条件不变。建模完成后，分别于第5，10，15，20天进行股骨头多层螺旋CT、显微CT及苏木精-伊红染色检测，观察股骨头结构，骨小梁形态、分布，测定骨质密度及空骨陷窝率。
结果与结论：①影像学结果显示，实验组与对照组兔股骨头形态完整，关节面光滑，第15，20天实验组股骨头骨皮质变薄，骨小梁分布稀疏，间距增宽，不连续，骨矿物质密度、组织矿物质密度、骨体积分数值均显著低于对照组(P < 0.01)；②病理学结果显示，实验组空骨陷窝和脂肪细胞不断增多，骨细胞和造血细胞逐渐减少，第15，20天空骨陷窝百分率显著高于对照组(P < 0.01)；③结果说明，激素性股骨头坏死早期股骨头内骨细胞坏死增多，伴骨小梁微细骨折发生，导致骨质密度减低，最终可造成骨重塑障碍。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-2663-627X(吴少平)

关键词: 组织构建, 骨组织工程, 激素性股骨头坏死, 脂多糖, 显微CT, 微细骨折, 骨密度, ；骨松质

Abstract:

BACKGROUND: The rabbit model of osteonecrosis of the femoral head (ONFH) has been successfully established by glucocorticoid combined with lipopolysaccharide.
OBJECTIVE: To observe the dynamic changes of bone mass in the early steroid-induced ONFH.
METHODS: Twenty-four adult New Zealand white rabbits were randomly divided into experimental and control groups (n=12 per group). Rabbits in the experimental group were injected with lipopolysaccharide and glucocorticoid to establish the model of ONFH, while those in the control group given the same volume of normal saline. The changes in the femoral head structure, morphology and distribution of the trabecular bone at 5, 10, 15 and 20 days after modeling were observed through multi-slice spiral CT, micro-CT and hematoxylin-eosin staining; the bone mineral density and rate of empty lacunae were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: The imaging examinations showed that the rabbit femoral head was intact and smooth in both groups; on days 15 and 20, in the experimental group, the cortical bone became thinner, the trabecular bone became sparse and discontinuous, and the bone mineral density, tissue mineral density and bone volume/total volume were significantly lower than those in the control group (P < 0.01). The histological observation indicated that there were more empty lacunae and adipocytes, as well as less osteocytes and hematopoietic cells in the experimental group; the rate of empty lacunae in the experimental group was significantly higher than that in the control group on days 15 and 20 (P < 0.01). These findings suggest that in the early stage of ONFH, necrotic osteocytes increase in number, accompanied by trabecular micro-fractures, which leads to a decrease in bone mineral density, eventually resulting in bone remodeling disturbance.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Femur Head Necrosis, Lipopolysaccharides, Bone Density, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

喻钧伦，唐曦，黄雨，杨璐希，吴少平. 激素联合脂多糖诱导股骨头缺血坏死模型兔的骨质变化[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(28): 4518-4522.

Yu Jun-lun, Tang Xi, Huang Yu, Yang Lu-xi, Wu Shao-ping. Changes in bone mineral density in a rabbit model of steroid-induced osteonecrosis of the femoral head[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(28): 4518-4522.

图/表（结果） 1

2.1 实验动物数量分析 实验选用新西兰大白兔24只，分为2组。实验组第1周死亡2只，其余存活至实验结束，后续补充实验组2只兔数据；对照组全部存活，无明显变化。

2.2 螺旋CT观察骨质的变化 为了观察激素性股骨头坏死兔骨质形态及密度的变化，在建模后第5，10，15，20天进行双髋关节螺旋CT扫描。观察发现，实验组与对照组股骨头形态完整，关节面光滑，骨皮质厚度相当。与对照组相比，第15，20天实验组股骨头骨质密度欠均匀，骨松质密度减低，以第20天明显。以上结果表明，实验组股骨头形态保持完整，未发生骨质塌陷、囊变或硬化，但是骨内结构已发生改变，主要表现为股骨头骨松质形态与密度的改变。

2.3 Micro-CT观察骨质的变化 为进一步观察激素性股骨头坏死兔骨内部结构的变化，在建模后第5，10，15，20 天进行Micro-CT扫描。观察发现，实验组第15，20天股骨头骨皮质变薄，骨小梁分布稀疏，间距增宽，不连续，可见断裂(图2)。结果表明，股骨头内骨小梁发生微细骨折。

为进一步定量分析股骨头骨量变化，通过Micro-CT测定股骨头骨矿物质密度，组织矿物质密度，骨体积分数值。结果显示，随着观察时间延长，实验组骨矿物质密度、组织矿物质密度、骨体积分数值呈逐渐下降趋势，在第15，20天骨矿物质密度、组织矿物质密度、骨体积分数值均显著低于对照组(P < 0.01)(图3)。以上结果表明，实验组股骨头内骨量不断下降，骨质强度减低，可能与骨小梁发生微细骨折密切有关。

2.4 苏木精-伊红染色观察骨病理学变化 以上都是从影像学的角度观察激素性股骨头坏死的骨质变化，接下来从组织病理学的角度进一步观察股骨头发生骨坏死的情况。在建模后第5，10，15，20 天取股骨头行病理切片、苏木精-伊红染色。观察发现，实验组股骨头内骨小梁分布稀疏、变细，形态不完整，部分断裂，随观察时间延长，空骨陷窝和脂肪细胞逐渐增多，骨细胞和造血细胞逐渐减少(图4)。两组比较，实验组第15，20天空骨陷窝百分率显著高于对照组(P < 0.01)(表1)。以上结果表明，实验组股骨头内骨髓细胞与骨细胞坏死增加，骨小梁发生微细骨折，造成骨重塑障碍。推理可能原因是骨内微循环发生紊乱，引起破骨与成骨细胞作用不平衡，骨细胞坏死增多，破骨细胞作用进一步增强，骨质吸收增加，骨量不断丢失，伴随骨小梁发生微细骨折，骨质强度减低，最终引起骨重塑障碍。

2.5 统计学分析结果 实验组与对照组采用t检验，第15，20天，实验组骨矿物质密度、组织矿物质密度、骨体积分数值均显著低于对照组(P < 0.01)；实验组空骨陷窝百分率显著高于对照组(P < 0.01)。

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年3月至2015年5月在成都医学院第一附属医院实验中心完成。

1.3 材料 SPF级成年新西兰大白兔24只，雄性，体质量(3.53±0.16) kg，兔龄均为10个月，购于成都达硕生物科技有限公司。单笼饲养，自由饮水，通风良好，标准颗粒饲料喂养。经成都医学院第一附属医院动物伦理学委员会批准，按动物实验3R原则给予人道关怀。

脂多糖购于美国Sigma公司，SOMATOM Definition AS+ 64排螺旋CT出自德国SIEMENS公司，Micro-CT出自广州中科恺盛医疗科技有限公司，组织切片机出自美国Thermo Scientific公司，正置显微镜出自德国Lecia公司。

1.4 方法

1.4.1 建立动物模型 成年新西兰大白兔24只，适应性喂养1周后，随机分为实验组(n=12)和对照组(n=12)。实验组采用激素联合脂多糖改良技术建立股骨头缺血坏死兔模型^[11]。对照组相同部位注射等体积生理盐水，饲养条件不变。建模完成后，分别于第5，10，15，20 天两组各随机选取3只，依次进行以下指标的观察。

1.4.2 螺旋CT扫描 采用体积分数10%水合氯醛腹腔注射麻醉(4.0 mL/kg)新西兰大白兔，行64排螺旋CT扫描，俯卧位，以头先进体位，选用成人胸骨序列，0.6 mm骨重建算法，扫描范围包括双髋关节，由两名有经验的放射科医师阅片，观察兔股骨头形态及骨质密度等影像学表现。

1.4.3 Micro-CT扫描 采用空气栓塞法处死新西兰大白兔，解剖出股骨头，行Micro-CT扫描。扫描条件：冠状位，管电压60 kVp，功率40 W，电流0.67 mA。CT阈值切割取225-700 HU的全骨组织^[12]，感兴趣区选择骨皮质下与骺板之间，半径为1.0-1.5 mm的圆形区域(如图1)。观察骨小梁的形态、分布，骨皮质厚度，并测定骨矿物质密度(bone mineral density，BMD)、组织矿物质密度(tissue mineral density，TMD)、骨体积分数(bone volume/total volume， BV/TV)值。

1.4.4 苏木精-伊红染色 骨组织标本经40 g/L多聚甲醛固定48 h，酸性脱钙液脱钙36 h。冠状位取材，梯度乙醇脱水，浸蜡，包埋，作4.0 μm切片，苏木精-伊红染色后，分别在正置显微镜低、高倍镜下观察股骨头内骨小梁、骨细胞形态；并随机取10个高倍镜视野(×400)观察，记录股骨头空骨陷窝百分率、骨坏死发生率。

骨坏死诊断标准：骨小梁内见弥漫性空骨陷窝或核皱缩，伴有周围骨髓细胞坏死^[13]。

1.5 主要观察指标 影像学观察股骨头形态、结构，骨小梁形态、分布，并测定股骨头相关骨参数值；病理学观察股骨头组织形态学改变，计算空骨陷窝率。

1.6 统计学分析 实验结果均采用x(_)±s表示，组间比较采用t 检验，统计学分析用IBM SPSS Statistics 22.0软件包处理，P < 0.01为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

研究表明，股骨头坏死的病理进程常常是多种因素作用的结果^[5^，^14-15]，而糖皮质激素作为导致股骨头坏死最重要的发生机制之一，可对体内多个系统的多重影响，包括对骨细胞分化，成骨细胞和破骨细胞凋亡，脂质代谢，凝血途径，以及钙代谢的影响。这些途径常常是相互关联的，这使得股骨头坏死的发病机制和病理生理更难以理解。

实验通过激素联合脂多糖改良技术建立激素性股骨头坏死兔模型，在激素性股骨头坏死早期，通过影像学及组织病理学方法，每间隔5d对股骨头骨质的变化进行动态观察。结果显示，激素性股骨头坏死病程中可伴股骨头内骨小梁发生微细骨折。在多层螺旋CT检查结果中，实验组股骨头形态保持完整，关节面尚光滑，未发生骨质塌陷、囊变或硬化，但股骨头内骨质变得毛糙、欠均匀。由于螺旋CT分辨率不及显微CT高，进一步通过显微CT检测，观察兔股骨头内部细微结构的变化。结果发现，实验组股骨头骨皮质变薄，骨小梁分布稀疏，间距增宽，不连续，可见断裂。结果表明，股骨头内骨质疏松，骨小梁发生微细骨折。

另一方面，激素性股骨头坏死病程中可伴股骨头内骨质密度减低。显微CT结果显示，股骨头内骨质密度减低，主要体现在松质骨部分。为进一步证实，通过定量分析股骨头内骨量变化，相关参数结果显示，随着观察时间延长，实验组骨矿物质密度、组织矿物质密度、骨体积分数值呈逐渐下降趋势，且在第15，20天，实验组骨矿物质密度、组织矿物质密度、骨体积分数值均显著低于对照组(P < 0.01)，证明骨量呈进行性丢失^[16]。

有研究证实，糖皮质激素可直接影响骨细胞、成骨细胞的分化及凋亡^[17]，在一项临床研究中，经过量激素治疗的患者，股骨头内大量的骨细胞和成骨细胞发生凋亡，骨量在早期快速流失。本实验病理学结果证实，实验组骨小梁分布稀疏、变细，形态不完整，部分断裂，导致骨小梁发生微细骨折，伴随骨质吸收增加，最终导致骨量不断降低。可能与骨细胞和成骨细胞凋亡增多，破骨细胞作用增强有关，导致骨重塑障碍^[18-19]。

同时，激素性股骨头坏死病程中可伴空骨陷窝率不断增大。病理学结果显示，随观察时间延长，实验组空骨陷窝和脂肪细胞逐渐增多，骨细胞和造血细胞逐渐减少。第15，20天，实验组空骨陷窝百分率显著高于对照组(P < 0.01)。可能原因是骨内微循环发生紊乱，影响骨组织的微血管，骨内营养物质供给中断，造成骨细胞缺血、缺氧和坏死，骨细胞坏死不断增多^[20-21]

虽然研究取得了一定成果，但仍存在诸多缺陷。接下来，研究将加大样本量，通过CT、核磁共振、骨活检等体内实验以及Western blot、免疫组织化学、钙盐沉积等体外实验，进一步探讨激素性股骨头坏死早期病程的研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

激素联合脂多糖诱导股骨头缺血坏死模型兔的骨质变化

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