长效、中效、短效3种激素影响miR-672-5p在大鼠成骨细胞的差异表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0575

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (5): 809-814.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0575

• 干细胞基础实验 basic experiments of stem cells • 上一篇下一篇

长效、中效、短效3种激素影响miR-672-5p在大鼠成骨细胞的差异表达

翟沛¹，李鹏飞¹，梁正辉¹，曾建春¹，蔡国雄³，曾意荣²，樊粤光²

¹广州中医药大学第一临床医学院，广东省广州市 510405；²广州中医药大学第一附属医院骨科，广东省广州市 510405；³河源市中医院，广东省河源市 517000

修回日期:2018-07-30 出版日期:2019-02-18 发布日期:2019-02-18
通讯作者: 樊粤光，教授，广州中医药大学第一附属医院骨科，广东省广州市 510405
作者简介:翟沛，男，1989年生，河南省安阳市人，广州中医药大学在读博士，主要从事髋膝关节疾病的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81373652)

Differential expression of miR-672-5p in rat osteoblasts after intervention by long-acting, intermediate-acting and short-acting hormones

Zhai Pei¹, Li Pengfei¹, Liang Zhenghui¹, Zeng Jianchun¹, Cai Guoxiong³, Zeng Yirong², Fan Yueguang²

¹First Clinic Medical School, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China; ²Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China; ³Heyuan Hospital of Traditional Chinese Medicine, Heyuan 517000, Guangdong Province, China

Revised:2018-07-30 Online:2019-02-18 Published:2019-02-18
Contact: Fan Yueguang, Professor, Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China
About author:Zhai Pei, Doctoral candidate, First Clinic Medical School, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81373652

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
糖皮质激素分类：主要依据它们在体内作用时间的长短来划分：短效激素为8-12 h；中效激素为18-36 h；长效激素为36-54 h。
成骨细胞：是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化。骨不断地进行着重建，骨重建过程包括破骨细胞贴附在旧骨区域，分泌酸性物质溶解矿物质，分泌蛋白酶消化骨基质，形成骨吸收陷窝;其后，成骨细胞移行至被吸收部位，分泌骨基质，骨基质矿化而形成新骨。破骨与成骨过程的平衡是维持正常骨量的关键。

摘要
背景：前期研究中发现，甲泼尼龙干预后miR-672-5p在大鼠成骨细胞的表达上调，提示miR-672-5p 可能在激素性股骨头坏死中发挥作用。
目的：分析长效、中效、短效3种激素影响miR-672-5p在大鼠成骨细胞的差异表达。
方法：SD大鼠原代成骨细胞体外培养，取第3代大鼠成骨细胞加入DMEM高糖培养基，并分别加入终浓度为1×10^-5 mol/L的地塞米松(长效)、甲泼尼龙(中效)及氢化可的松(短效)，并设空白对照组；4组分别细胞总RNA提取，反转录反应，定量PCR反应；算出2^-^??Ct值评估miR-672-5p的表达量。
结果与结论：①与空白组相比，3组激素的miR-672-5p在大鼠成骨细胞的表达均显示出上调，其中甲泼尼龙组为2.35倍，提示表达最高；甲泼尼龙组miR-672-5p表达显著高于氢化可的松组和地塞米松组(均P < 0.05)，但氢化可的松组与地塞米松组比较差异无显著性意义；②结果说明，中效激素的miR-672-5p在大鼠成骨细胞的表达量最大，提示甲泼尼龙在激素性股骨头坏死中可能起重要角色。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID:0000-0002-2183-6961(翟沛)

关键词: 糖皮质激素, 成骨细胞, 激素性股骨头坏死, miR-672-5p, 地塞米松, 甲泼尼龙, 氢化可的松, 短效激素, 中效激素, 长效激素, 组织构建

Abstract:

BACKGROUND: Preliminary study has found that miR-672-5p can up-regulate osteoblast expression in rats, suggesting that miR-672-5p may participate in osteonecrosis of the femoral head.
OBJECTIVE: To investigate the differential expression of miR-672-5p in osteoblasts in rats after intervention by long-acting, intermediate- acting and short-acting hormones.
METHODS: Primary osteoblasts of Sprague-Dawley rats were cultured in vitro. The third generation rat osteoblasts were added into DMEM high glucose medium, and then 1x10^-5 mol/L methylprednisolone, hydrocortisone and dexamethasone were added, respectively. The cells cultured with normal DMEM were used as blank control group. Total RNA extraction was performed for reverse transcription reaction and quantitative PCR. The 2^-ΔΔCT value was calculated to evaluate miR-672-5p expression.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the blank control group, the expression level of miR-672-5p in the other three groups was up-regulated, and that in the methylprednisolone group was 2.35 times, showing the highest level. The expression level of miR-672-5p in the methylprednisolone group was significantly higher than that in the hydrocortisone and dexamethasone groups (both P < 0.05). There was no significant difference between hydrocortisone and dexamethasone groups. These results indicate that the expression of miR-672-5p in rat osteoblasts by intermediate-acting hormone is the highest, which suggests that methylprednisolone may play an important role in steroid-associated osteonecrosis of the femoral head.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Glucocorticoids, Osteoblasts, Femur Head Necrosis, Methylprednisolone, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

翟沛，李鹏飞，梁正辉，曾建春，蔡国雄，曾意荣，樊粤光. 长效、中效、短效3种激素影响miR-672-5p在大鼠成骨细胞的差异表达[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(5): 809-814.

Zhai Pei, Li Pengfei, Liang Zhenghui, Zeng Jianchun, Cai Guoxiong, Zeng Yirong, Fan Yueguang. Differential expression of miR-672-5p in rat osteoblasts after intervention by long-acting, intermediate-acting and short-acting hormones[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(5): 809-814.

图/表（结果） 3

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引言

材料方法

1.1 设计 分组对照细胞学实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年10月至2017年1月在广州中医药大学第一临床医学院完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 SD大鼠乳鼠购自广州中医药大学动物实验中心，许可证号：SCXK(粤)2013-0020。

1.3.2 实验中所用的主要试剂和仪器 DMEM高糖培养基(Gibco)，胰酶(Gibco)，反转录试剂盒(DBI)，荧光定量PCR检测试剂盒(Genecopies)；生物倒置显微镜(OLYMPUS CKX41)，多功能酶标仪(Thermo Fisher MK3)，荧光定量PCR仪(ABI 7500)。

1.4 实验方法

1.4.1 药物配制 ①甲泼尼龙(中效激素)：按甲泼尼龙计，注射液中甲泼尼龙的浓度约为1×10^-1 mol/L，用DMEM培养基以1∶9倍比稀释至浓度为1×10^-3 mol/L的储存液，-20 ℃保存，备用；②氢化可的松(短效激素)：50 mg氢化可的松溶于1.37 mL 二甲基亚砜中配制成浓度为1×10^-1 mol/L母液，以DMEM培养基稀释100至浓度为1×10^-3 mol/L储存液，-20 ℃保存，备用；③地塞米松(长效激素)：按地塞米松计，注射用地塞米松磷酸钠中地塞米松浓度约为1.3×10^-2 mol/L，用DMEM培养基稀释至浓度为1×10^-3mol/L储存液，-20 ℃保存，备用。

1.4.2 大鼠原代成骨细胞的分离及培养 新生SD大鼠乳鼠(出生后24 h)，对大鼠乳鼠头盖骨进行分离、提取和培养，主要方法为：麻醉下脱颈椎处死24 h内新生的SD大鼠，体积分数75%乙醇浸泡5 min，取出头盖骨，分离顶骨和额骨，预冷PBS(0.01 mol/L)反复洗涤大鼠乳鼠颅盖骨标本除去脂肪组织及残留血，放入另一盛有DMEM高糖培养基的培养皿中再洗涤，将颅骨剪成2-5 mm²碎片，将洗涤过的骨碎片用0.25%胰蛋白酶2 ml消化20 min，离心弃上清(主要清除成纤维细胞)。加入2 mL 0.1%Ⅰ型胶原酶，于37 ℃消化20 min，收集消化液；向培养皿中加入4 mL DMEM高糖培养基终止消化；重复用Ⅰ型胶原酶消化3次，收集消化液；收集的消化液于低温离心机中1 000 r/min离心5 min，将细胞沉淀移入培养瓶中，加入10%DMEM高糖培养基，放入37 ℃，体积分数5% CO₂培养1 h后，将培养瓶翻转过来。以后每3 d换液1次，待生长细胞铺满培养瓶80%后，进行传代。每次传代时，将细胞放入培养瓶后，先将培养瓶翻转放入培养箱中1 h，然后再将细胞翻转过来。每5-7 d传代1次。

1.4.3 不同激素干预大鼠成骨细胞 ①第3代大鼠成骨细胞以1×10⁵细胞/孔接种于6孔板，于37 ℃，体积分数5% CO₂培养箱内继续培养过夜。②弃6孔板内培养基，加入2 mL新鲜DMEM高糖完全培养基(含体积分数10% FBS，1% 青霉素/链霉素)，并向每孔中分别加入20 μL甲泼尼龙、氢化可的松、地塞米松储存液，轻轻混匀，甲泼尼龙、氢化可的松及地塞米松的终浓度为1×10^-5 mol/L，并设立一空白对照。将6孔板重新置于37 ℃，体积分数5%CO₂培养箱内继续培养48 h。

1.4.4 qPCR检测miR-672-5p

(1)细胞总RNA提取：激素干预大鼠成骨细胞48 h后，弃孔内培养基，提取总RNA。①用微量移液器将培养瓶/板中培养液吸除干净，加入1 mL 4 ℃预冷的PBS，轻摇洗涤；②用微量移液器将PBS吸除干净；③加入1 mL的Trizol 试剂，轻缓振荡或用枪头吹打，破碎细胞；④将液体转移到灭过菌的1.5 mL离心管内；⑤加入250 μL三氯甲烷，颠倒离心管15 s，充分混匀，静置3 min；⑥4 ℃下13 000×g离心8 min；⑦将上清转移到一新的离心管中，加入0.8倍体积的异丙醇，颠倒混匀；⑧-20 ℃放置15 min；⑨4 ℃下13 000×g离心10 min，管底的白色沉淀即为RNA；⑩吸除液体，加入体积分数75%乙醇1.5 mL洗涤沉淀；?4 ℃下13 000×g离心5 min；?将液体吸除干净，将离心管置于超净台上吹3 min；?加入20 μL无RNA酶的水溶解RNA。miR-672-5p引物设计与合成见表1。

(2)反转录反应：①取一PCR管，加入含2 μg RNA的溶液；②加入1 μL特异性反转录引物；③用无核糖核酸酶的去离子水补足至12 μL；④于PCR仪上70 ℃保温5 min，迅速置冰上冷却；⑤依次加入4 μL 5×buffer，2 μL 10 mmol/L dNTPs，1 μL RNA inhibitor和1 μL反转录酶，用枪抽吸混匀；⑥于PCR仪上42 ℃保温30 min，结束后80 ℃保温5 min灭活反转录酶。

(3)定量PCR反应：①取0.2 mL PCR管，配制如下反应体系见表2；②PCR扩增步骤见表3，循环结束后从55 ℃升高到95 ℃获取熔解曲线。

1.5 主要观察指标 ①激素干预后大鼠成骨细胞的形态；②qPCR检测miR-672-5p扩增结果与分析；③各组大鼠成骨细胞miR-672-5p表达。

1.6 统计学分析 ??CT法：A=CT(目的基因，待测样本)- CT(内标基因，待测样本)，B=CT(目的基因，对照样本)- CT(内标基因，对照样本)，K=A-B，表达倍数=2-K。采用SPSS 19.0软件分析，组间两两比较进行t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

miRNA作为真核生物中一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长为18-25 nt。成熟的miRNA通过碱基互补配对识别靶mRNA，互补程度的差异会分别引起降解靶mRNA或者阻止靶mRNA的翻译，从而对基因进行转录后调控。miRNA在细胞增殖、分化和凋亡，机体发育和疾病发生过程中发挥着重要的调控作用。且miRNA的表达谱并非一成不变，疾病的发生、发展和转归过程中miRNA也随之变化^[6]，这为疾病机制研究提供了前提，并且为其能够对疾病的早期诊断提供依据。股骨头坏死的具体机制尚不清楚，尤其是病理过程的启动因子更不明确，现存的机制基本还都处于理论假说的阶段在课题组前期的研究中，利用测序技术比较了含药血清与激素组大鼠microRNA表达谱并且通过生物信息学分析软件筛选出了激素相关的高表达miRNA即miR-672-5p，其意义在于将以往miRNA用于早期疾病诊断的应用范围进一步拓展，为激素性股骨头坏死的诊疗提供一种新的思路，同时为机制研究提供证据。

国内外临床应用研究发现，利用干细胞成骨分化或促进局部成骨细胞活性^[10-13]，促进头内局部微环境的变化，包括产生激发内部类组织工程效能^[14]，催生生长因子与血管生成因子以此推进股骨头的重塑和修复，能够对早期股骨头坏死产生比较肯定的临床疗效，研究者在以往对股骨头坏死的机制研究中已经有初步的定论。因此miR-672-5p有作为预测并提示股骨头坏死的血清标志物的潜力。

股骨头坏死目前早期的诊断主要依靠MRI和核素扫描的影像学评估，但其本身仪器造价高昂且患者的花费居高不下，对于基层医院广泛开展应用尚有差距。比较而言血清标志物的获取和检测则相对简单，费用低廉易于广泛铺开应用，但目前发现的一些标志物尚不成熟，或者没有达到临床应用的标准：脂联素是脂源性的细胞因子，在人体血清含量较高。实验发现其可以抑制单核细胞的破骨分化^[15]，也有研究者认为其可以通过胰岛素通路促进骨生成^[16]。动物实验发现髋关节内直接注射重组脂联素可促进激素性股骨头缺血性坏死的修复^[17]，且具有剂量依赖性；但均对其影响股骨头坏死的机制没有确切的结论。

DKK1是一种外泌型的糖蛋白，参与调控Wnt信号，外国学者对比股骨头坏死患者和股骨颈骨折患者股骨头中DKK1^[18]，发现非创伤性股骨头坏死患者的股骨头内成骨细胞内的DKK1呈高表达状态，就血清水平来讲，越晚期的患者DKK1含量越高。DKK1可能通过降低组织细胞含氧量促使细胞凋亡^[19]。

骨代谢标志物TRACP?5b作为骨吸收的代表标志物对于解释骨基质分解特异性高且变化浮动小具有高稳定性的特点^[20]，但是有比较容易受到骨质疏松因素的影响。Tan等^[21]发现股骨头坏死患者股骨头某些特异型蛋白表达高于骨关节和类风湿患者。特征性蛋白的发现有助于诊断早期股骨头坏死，Wu等^[22]比较了健康志愿者和成人股骨头坏死之间血清中的差异蛋白质，发现股骨头坏死患者中，补体因子C3的前体、及补体因子H均显著升高，而载脂蛋白A-IV前体则显著降低。作者认为，血清中蛋白种类众多，如何排除诸多种类蛋白之间的相互关系，如何并筛查并解释某种蛋白与股骨头坏死的独立相关性是存在一定技术壁垒和成本屏障的。

在临床应用中，已有研究糖皮质激素的不同种类，不同剂型，不同剂量治疗各种疾病的疗效差异^[23-26]，原因在于各种激素的生物效应不一。激素的区别不仅仅只限于作用时间，主要还在以下几方面存在差异：①生物效能不同，对于升糖和抗炎作用，长效糖皮质激素的相对效能最强，中效次之，而短效最弱；②免疫抑制方面，长效与中效均有较强的免疫抑制作用，临床上免疫移植治疗中效激素更常用，因其半衰期短些；③穿透血脑屏障的能力，从强到弱：依次是中效、长效、短效^[27]。

在激素与激素性股骨头坏死相关研究中，研究者发现激素剂量与坏死范围和风险有关^[28-31]。另外糖皮质激素受体的多态性可能是对激素性股骨头坏死个体差异的一种解释^[32]，并且可能与诸多疾病相关联^[33-35]，部分通过实验验证并探讨了可能机制^[36-38]。miRNA的研究在激素性股骨头坏死的成果显著^[39]。作者的研究再次验证了激素干预后，miR-672-5p在大鼠成骨细胞的表达上调，可能作为下一步研究热点。作者还发现中效激素(甲泼尼龙)的miR-672-5p表达量最大，可能与中效的免疫抑制作用强，并且穿透能力强，随之而来的可能是骨坏死副作用较大，与既往研究在别的疾病有类似^[23^，^38]。

甲强龙又称甲泼尼龙琥珀酸钠，临床应用极为广泛，对于风湿性疾病、胶原性疾病、皮肤疾病、休克、过敏状态和免疫抑制的治疗有比较确定的临床疗效。其作用机制包括可以减少脂质过氧化反应、减少体内自由基；同时甲强龙还可以穿过细胞膜，通过阻断NF-KB等转录因子的通路影响多种蛋白的转录^[40]。WNT经典通路对于骨形成过程有重要作用，Glass等^[41]发现其可通过上调骨保护蛋白水平抑制骨吸收，而外国学者发现糖皮质激素受体可通过减少成骨细胞细胞核内的β-catenin含量和增加β-catenin来抑制Wnt信号通路^[42]。此外，Smith等^[43]还发现激活GSK-3β促进β-catenin降解也成为抑制成骨细胞分化的另一原因，以上这些因素均可能成为其成为中效激素诱导骨坏死的高概率因素。

结论：综上，作者认为：蛋白结合能力、受体亲和力、HPA轴的抑制程度均有可能成为中效激素诱导骨坏死的高概率因素，既往认为甲泼尼龙容易在胆碱酯酶的作用下或与皮质类固醇的结合能力低容易形成游离态，导致不被灭活，持续发挥药理作用。该研究基于已明确的差异表达miRNA的角度为研究两者的相关可能性提供的一个新思路和方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

长效、中效、短效3种激素影响miR-672-5p在大鼠成骨细胞的差异表达

Differential expression of miR-672-5p in rat osteoblasts after intervention by long-acting, intermediate-acting and short-acting hormones

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