早期激素性股骨头坏死过程中细胞色素c的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.42.003

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (42): 6252-6258.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.42.003

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早期激素性股骨头坏死过程中细胞色素c的作用

吉浩宇1，王小龙2

1内蒙古医科大学附属医院骨科，内蒙古自治区呼和浩特市 010050；2内蒙古医科大学第二附属医院手足外科，内蒙古自治区呼和浩特市 010030

收稿日期:2016-07-16 出版日期:2016-10-14 发布日期:2016-10-14
通讯作者: 吉浩宇，内蒙古医科大学附属医院骨科，内蒙古自治区呼和浩特市 010050
作者简介:吉浩宇，男，1969年生，内蒙古自治区呼和浩特市人，汉族，2002年内蒙古医科大学毕业，硕士，副主任医师。共同第一作者：王小龙，硕士，医师。
基金资助:
国家自然科学基金(81360224)

Effects of cytochrome c on early steroid-induced femoral head necrosis

Ji Hao-yu1, Wang Xiao-long2

1Department of Orthopedics, the Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010050, Inner Mongolia Autonomous Region, China; 2Department of Hand and Foot Surgery, Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China

Received:2016-07-16 Online:2016-10-14 Published:2016-10-14
Contact: Ji Hao-yu, Department of Orthopedics, the Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010050, Inner Mongolia Autonomous Region, China
About author:Ji Hao-yu, Master, Associate chief physician, Department of Orthopedics, the Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010050, Inner Mongolia Autonomous Region, China Wang Xiao-long, Master, Physician, Department of Hand and Foot Surgery, Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China Ji Hao-yu and Wang Xiao-long contributed equally to this paper.
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81360224

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
细胞色素c：来自三羧酸循环中产生的琥珀酸辅酶A，其肽链仅有104个氨基酸，体内大量存在，一般无需外源补充；且外源补充与体内含量相比甚微。细胞色素c是生物氧化的一个非常重要的电子传递体，在线粒体崤上与其它氧化酶排列成呼吸链，参与细胞呼吸过程。
激素性股骨头坏死：股骨头坏死又称股骨头无菌性坏死，或股骨头缺血性坏死，是由于多种原因导致的股骨头局部血运不良，从而引起骨细胞进一步缺血、坏死、骨小梁断裂、股骨头塌陷的一种病变。激素性股骨头坏死就是因为长时间使用激素而引起的一种股骨头坏死。

摘要
背景：研究表明骨细胞凋亡与激素性股骨头坏死的发病机制密切相关，而细胞色素c的释放在细胞凋亡过程中起着非常重要的作用。
目的：观察细胞色素c在早期激素性股骨头坏死的作用。
方法：将24只成年健康5月龄新西兰雄性兔随机分成模型组与对照组，每组12只，模型组采用臀肌注射激素联合耳缘静脉注射马血清的方法建立早期激素性股骨头坏死模型，对照组耳缘静脉注射等量生理盐水，分别于造模第2，4，6周在光学显微镜下观察双侧股骨头组织病理学改变，并计算空骨陷窝率，应用TUNEL法检测骨细胞凋亡，并计算凋亡指数；应用免疫组织化学染色测定细胞色素c，并计算细胞色素c阳性表达率。
结果与结论：①空骨陷窝率及凋亡指数：实验成功建立了早期激素性股骨头坏死兔模型，于对照组相比，模型组造模后各时间点的空骨陷窝率、凋亡指数及骨细胞细胞色素c阳性表达率均明显升高(P < 0.05或P < 0.01)；②相关性分析：模型组各时间点的细胞凋亡指数与空骨陷窝率呈明显正相关(r=0.856， P < 0.01)，且模型组各时间点的细胞色素c阳性表达率与细胞凋亡指数同样呈明显正相关(r=0.824， P < 0.01)。③结果证实：细胞色素c参与的骨细胞凋亡可能在激素性股骨头坏死中起重要作用，且骨细胞的细胞色素c阳性表达率与兔激素性股骨头坏死的发生呈显著正相关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0001-5670-3432(吉浩宇)

关键词: 组织构建, 骨组织工程, 激素性股骨头坏死, 细胞凋亡, 细胞色素c, 早期, 动物模型, 凋亡指数, 空骨陷窝, 骨细胞, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that apoptosis is closely related to the pathogenesis of steroid-induced femoral head necrosis. The release of cytochrome c plays a very important role in the process of apoptosis.
OBJECTIVE: To observe the effects of cytochrome c on early steroid-induced femoral head necrosis.
METHODS: Twenty-four healthy adult male New Zealand rabbits at 5 months old were randomly divided into model group and control group (n=12 per group). Models of early steroid-induced femoral head necrosis were established by intragluteal injection of hormone combined with ear vein injection of horse serum. In the control group, rabbits were given ear vein injection of the same amount of physiological saline. At 2, 4 and 6 weeks after model establishment, histopathological changes of bilateral femoral head were observed by optical microscope, and the ratio of empty lacuna was calculated. Apoptosis of osteocytes was determined by TUNEL assay, and apoptotic index was calculated. Immunohistochemical method was used to determine cytochrome c and to calculate cytochrome c-positive expression rate.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The ratio of empty lacuna and apoptotic index: The model of early steroid-induced femoral head necrosis was successfully established in the experiment. Compared with the control group, ratio of empty lacuna, apoptotic index and expression rate of cytochrome c in osteocytes were significantly higher in the model group (P < 0.05 or P < 0.01). (2) Correlation analysis: Ratio of empty lacuna was significantly positively associated with apoptotic index at various time points in the model group (r=0.856, P < 0.01). Expression rate of cytochrome c was significantly positively associated with apoptotic index at various time points in the model group (r=0.824, P < 0.01). (3) These findings confirm that cytochrome c-involved apoptosis of osteocytes may play an important role in steroid-induced femoral head necrosis. Expression rate of cytochrome c in osteocytes is remarkably positively associated with the occurrence of steroid-induced femoral head necrosis in rabbits.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Tissue Engineering, Apoptosis, Models, Animal

中图分类号:

R318

吉浩宇1，王小龙2. 早期激素性股骨头坏死过程中细胞色素c的作用[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(42): 6252-6258.

Ji Hao-yu1, Wang Xiao-long2 . Effects of cytochrome c on early steroid-induced femoral head necrosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(42): 6252-6258.

图/表（结果） 1

2.1 实验动物数量分析兔24只均进入结果分析，实验过程无死亡等脱失现象的发生，全部进入结果分析。

2.2 早期激素性股骨头坏死模型兔骨组织病理学变化苏木精-伊红染色显示，模型组从建模后第2周后开始出现股骨头坏死表现，主要表现为软骨及软骨下松质出现空骨陷窝(图1A)，部分骨陷窝内骨细胞消失，骨细胞胞浆中充满脂滴，部分骨细胞胞核受挤压被挤向一边，髓腔内造血细胞减少，脂肪细胞增生肥大、数目增多(图1C)，骨小梁稍变细、甚至断裂。随着观察时间延长，实验组上述表现越明显。

对照组骨小梁结构完整，排列规则，骨细胞清晰可见，中央可见较大、深染的细胞核，空骨陷窝少见，髓腔内造血细胞丰富，脂肪细胞较少，大小、形态正常(图1B)，股骨头软骨层完整、软骨细胞排列整齐(图1D)。模型组各时间点的股骨头空骨陷窝率均高于对照组，差异均有显著性意义(P < 0.05；表1)。

2.3 早期激素性股骨头坏死模型兔骨组织细胞凋亡变化 TUNEL检测显示，对照组在整个实验过程中凋亡骨细胞很少，凋亡细胞数相对稳定；而模型组从建模后第2周开始光学显微镜下可见较多胞浆染成棕黄色的TUNEL阳性细胞(即凋亡细胞)，随着造模时间的延长，凋亡细胞数逐渐增多，细胞凋亡指数逐渐增高。模型组各时间点的凋亡指数均明显高于与对照组，差异均有显著性意义(P < 0.01；表1)。

2.4 早期激素性股骨头坏死模型兔骨组织细胞色素c的阳性表达变化免疫组织化学染色显示，模型组从第2周后开始出现较多胞浆染成棕褐色的细胞色素c阳性骨细胞，随着造模时间的延长，细胞色素c阳性细胞数逐渐增多(图2)。模型组各时间点的骨细胞细胞色素c阳性表达率均明显高于对照组，差异均有显著性意义(P < 0.01；表1)。

2.5 相关性分析结果 Pearson相关性分析结果显示：模型组各时间点的细胞凋亡指数与空骨陷窝率呈明显正相关(r=0.856，P < 0.01)，且模型组的骨细胞细胞色素c阳性表达率与细胞凋亡指数同样呈明显正相关(r=0.824，P < 0.01)，差异均有显著性意义，表明在早期激素性股骨头坏死中，股骨头病变部位的细胞色素c与细胞凋亡指数具有显著相关性。

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引言

由于糖皮质激素被广泛用于治疗某些疾病(如感染性休克、白血病、器官移植后以及系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病)，因而激素性性股骨头坏死(steroid- induced femoral head necrosis，SIFHN)已成为目前非创伤性股骨头坏死的最常见原因^[1-2]。激素性股骨头坏死严重影响患者的生活质量和劳动能力，给社会带来了巨大的负担，因其在早期诊断比较困难，所以大部分患者最终不得不接受人工关节置换^[3]。因此早期诊断和早期治疗，特别是早期诊断及干预对防止病变进一步发展，保存和挽救患者自身关节，降低致残率非常重要。

当前对激素性股骨头坏死的发病机制主要包括这几种学说^[4]：骨质疏松学说、骨细胞受损学说、脂质代谢紊乱学说、骨内高压学说、血管内凝血学说等，然而其确切发病机制尚未完全阐明。近年来越来越多国内外研究表明骨细胞凋亡与激素性股骨头坏死密切相关^[5-8]，而细胞色素c酶(cytochrome c，Cyt-c)在细胞凋亡线粒体通路中扮演重要角色^[9-10]。

建立一种与激素性股骨头坏死病程相似的早期激素性股骨头坏死动物模型对研究股骨头坏死的发病机制、早期诊断及干预治疗非常重要。国内张立岩等^[11]采用臀肌注射地塞米松磷酸钠注射液造模，他们通过MRI与病理学检查对模型进行评价，结果在实验第6周出现了股骨头坏死的表现，因而，他们得出结论：经短期、冲击、大剂量给予地塞米松成功构建兔早期激素性股骨头坏死模型。课题组以往研究也显示，单纯采用激素在实验第6周就成功构建兔早期激素性股骨头坏死模型^[12]。但由于在临床实际中，有一个共同的特点，即激素性股骨头坏死患者在应用激素前就已经存在过敏性血管炎，因而出现了马血清联合激素建立激素性股骨头坏死的动物模型的方法。李传将等^[13]采用耳缘静脉注射马血清联合臀肌注射激素的方法于实验第4周成功地建立了早期激素性股骨头坏死动物模型。

目前鲜见关于细胞色素c在早期激素性股骨头坏死发病中作用的研究报道，为了更加接近临床发病实际情况，实验采用李传将等^[13]的方法建立兔早期激素性股骨头坏死模型，研究细胞色素c与细胞凋亡是否存在相关性，进一步探讨细胞色素c在早期激素性股骨头坏死发病中的作用，细胞色素c是否参与早期激素性股骨头坏死的发生发展，为今后研究激素性股骨头坏死的发病机制和早期选择诊治措施提供实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点于2013年6月至2015年10月在内蒙古医科大学分子病理实验室(内蒙古自治区重点实验室)完成。

1.3 材料

实验动物：成年健康5月龄新西兰雄性兔24只，体质量(2.5±0.2) kg，购自西安市迪乐普生物资源开发有限公司，合格证号：SCXK(陕)2014-001。给予标准兔颗粒饲料、自由饮水，单笼喂养，通风良好。

1.4 实验方法

1.4.1 分组及建模兔适应性饲养1周后，将24只兔随机分为对照组和模型组，每组12只。模型组：参照李传将等^[13]的建模方法，采用激素联合异体血清的方法建模，并采用骨组织病理学检查这一金标准作为早期激素性股骨头坏死建模成功的评价方法^[11]。首次每只兔按10 mL/kg经耳缘静脉注射马血清，间隔2周后，按5 mL/kg剂量连续2 d注射马血清各1次；间隔2周后，按7.5 mg/kg 臀肌注射醋酸甲强龙，每间隔3 d 注射1次，共6周。对照组：给予注射等量生理盐水。期间每组均肌注青霉素(80万单位/只)抗感染，2次/周。

1.4.2 取材于造模后第2，4，6周注射过量麻醉药分批处死实验兔，模型组和对照组每次各处死4只，备皮、消毒、固定动物，严格无菌手术下取材，沿冠状面切开，一侧股骨头用于组织病理学观察，另一侧采用免疫组织化学染色方法测定骨细胞细胞色素c活性。

1.4.3 组织病理学观察股骨头置于40 g/L多聚甲醛固定48 h，体积分数10% EDTA溶液脱钙, 以细针刺透股骨头、无明显阻力为脱钙终点。脱钙完成后流水冲洗24 h，逐级脱水及二甲苯透明，石蜡包埋，制作切片(厚度4 μm)，苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察骨小梁、骨细胞、骨髓腔内脂肪细胞、造血细胞等组织形态学变化。空骨陷窝率计算：高倍镜下(10×40)随机选择10个视野，每个视野计数50个骨陷窝，计算空骨陷窝率。

1.4.4 TUNEL法检测骨细胞凋亡并计算凋亡指数：光学显微镜观察核染色成棕褐色或棕黄色为TUNEL染色阳性细胞，即凋亡细胞。高倍镜下(10×40)随机选择10个视野，每个视野计数50个骨细胞，计算凋亡指数(apoptosis incidence，AI)(凋亡细胞数/50)。

用二甲苯浸洗石蜡切片样本2次，每次5 min；梯度乙醇脱水；PBS漂洗2次，每次5 min；用Proteinase K工作液处理组织15-30 min；PBS漂洗2次，每次5 min；制备TUNEL反应混合液；待玻片干后，于标本上加TUNEL反应混合液50 μL，37 ℃湿润、避光孵育1 h； PBS漂洗3次，每次5 min；于标本上加50 μL过氧化酶(POD)，37 ℃湿润、避光反应30 min；PBS漂洗3次，每次5 min；在组织处加50-100 μL DAB底物，反应15-25 ℃×10 min；PBS漂洗3次，每次5 min；再次行苏木精或甲基绿复染；中性树胶封固，滴加PBS或甘油，光镜观察细胞凋亡并拍照。

1.4.5 免疫组织化学染色(SP法) 具体步骤如下：脱蜡，水化；PBS洗两三次，每次5 min；体积分数3% H₂O₂(80%甲醇)滴加在TMA上，室温静置10 min；PBS洗两三次各5 min；抗原修复；PBS洗两三次，每次5 min；滴加正常山羊血清封闭液，室温20 min。甩去多余液体。滴加Ⅰ抗50 μL，室温静置1 h或者4 ℃过夜或者37 ℃ 1 h。4 ℃过夜后需在37 ℃复温45 min。PBS洗3次，每次5 min；滴加Ⅱ抗40-50 μL，室温静置，或37 ℃ 1 h；二抗中可加入体积分数0.05%的Tween-20；PBS洗3次各5 min； DAB显色5-10 min，在显微镜下掌握染色程度；PBS或自来水冲洗10 min；苏木精复染2 min，盐酸乙醇分化；自来水冲洗10-15 min；脱水、透明、封固、镜检。用细胞色素c检测试剂盒检测包浆内细胞色素c的水平，按试剂盒相应步骤进行操作。高倍镜下(10×40)随机选择10个视野，计数每个视野中阳性细胞，计算细胞色素c阳性表达率。

1.5 主要观察指标 ①股骨头标本苏木精-伊红染色观察，并计算空缺骨陷窝率；②TUNEL检测细胞凋亡，并计算凋亡指数；③免疫组织化学染色检测细胞色素c表达，并计算骨细胞细胞色素c阳性表达率。

1.6 统计学分析应用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，计量资料以x(_)±s表示，组间差异比较采用两独立样本t 检验，指标间相关关系分析采用Pearson相关性分析，P < 0.05表示差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

因为激素性股骨头坏死建模成功评价的金标准方法是骨组织病理学检查，激素性股骨头缺血性坏死的主要病理标志是骨细胞在陷窝中消失，即空骨陷窝数量明显增多^[14]。实验病理组织学结果显示，模型组于第2周时大部分标本就开始出现了骨坏死的表现，髓腔内脂肪细胞肥大、造血细胞减少，空骨细胞陷窝数增多，于第4-6周时上述现象进一步加重，统计结果显示模型组各时间点的空骨陷窝率均高于对照组，说明实验成功建立了早期激素性股骨头坏死动物模型。另外，各周骨坏死病理改变主要位于软骨下区，且并未发现软骨下骨明显变形、塌陷，这进一步说明为激素性股骨头坏死的早期，这与众多文献研究结果一致^[8^，^15]。

临床上激素性股骨头坏死患者一般发生在使用激素治疗相关疾病的基础上，如SARS、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、感染性休克、肾病综合征、白血病、器官移植后等疾病，这些疾病有一个共同的特征，即在应用激素以前机体已经有脉管系统或者有免疫系统失调^[16-17]。在建立早期激素性股骨头坏死模型研究中，关于激素种类、用量、是否联合内毒素或马血清等尚无统一标准^[18-20]。虽然许多动物实验研究已证实，单纯应用糖皮质激素就可诱发股骨头坏死，并且可以建立早期激素性股骨头坏死动物模型^[21]，但单纯使用激素造模不太符合临床实际情况，而且造模时间长。因此，实验为了尽可能接近人类股骨头坏死的发病情况，采用激素联合马血清的方法建立早期激素性股骨头坏死动物模型。先注射马血清造成兔发生过敏性血管炎，然后注射激素加重了已发生的血管炎，激素可抑制胶原和弹性纤维的合成，进而导致血供受损，最终导致股骨头的缺血性坏死^[9]。

激素性股骨头坏死的发病机制包括多种学说，但确切的发病机制目前尚未阐明，尤其是对于骨细胞的死亡方式是坏死还是凋亡尚存在争议^[22]。细胞凋亡是基因控制的细胞有序的、主动的一种死亡方式，是通过细胞复制和细胞死亡之间的平衡来实现的，如果这种平衡被破坏，细胞凋亡过多或过少，就会导致疾病的发生^[23]。许多文献研究发现，过量使用激素可以诱导成骨细胞和骨细胞凋亡，细胞凋亡逐渐累积，最后导致股骨头坏死^[24-25]。

实验采用经典的细胞凋亡检测方法——TUNEL法激素性股骨头坏死模型兔的骨细胞检测，在模型组发现了较多的TUNEL阳性凋亡骨细胞，模型组各时间点的凋亡指数明显高于对照组，且模型组随着应用激素时间的增加，凋亡指数逐渐升高；同时，模型组各时间点的细胞凋亡指数与空骨陷窝率呈明显正相关，说明细胞凋亡在早期激素性股骨头坏死的发病机制中扮演着重要角色。然而一项与实验研究结果大相径庭的研究结果发现细胞凋亡是早期激素性股骨头坏死的首要变化，但却没有明显的骨坏死发生^[26]。实验认为原因可能是采用检测凋亡的方法不同所致。

Eberhardt等^[27]研究发现模型组兔中有大量的成骨细胞和骨细胞凋亡，模型组中的凋亡变化明显高于空白对照组，并指出凋亡是激素性股骨头坏死的首要变化，而不是坏死，但上述研究并没有研究细胞凋亡在早期激素性股骨头坏死中的作用。熊明月等^[28]研究结果显示，在采用马血清和大剂量的甲强龙造模第4周，实验组凋亡细胞数明显高于对照组，随着时间推移,凋亡细胞逐渐增多；透射电镜观察，实验组可见部分骨细胞有完整核膜、染色质浓集、电子密度增加等凋亡特征，而对照组骨细胞未见明显凋亡变化。因此，他们得出结论细胞凋亡在早期激素性股骨头缺血坏死中起重要作用。同样，近期许多国内外研究表明^[2^，²²^，^29]，骨细胞、成骨细胞以及骨髓细胞的凋亡确实存在于激素性股骨头坏死的早期。

实验结果显示，在造模第2周，模型组就开始出现较多胞浆染成棕褐色的细胞色素c阳性骨细胞，随着造模时间的延长，细胞色素c阳性细胞数逐渐增多，且模型组各时间点的骨细胞细胞色素c阳性表达率均明显高于对照组，差异均有显著性意义，说明模型组的高细胞色素c阳性表达率与早期激素性股骨头坏死的发生相关。Pearson相关性分析结果显示：模型组各时间点的骨细胞细胞色素c阳性表达率与细胞凋亡指数呈明显正相关，进一步说明细胞色素c参与的细胞凋亡可能与早期激素性股骨头坏死的发病过程有关。刘文刚等^[30]研究兔激素性股骨头坏死与肝细胞色素P4503A酶活性的相关性时表明，肝细胞色素 P4503A酶在兔激素性股骨头坏死中起重要作用，其活性与兔激素性股骨头坏死的发生呈显著负相关，其结果与实验研究基本相似。实验分析造成这一结果的机制可能是，细胞色素c从线粒体释放到胞浆后，与Apaf-1(凋亡蛋白酶活化因子1)结合，形成的复合物通过诱导Caspase激活等途径引起细胞凋亡^[31-43]。刘江涛等^[9]研究发现线粒体在应激因素的作用下，促凋亡因子(如细胞色素c)从线粒体释放到胞浆，继而激活caspase-9和caspase-3，导致大量的软骨细胞凋亡。因此，下一步实验要着重探讨细胞色素c是否通过介导caspase-9和caspase-3的活化在兔早期激素性股骨头坏死发生发展中的发挥重要角色。

综上可知，细胞色素c参与的细胞凋亡可能在兔早期激素性股骨头坏死中起重要作用，其高表达率与兔激素性股骨头坏死的发生呈显著正相关。但实验尚存在以下不足：①细胞色素c参与的细胞凋亡在早期激素性股骨头坏死中的具体机制仍需进一步探明，需要进一步明确细胞色素c参与的细胞凋亡过程的促发因素和抑制因素，来阐明其在早期激素性股骨头坏死中详细角色；②样本量仍较少，存在一定的误差，这是实验下一步的研究重点和方向。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

早期激素性股骨头坏死过程中细胞色素c的作用

Effects of cytochrome c on early steroid-induced femoral head necrosis

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