组织工程小口径血管的制备及性能检测

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0071

摘要/Abstract

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文题释义：

血管组织工程：在体外获取、纯化和扩增血管壁内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞，接种于管状组织工程支架材料上，体外培养同天然血管结构和功能相似的组织，植入体内一段时间后，支架材料降解消失，剩余部分经生长和重塑具有体内正常血管所需的生物学功能和生物力学强度。

组织工程血管支架材料的特点：在组织学上，血管壁细胞外基质主要由3层结构组成，其中中膜层有重要的生理意义，主要成分有胶原纤维和弹性蛋白，这种结构赋予血管良好的机械性质和顺应性。所以，在设计和制造血管组织工程支架材料时，应尽可能地模拟自然血管的细胞外基质的成分、三维结构、生理功能及机械性能。

背景：由于材料来源问题、材料血液相容性和抗凝性能不佳，致使小口径组织工程血管无法应用于临床。

目的：探究经过脱细胞处理后绵羊颈动脉的理化性能及力学性能，为制备组织工程血管寻找合适材料。

方法：获取新鲜离体绵羊颈动脉，分2组处理，对照组进行修剪及清洗处理，冻存备用；实验组进行修剪及清洗处理后，以Triton X-100+脱氧胆酸钠盐+EDTA进行脱细胞处理24 h，漂洗72 h，接着以RNA酶/DNA酶消化24 h，漂洗24 h后冻存备用。将两组血管进行苏木精-伊红染色、胶原纤维染色、弹力纤维染色及电镜扫描观察，检测血管的抗拉力强度、血管壁张力及厚度。

结果与结论：①胶原纤维染色显示，对照组胶原纤维排列整齐，致密，无明显断痕；实验组胶原纤维排列整齐，致密，无明显断痕；②苏木精-伊红染色显示，对照组细胞核分布在血管的内膜、中层、外膜，纤维走行规则；实验组纤维走行规则，较松散，内膜、中层、外膜无明显细胞核分布；③弹力纤维染色显示，对照组弹力纤维分布规则，整齐，主要在于血管的中层及外膜；实验组弹力纤维走行规则，但较疏松，主要分布在于血管中层及外膜；④电镜扫描显示，实验组血管保持原有的形态，未见细胞结构残留，胶原纤维走行规则，连续性完整，孔隙结构较均匀；⑤实验组血管厚度低于对照组(P < 0.01)，两组拉力强度无差异，均可承受46.55 kPa的压力；⑥结果表明，经脱细胞处理的绵羊颈动脉，在最大程度去除抗原性的基础上保留了血管必要的力学性能。

ORCID: 0000-0002-3887-944X(李温斌)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 组织工程血管, 生物材料, 羊颈动脉, 脱细胞, 核酶, 力学性能

Abstract:

BACKGROUND: Due to limited sources, poor hemocompatibility and poor anticoagulation performance, small-diameter tissue-engineered blood vessels cannot be applied in clinical practice.

OBJECTIVE: To explore the physicochemical and mechanical properties of sheep carotid arteries after the decellularization in order to find appropriate materials for the preparation of tissue-engineered blood vessels.

METHODS: Fresh carotid arteries from sheep were randomly divided into two groups: control group, in which, the sheep carotid arteries were cryopreserved for use after trimming and cleaning; experimental group, in which, after trimming and cleaning, the carotid arteries were decellularized by Triton X-100, sodium deoxycholate and EDTA for 24 hours, rinsed for 72 hours, digested with RNA/DNA enzymes for 24 hours, rinsed for 24 hours and reserved for later use. In both groups, blood samples were subjected to hematoxylin-eosin staining, collagen fiber staining, elastic fiber dyeing, and electron microscopy observation. The physical and chemical properties of the blood vessels are tested by tensile strength, wall tension and thickness.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) The collagen fibers in both two groups were neat and compact in alignment, with no obvious fracture.

(2) Hematoxylin-eosin staining showed that: in the control group, the nuclei were distributed in the inner membrane, middle lamella and outer membrane of the vessels, and the fibers ran regularly; in the experimental group, the fibers ran in order but loosely, and there were no nuclei in the inner membrane, middle lamella and outer membrane of the vessels. (3) Elastic fibers in the control group were regular in alignment and mainly distributed in the middle lamella and outer membrane of the vessels, while in the experimental group, the elastic fibers ran regularly but loosely, and mainly distributed in the middle lamella and outer membrane of the vessels. (4) Under the scanning electron microscope, the originally formed vessels were observed in the experimental group, with no cell residues, and the collagen fibers ran orderly with no fracture and with uniform pore structure. (5) The vessel thickness was lower in the experimental group than the control group (P < 0.01), but the tensile strength showed no difference between the two groups, which was 46.55 kPa in the two groups. To conclude, the decelluarized sheep carotid artery can retain the necessary mechanical properties of the blood vessels after achieving the maximum removal of antigenicity.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Blood Vessel Prosthesis, Carotid Arteries, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 4

2.1 血管胶原纤维染色结果对照组胶原纤维排列整齐，致密，无明显断痕；实验组胶原纤维排列整齐，致密，无明显断痕，见图1。

2.2 血管苏木精-伊红染色观察结果对照组蓝色的细胞核分布在血管的内膜、中层、外膜，纤维走行规则；实验组纤维走行规则，较松散，内膜、中层、外膜无明显蓝染细胞核分布，内膜蓝染区为未洗涤干净的染剂，见图2。

2.3 血管弹力纤维染色结果对照组弹力纤维分布规则，整齐，主要在于血管的中层及外膜；实验组弹力纤维走行规则，但较疏松，主要分布在于血管中层及外膜，见图3。

2.4 血管电镜扫描结果经冷冻干燥后处理，电镜扫描下可见两组血管保持原有的血管形态，胶原纤维走行规则，连续性完整，孔隙结构较均匀；对照组可见细胞结构残留，实验组未见细胞结构残留，见图4。

2.5 血管厚度及拉力强度检测结果

厚度测试结构显示：对照组、实验组血管平均厚度分别为1.29，1.02 mm，组间比较差异有显著性意义 (P < 0.01)，说明经过脱细胞处理血管较未经处理血管壁组成成分有一定程度的减少。

拉力强度测试结果：对照组、实验组血管平均拉力强度分别为2.96，3.04 N/mm²，组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)，说明经脱细胞处理血管与未经处理血管在抗张力强度上无明显差异。

2.6 血管压力承受值测试结果

压力测试发现：两组血管均可承受46.55 kPa压力值，实验组血管在该压力下大体观察可见轻度假瘤样扩张；在压力达到53.2 kPa时，对照组血管呈瘤样扩张，实验组血管破裂。

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引言

心血管疾病已成为危害人类健康的主要疾病，最常用的治疗手段为血管移植。1898年Gluck进行了自体大隐静脉移植并取得成功^[1]，但由于自体血管移植来源有限，而且也受到自身血管条件的限制，临床上需要大量的人工血管替代物^[2-4]。人们尝试了各种异体血管移植的方法，但其远期效果差，容易发生血栓形成、血管变性及增生、血管狭窄和闭塞^[5-6]。

近年来兴起的组织工程为这一临床难题提供了新的思路，其以细胞生物学、材料科学和工程学为基础理论^[7]，在体外培养、扩增种子细胞，种植于生物相容性好的生物材料上，形成细胞-生物材料复合物，植入体内来替代宿主因疾病、创伤等原因所造成组织细胞结构缺损、功能丧失的组织或器官，以达到对宿主组织结构的修复和功能重建^[7-8]。

截至目前，尚无小口径(直径<5 mm)人工血管移植完全适应于临床的报道^[9-10]。其主要原因是材料来源问题、材料血液相容性和抗凝性能不佳，当材料与血液接触后，激活体内的凝血系统，引起血小板和纤维蛋白聚集形成血栓，造成管腔狭窄及闭塞^[11-12]。当小口径人工血管植入体内后，容易致血栓形成，严重影响移植血管的再通率^[13]，远期还会出现内膜增生^[14-16]。这些因素限制了组织工程小口径血管的研究进展，实验的设计意义在于寻找合适的小口径组织工程血管，为后续性能检测、动物实验研究及未来的临床应用奠定理论和实验基础，为解决目前临床冠状动脉血管移植缺少桥血管及远期通畅率问题寻找解决方法^[17]。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计材料制备，对比观察实验。

1.2 时间及地点实验于2014年10月至2015年3月在北京安贞医院心肺所完成，部分指标检测在北京大学医学部细胞实验室中心、北京中医科大学测试中心完成。

1.3 材料

血管材料：成年绵羊的颈动脉，取材于河北大厂芳华屠宰场。

实验用主要试剂和仪器：Triton-X100、乙二胺四乙酸二钠、脱氧胆酸钠(Sigma)；RNA酶/DNA酶、青链霉素/两性霉素B、二甲基亚砜(北京东灵旭美生物科技有限公司)；PBS(南京森贝伽生物科技有限公司)；SHZ-82A数显恒温气浴振荡器(镇江实验仪器批发商)；HH400-2B水浴箱(上海启前电子科技有限公司)；YX-280D高压灭菌锅(深圳市良谊实验室仪器有限公司)；ME-54E天平(梅特勒-托利多国际贸易有限公司)；冷冻式真空干燥机FD-1A-50(天津艾立达实验仪器销售有限公司)；-86 ℃立式超低温冰箱(上海科菱威生物科技有限公司)；Fisher瓶(北京东灵旭美生物科技有限公司)；SW-CJ-1D超净工作台(苏州江东精密仪器有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 试剂配制

PBS：袋装PBS粉末1袋+1 000 mL蒸馏水，高温高压灭菌。

脱细胞终液1 000 mL：2.5 mL Triton X-100+2.5 g脱氧胆酸钠盐+0.2 g乙二胺四乙酸+986.5 mL PBS高温高压灭菌后+10 mL青链霉素(10 000 U/mL)+1 mL两性霉素B(250 mg/L)。

核酸酶终液：RNA酶(100 mg/支，过滤灭菌，即1支配制1 000 mL)+DNA酶(1 500 U/支，过滤灭菌，即一支配制1 000 mL)+100 mL 0.5 mol/L MgCl₂，加已灭菌PBS至 1 000 mL。

漂洗液：无菌PBS+1%双抗+2.5 mg/L两性霉素B+ 1 000 mL蒸馏水。

冻存液：无菌PBS+1%双抗+2.5 mg/L两性霉素B+ 1 000 mL蒸馏水+10 mL二甲基亚砜(10%)。

1.4.2 实验分组对照组，将新鲜的绵羊劲动脉在完成修剪、清洗血管后，置入装有冻存液Fish瓶中，在-80 ℃下冻存备用。实验组制备组织工程血管。

组织工程血管制备方法：①修剪、清洗血管：在无菌操作台中，将新鲜羊颈动脉浸泡于含有双抗+两性霉素BD的容器中，进行适当的清洗及修剪，去除血管外膜附着物及管腔内血栓，保留血管内膜、中层、外膜的完整结构，反复用漂洗液清洗5次，直至管腔内无血栓；②冷冻阶段：清洗后的血管置入分量放入装有冻存液的无菌Fisher (500 mL)中，进行梯度降温冷冻处理和保存(-80 ℃)，冷冻处理12 h；③孵育阶段：取出一Fisher瓶血管，置入恒温振荡器(37 ℃，200 r/min)孵育32 h，期间每隔8 h更换新的漂洗液及Fisher瓶，无菌操作，避免污染；④脱细胞阶段：将孵育后的血管分量，置入含有脱细胞终液的无菌Fisher(250 mL)瓶中，在恒温振荡器中匀速震荡24 h (37 ℃，200 r/min)，期间每隔8 h更换一次脱细胞液及无菌Fisher瓶；⑤漂洗阶段：将经过脱细胞液处理的血管置入装有漂洗液的Fisher瓶(250 mL)中，进行漂洗处理，共漂洗72 h，每隔8 h更换一次漂洗液及Fisher瓶，无菌操作，避免污染；⑥核酶消化阶段：将漂洗后的血管置入装有DNA酶+RNA酶的Fisher(250 mL)瓶中，进行24 h的核酶液消化处理，期间每隔8 h进行一次核酶液及Fisher瓶更换；⑦终末漂洗阶段：将经核酶液消化的血管进行24 h的终末漂洗处理，每隔8 h更换漂洗液及Fisher(250mL)瓶。漂洗结束后将一部分血管置入无菌培养皿中在-80 ℃超低温冰箱进行冻存处理，剩下的血管同样冻存备用。

1.5 主要观察指标

胶原纤维染色观察：将两组标本用甲醛液充分固定后，制作成石蜡包块，进行胶原纤维染色处理，绿色组织为胶原纤维。胶原纤维染色步骤^[18-20]：二甲苯脱蜡3次(15 min/次)；体积分数100%-90%-80%-70%乙醇逐级脱苯(1 min/次)；水冲洗3 min，去离子水冲洗3 min；苏木精染10 min，水洗1 min；丽春红染30 min，亮绿色染2 min；90%二甲苯泡3次(15 min/次)；封固观察。

苏木精-伊红染色观察：苏木精-伊红染色法常用于石蜡切片技术。苏木精染液为碱性，能使细胞核内染色质与胞质内核糖体染成蓝紫色；伊红为酸性染料，能使细胞质和细胞外基质染成红色^[19，21]。将两组标本用甲醛液充分固定后，制作成石蜡包块，进行苏木精-伊红染色处理。苏木精-伊红染色方法：二甲苯脱蜡3次(15 min/次)，体积分数100%-90%-80%-70%乙醇逐级脱苯(1 min/次)，水冲洗 3 min，去离子水冲洗3 min；苏木精染10 min，水洗3 min；醋酸分色2 s，水洗3 min；去离子水洗3 min，蓝染2 s，水洗3 min去离子水洗3 min；伊红染1 min，去离子水洗 3 min；体积分数100%-90%-80%-70%乙醇逐级脱苯 (1 min/次)；二甲苯脱蜡3次(15 min/次)；封固观察。

弹力纤维染色观察：将两组标本用甲醛液充分固定后，制作成石蜡包块，进行弹力纤维染色处理，蓝色为弹力纤维^[21-22]。弹力纤维染色方法：二甲苯脱蜡3次(15 min/次)；体积分数100%-90%-80%-70%乙醇逐级脱苯(1 min/次；；高锰酸钾泡5 min，水洗1 min；硫酸亚铁泡1 min，水洗 5 min；维多利亚蓝染24 h，95%乙醇漂洗2次(1 min/次)；核固红染5 min，去离子水洗1 min；体积分数100%-90%-80%-70%乙醇逐级脱苯(1 min/次)；二甲苯脱蜡3次(15 min/次)；封固观察。

电镜切片：将两组血管进行电镜切片，具体处理如下^[23]：2.5%戊二醛固定，PBS冲洗；1%锇酸固定1 h；乙醇脱水(体积分数30%、50%、70%、80%、90%、100%乙醇)，各10-15min；EPON812树脂浸6 h；固定玻片， 45 ℃/60 ℃各聚合12 h；立体显微镜定位，离子喷镀仪镀膜；扫描电镜观察。

厚度及拉力强度检测：两组血管各取10个标本(长度约20 mm)，纵向剪开并铺平成长方形，用厚度仪及游标卡尺测量其厚度及宽度。将各组血管片安置于拉力计测量最大拉力(2 mm/s牵拉)，根据公式最大拉力强度=最大拉力值F/横截面积S^[24]。

压力承受值测试：检查血管有无分支，如有进行结扎。结扎血管一端，另一端于三通管一端口紧密连接，将换能器、注射器于三通管另两端口连接。用注射器向血管注入生理盐水，监测血管内压力变化并记录血管爆破时压力值^[25-26]。

1.6 统计学分析采用SPSS 17.0统计分析软件进行数据分析，不同血管组之间的血管厚度及拉力结果采用t 检验，P ≤ 0.05表示差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

实验中采用的脱细胞方法为联合应用Triton X-100及DNA/RNA核酶为脱细胞试剂^[27-29]，前期预实验对脱细胞血管进行了力学测试及DNA含量检测，证实使用该方法能完全脱去血管中的各类细胞，最大程度地降低血管的免疫原性，同时也能保存支架的完整性，与Wang^[30]、Xie等^[31]报道相符。

在血管生物力学测定中，虽实验组血管平均厚度 (1.02 mm)与对照组血管平均厚度(1.29 mm)相比明显变薄，但在张力实验及拉力实验中，实验组血管还是表现出满意的特性，对照组所能承受的拉力为2.96 N/mm²，实验组所能承受的平均拉力强度为3.04 N/mm²，实验组血管还是表现出轻微的抗拉力增强趋势，考虑为是经脱细胞处理后，细胞基质成分在彼此发生融合粘连^[32]，增加了抗拉力强度^[33]。在对血管的张力实验中，两组血管均可承受 46.55 kPa压力值，实验组血管在该压力下大体可见轻度假瘤样扩张；在压力达到53.2 kPa时，对照组血管呈瘤样扩张，实验组血管破裂。实验组血管还是能经受住一定程度的血管壁张力^[34]，说明其血管原有的张力性能未在脱细胞处理中破坏。在血管的苏木精-伊红染色、免疫荧光染色、生物力学测定及电镜扫描观察中可看出，实验组血管基质中未发现原有的细胞残余成分^[35-37]，例如成纤维细胞、内皮细胞、红细胞、粒细胞等细胞成分；生物力学测定结果显示，经脱细胞处理的血管平均厚度为1.02 mm，未经处理的血管厚度为1.29 mm，说明经脱细胞处理的血管中成分明显减少。生物组织植入异体生物体内引起炎症反应及排斥反应的主要抗原成分是细胞结构及蛋白，脱细胞处理法能最大程度地去除细胞成分及少量蛋白成分^[38-39]，即可最大程度地去除其抗原性，降低植入异种生物体内引起的免疫排斥反应，增加组织相容性^[40-41]。

实验中需要谨慎处理的地方在于：①选择合适易获取的小口径组织工程血管，临床上常用的移植血管直径多在3-5 mm，此次实验采用的血管材料为绵羊劲动脉，血管口径满足研究需要，来源也广泛。之前实验设计中计划使用犬的颈动脉、兔腹主动脉及人脐动脉^[42]，但因血管自身条件不合适及来源问题限制而放弃；②血管离体后要尽快进行实验处理，清理掉血栓及血管外的结缔组织。在脱细胞处理过程中，各个环节尽量遵循无菌操作及应用一定量的抗生素及抗真菌药物，避免细菌感染滋生^[43]。

实验证明了联合应用Triton X-100及DNA/RNA核酶为脱细胞试剂，能在保留血管原有基本结构的基础上保留血管的原有性能，也能最大程度地去除血管抗原性，为组织工程血管研究提供理论基础及提供实验材料，也进一步验证了组织工程血管的相容性。经脱细胞处理的绵羊颈动脉血管在最大程度去除抗原性的基础上，保留了血管必要的力学性能，是制备组织工程小口径血管和探究其动物实验的合适材料。但是研究存在不足：经过脱细胞处理的血管实验室检测指标还有待增加，例如DNA残余量；实验中采用脱细胞方法为Triton X-100及DNA/RNA核酶法，未设立不同方法脱细胞组对照实验。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程