非人类灵长类动物在解剖结构、免疫功能以及病理生理反应与人类十分相似，接近临床实际，能模拟临床肝移植的全部过程，因此是人类肝移植临床前期研究较为理想的动物模型
[5-6]。本实验采用非人类灵长类动物-恒河猴，在以往的动物肝移植模型建立的基础上结合临床肝移植手术操作进行了改进，使得恒河猴肝移植模型操作简化，建立了稳定的恒河猴肝移植模型。本实验在建立恒河猴肝移植动物模型的过程中获得了如下体会：
3.1 原位肝移植手术方式的选择 在人类原位肝移植的手术方式主要分为经典原位肝移植术和背驮式肝移植[9]，经典原位肝移植术主要开展与肝移植手术的早期阶段和肝脏恶性肿瘤患者实施肝移植手术时，操作时要完整切除病肝的肝后下腔静脉，供肝植入时需要分别吻合肝上与肝下下腔静脉[9]，而背驮式肝移植属于肝移植手术发展到较成熟阶段出现的一种改良的手术方式，将供受体肝后段下腔静脉做“V”整形后，采用3定点的连续缝合方式进行供受体腔静脉的吻合，与经典式原位肝移植术式比较，改良背驮式肝移植主要用于非恶性肿瘤肝病的肝移植，术中不需要切除受体的肝后下腔静脉[10]。在实施恒河猴肝移植时观察到，恒河猴的肝后段下腔静脉整段包埋在肝实质中潜行，最薄处距离肝表面尚有0.5~1.0 cm的距离，这与人类肝脏肝后段下腔静脉部分裸露于肝脏外不同，因此若行背驮式肝移植，势必切开肝后段下腔静脉后面覆盖的肝组织，极易造成受体自身肝脏切取和供肝植入后该区域无法控制的出血。因此，恒河猴原位肝移植动物模型的建立手术方式必然采用经典原位肝移植的术式，这一点与文献报道的猴肝移植动物模型建立术式是一致的[5-6]。
3.2 二袖套法在恒河猴肝移植术中的应用和改良 恒河猴肝移植模型建立时选择了目前比较广泛使用的“二袖套法”[11]，并行肝动脉的重建。本实验体会出恒河猴肝移植袖套法的独特之处：①三袖套法不适用于该模型的建立：预实验的初期作者也尝试过“三袖套法”[12]，发现胸段下腔静脉表面和胸膜和膈肌环粘连紧密，只有与胸膜分离后该段腔静脉才具有腹部下腔静脉的延展性，才可以进行合适口径袖套管的安装，但分离胸膜和膈肌环时极易导致该段静脉壁破裂，实验失败，且应用不当易发生袖套扭转、脱落，静脉回流不畅等并发症，操作的可行性较差。②袖套管的选材和处理：目前大鼠肝移植的袖套管多可选用临床介入手术时使用的动脉鞘管修剪而成[11]，但恒河猴门静脉和下腔静脉较粗，无合适口径的动脉鞘管可供使用，本实验选用薄壁的、张力和柔韧性适中的聚氯乙烯管作为管材，与报道的管壁烧灼刻痕不同[11]，作者采用血管钳对管壁进行整体环形螺纹状钳夹刻痕，刻痕均匀，深浅基本一致，不减弱管壁的柔韧性，还可增加管壁的张力，以便血管壁反套至袖套管上可牢靠结扎固定。③袖套管安装和吻合的技巧：移植术中袖套管脱落、扭曲和狭窄是袖套管安装和吻合失败的主要因素，由于袖套管管径较粗，供肝门静脉和下腔静脉在无血状态下会皱缩，安装袖套管时需要将术者与助手相互配合，充分牵开血管壁，均匀反套于袖套管上，血管管腔需位于袖套管腔中心位置，偏心后会导致血管腔狭窄，在袖套管安装时使用1号丝线环形结扎2次，确保结扎牢固，以免袖套吻合时或者吻合后血管壁受牵拉从袖套管上脱落，引起严重后果，袖套吻合时一定要理顺供受体血管，确保无扭曲，袖套吻合受体端血管尽量套入袖套管，避免吻合后由于血管过长导致血流不通畅，在完成袖套吻合前，需对受体血管端试放血，冲出血管断端形成的血栓，并用肝素盐水冲洗袖套管内腔和受体端血管，确保吻合后吻合处无血栓形成。④二袖套法的优势：与临床肝移植相比，动物实验时采用二袖套法进行门静脉和肝下下腔静脉的吻合可明显缩短手术时间和无肝期，同时由于袖套法吻合血管，吻合处血管内膜光滑，无缝线存在，术后吻合口形成血栓的机会明显减少。实验中门静脉和肝下腔静脉袖套吻合的时间分别为1.0~2.0 min，术中术后未发现吻合口血栓形成，这也是该动物模型能稳定建立的主要因素之一，充分体现了二袖套法肝移植模型建立的优势。
3.3 术中严密止血、输血补液是手术成功的关键 与大鼠相比，兔、猴、犬、猪等大动物稳定建立原位肝移植动物模型是较为困难的[6，13-15]，建立大动物肝移植模型一般应具备大量大鼠肝移植动物模型建立的经验，通过与大鼠肝移植比较，研究中发现恒河猴在肝移植术中对失血的耐受能力差，通常失血100 mL左右就会出现末梢循环障碍，凝血功能由术前的高凝状态急转为移植术后的低凝状态[5-6]，严重影响移植模型建立的稳定性，因此术中的严密止血和输血补液显得尤为重要。
在移植术中作者预防和治疗术中失血的经验为：①采集供体全血，必要时对受体实施术中输血：根据文献报道[16]，恒河猴的血型一般为类人类B型，但也存在不同的亚型，目前条件下确定恒河猴血型的亚型较为困难，若不进行术前交叉配血，术中输血仍有发生溶血和凝集的可能，因此术前采集预配对的供受体全血，分离血浆和红细胞，进行交叉配血试验，无溶血和凝集者方可进行术中输血，采集供体全血一般可达到100~ 300 mL，基本可以满足受体术中失血时输血需要。②受体术中自身输血：肝移植术中，受体自身肝脏中含血量一般为肝质量的1/3~1/5，50~100 mL血液，在大鼠肝移植时，切肝前通常经门静脉进行驱血处理[17]，实施自身输血，本实验借鉴了这一经验，在恒河猴自身肝脏切除前，进行驱血处理，一般可自身输血50~100 mL，避免该环节失血对受体的打击。③供肝组织断面的严密止血：肝移植术中，供肝修整是极其关键的步骤，供肝修整的过程中既要尽可能修去多余的组织，准确地保留相关的出入肝管道，又要严密止血，在这方面本实验借鉴了临床肝移植的修肝经验并有所改进[18]，对肝周韧带进行全范围的妥善结扎处理，修肝接近完成时，通过肝动脉门静脉注液观察第一肝门组织断端有无残余漏液处，阻断肝上肝下下腔静脉，经门静脉灌注液体，观察全肝特别是腔静脉有无漏液，进一步排查供肝可能岀血部位，采用该“三步漏液检查法”一般可严密控制供肝岀血。受体肝脏切除时简化步骤，严密止血：受体自身肝脏切除，切缘岀血构成了恒河猴肝移植术中岀血的一部分，操作过程中，作者采用了临床肝移植病肝切除经验，简化受体肝脏手术操作过程，在简单游离肝周韧带和解剖第一第二肝门后，依次阻断门静脉主干、经门静脉驱血、阻断肝下下腔静脉，最后阻断肝上下腔静脉，使肝脏和肝后腔静脉内的血液充分回流后，切除肝脏，在研究中肝周不进行过多的游离，只分离出需要阻断的大血管，驱出肝内血液后，在全肝血流阻断后切取肝脏，能明显减少出血，缩短切肝时间。本实验中受体肝脏切取时出血(10±5) mL。⑤受体术中适时补液输血及用药，维持动物循环稳定：除了在切肝时驱血补液，无肝期适量输液，依靠血管活性药物多巴胺维持血压，肝脏血流一开放即输入碳酸氢钠纠正酸中毒， 静脉推注葡萄糖酸钙对抗高钾，输血补充血容量，手术完毕后继续输代血浆或者全血补充失血， 扩容， 继续静脉滴注活性药物多巴胺维持血压及有效循环的稳定。
3.4 缩短无肝期是恒河猴肝移植手术成功的主要因素 与大鼠原位肝移植一样，无肝期是影响恒河猴原位肝移植手术成功的主要因素，无肝期时受体肠道持续淤血，大量的内毒素可通过肠道静脉系统流入肝脏，加重肝脏的损伤[19]。有学者认为无肝期过长可能导致移植肝无功能的发生率明显增高，无肝期过长对肾功能也有显著的影响[20]。本实验在门静脉的处理中使用的袖套法，在完成门静脉重建后，开放门静脉，从肝下下腔静脉放血3~ 5 mL，排除肝脏内气泡及冷灌注液，阻断肝下下腔静脉，开放肝上下腔静脉结束无肝期。受体平均无肝期为(17±4) min。与门静脉吻合法相比，门静脉袖套法明显缩短了无肝期，也避免了由于吻合不当导致的门静脉扭曲或狭窄等并发症，相关研究显示在大动物肝移植模型中门静脉使用袖套法并不会增加门静脉血栓形成[21]。有学者认为常规的吻合方法需要较长时间地钳夹血管，可能导致血管内膜损伤而增减血管并发症的发生[22]。也有研究者认为在小动物肝移植时可以通过夹闭腹主动脉增加无肝期的耐受时间提高手术成功率[23]，但作者在与研究中试用这种方法没有收到相同的效果，可能该方法并不适合大动物肝移植模型的建立。
3.5 肝动脉重建在恒河猴肝移植模型中的应用 尽管有诸多的研究报道大鼠原位肝移植动物模型建立时是否吻合肝动脉对移植术后的生存率和生存时间无显著影响[24]，但在临床肝移植中不吻合肝动脉是不可想象的，临床肝移植术后肝动脉血栓形成往往会导致短期内移植物丧失和需要急诊手术甚至急诊再次肝移植，可见临床肝移植肝动脉血栓或者栓塞会导致灾难性的后果[25]，观察恒河猴正常解剖时发现恒河猴的肝固有动脉外径可达到3.0~4.0 mm，内径可达到1.0~2.0 mm，对肝脏的血液供应量较大，若术中不实施肝动脉重建可能同临床肝移植一样会导致术后肝组织和胆管组织坏死，影响移植术后急性排斥反应的预测和观察，缩短移植术后动物的存活期，另外观察恒河猴的肝总动脉末端，可发现该处可进行修剪，做喇叭口整形，供受体整形后的吻合口口径可达到2.0~3.0 mm，这对经常从事临床肝移植肝动脉吻合手术的操作者来讲，完成恒河猴肝移植肝动脉吻合在外科操作技术上是稳定可行的。本实验采用显微外科技术，应用2.5~4.0倍手术放大镜，重建肝动脉，取得良好效果，仅2例出现肝动脉血栓形成，有1例受体肝动脉十分纤细，在解剖第一肝门时不慎损伤，作者采用了临床肝移植中肝动脉-腹主动脉搭桥重建肝动脉， 但终因手术时间过长和术后腹腔内出血，存活9 h死亡。
总之，实验在临床肝移植和其他动物模型基础上进行改进，采用二袖套法经典原位肝移植手术方式简化了手术操作，明显的缩短了无肝期，减少了出血，提高了术后生存率，延长了术后生存时间，建立了稳定的恒河猴肝移植模型，为后续研究提供了可靠的基础动物模型。
