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心脏的发育过程是在多种转录因子的作用下进行转录调节的。这些复合物包括了超过20种不同的转录因子，研究最多的有GATA结合蛋白4 (GATA bind protein 4，GATA 4)、NK2相关转录因子5和T盒转录因子5等转录因子 等^[1] 。其中GATA4是影响心脏发育的关键性转录因子之一，也是胚胎发育过程中的早期标志之一。在胚胎发育的7~7.5 d的晚期原条阶段，其中胚层就可检测到GATA4 mRNA的存在，随后在心内膜及心肌中表达，并且大量的GATA4 mRNA继续在动物心肌中表达。 本课题组在前期研究中首次在中国散发性先天性心脏病患者中发现其GATA4基因外显子3的第52，58，61位分别插入一个碱基A，等位基因的突变频率在先心病患者与正常人之间差异显著^[2] 。 为了深入探讨转录因子GATA4在先天性心脏病发病过程中可能的作用，实验应用酶切、PCR电泳、核酸提取等技术构建含有GATA4的真核表达载体，并将此重组质粒转染入心肌细胞，观察细胞形态学和生物学行为可能的改变。

心脏是脊椎动物胚胎最早发育的器官之一，心脏发育的几个关键环节包括：心脏细胞的分化、心脏管形态发生和环化、心脏瓣膜和大血管的形成。先天性心脏病是最常见的出生缺陷，在活产婴儿的发生率接近1.2%，对于母亲患有先心病的婴儿，其先心病的发生率增加2%~5%^[3] 。绝大多数的先心病由怀孕第3~8周的胚胎发育阶段的缺陷引起，胚胎心血管主要结构在此阶段发育形成。先心病的发生与基因和环境因素有关，但大多数先心病的病因 并不清楚。 许多基因通过编码转录因子、黏附分子、离子通道、信号分子和结构蛋白来控制心脏形态的发育。心源性的转录因子是心脏组织必需的转录激活因子，它们调节编码结构蛋白和调节蛋白的心脏相关基因的表达。已经有许多的研究表明转录因子参与了一系列复杂的基因之间的相互作用，这对于了解心脏基因的表达调节机制和先心病发生的病理基础是非常重要的。 人类GATA4基因是一类含有锌指结构的组织特异性表达的转录因子，能结合共同序列(A/T)GATA(A/G) ^[4] 。它位于人类染色体8p23.1-p22，总长度55 757 bp，有7个外显子，cDNA全长3 372 bp，编码序列全长1 329 bp。所有GATA蛋白质中锌指C末端的DNA识别区都是高度保守的。DNA结合域由两个锌指结构组成，每一个锌指结构区由两个Cys-X-Cys(Cys为半肌氨基酸，X为可变氨基酸)结构组成，中间有17个氨基酸间隔即序列为Cys-X2-Cys-X17-Cys-X2-Cys，其中4个半胱氨基酸与1个锌离子组成四面体结构，扭曲为折叠或螺旋状。两个锌指结构功能不同，C梭基末端锌指是DNA结合所必需的，而N氨基末端锌指并不能直接结合DNA，但能影响DNA结合的稳定性和特异性以及GATA4转录因子的转录活性^[5] 。GATA4的表达起始于心脏中胚层的早期，并且在心脏组织中持续高水平表达。许多心脏表达基因的调控区都有GATA4的功能性结合位点，这提示GATA4在心脏发育过程中是必需的^[6] 。 最近的研究发现，GATA4基因的突变与家族性房间隔缺损、室间隔缺损、法洛氏四联征、心内膜垫缺损、左心发育不全综合征和右室双出口等先天性心脏缺陷的发生有关^[7-12] 。荧光原位杂交分析发现先天性心脏病患者缺乏GATA4^[13] 。小鼠中GATA4控制心脏前体下内胚层的正常形成。在GATA4剂量不足的情况下，内胚层细胞不能正常分化，并且内胚层腹部的迁移是被抑制的，同时也阻止了心肌细胞的移动，导致心脏裂的形成[14]，这是先天性心脏病形成的一个重要原因。 GATA4的表达对心肌细胞标志物的转录和表达至关重要。这些标志物有β肌球蛋白重链、心肌肌钙蛋白C、心房利钠肽、脑钠肽和钠钙离子通道等^[15] 。二甲基亚砜可以诱导P19细胞向心肌分化，但用反义RNA阻断GATA4表达后，P19细胞的分化也受到了阻断，各种心肌细胞的标志物如Nkx2.5，心肌收缩蛋白(心肌肌钙蛋白C和β肌球蛋白重链)及脑钠肽均受到抑制^[16] 。 许多研究表明，GATA4和Nkx2.5在蛋白质水平相互作用调节心房利钠肽、骨形态发生蛋白和心脏限制性锚蛋白复制蛋白等启动子的表达^[17] 。GATA4在心脏发育过程中与其他转录因子如Nkx2.5和Tbx-5等相互作用而调节心脏的发育^[18] 。心脏限制性锚蛋白复制蛋白基因的表达是由GATA4和Nkx2.5共同调节的，主要依赖GATA4与DNA的结合^[19] 。这些说明了心脏发育是一个复杂的多因子共同参与并相互作用的过程。目前有关转录因子GATA4在心肌细胞中的作用以及其对心肌细胞的发育和增殖影响的体外研究较少，因此有必要通过构建GATA4的真核表达质粒来研究GATA4在心肌细胞以及心脏发育过程中的作用，这有助于进一步理解转录因子GATA4与先天性心脏病之间的关系，为临床上诊治先天性心脏病提供理论依据。 实验首先以对重组质粒pUC57-GATA4进行双酶切获得目的基因GATA4的编码序列，经双酶切后与真核表达载体pCMV-Myc连接，经PCR、双酶切及测序鉴定，结果表明实验成功构建了重组真核表达质粒pCMV-Myc-GATA4。后续实验，将把重组质粒pMCV- Myc-GATA4转染到小鼠心肌细胞中，观察心肌细胞形态学和生物学行为的改变。实验为进一步探讨转录因子GATA4在心脏发育以及先天性心脏病的发生过程中的作用奠定基础。

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