汉防己甲素干预假体周围磨损颗粒诱导下骨溶解模型的体外实验

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3803

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (15): 2358-2363.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3803

• 人工假体 artificial prosthesis • 上一篇下一篇

汉防己甲素干预假体周围磨损颗粒诱导下骨溶解模型的体外实验

刘子歌1，2，刘心蕊2，李燕3，宋国瑞1，张晨1，陈德胜4

宁夏医科大学，1临床医学院，3基础医学院，宁夏回族自治区银川市 750004；2生育力保持教育部重点实验室宁夏生殖与遗传重点实验室，宁夏回族自治区银川市 750004；4宁夏医科大学总医院骨科, 宁夏回族自治区银川市 750004

收稿日期:2020-06-17 修回日期:2020-06-20 接受日期:2020-07-20 出版日期:2021-05-28 发布日期:2021-01-05
通讯作者: 陈德胜，博士，主任医师，教授，宁夏医科大学总医院骨科，宁夏回族自治区银川市 750004
作者简介:刘子歌，男，1993年生，湖南省郴州市人，宁夏医科大学在读硕士，医师，主要从事人工关节基础与临床研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81560364， 81760405)，项目负责人：陈德胜；国家自然科学基金项目(81760395)，项目负责人：李燕

In vitro experiment of tetrandrine on the model of osteolysis induced by wear particles around the prosthesis

Liu Zige1, 2, Liu Xinrui2, Li Yan3, Song Guorui1, Zhang Chen1, Chen Desheng4

1School of Clinical Medicine of Ningxia Medical University, Ningxia Hui Autonomous Region, China; 2Key Laboratory of Fertility Preservation and Maintenance, Key Laboratory of Reproduction and Genetics in Ningxia, Ningxia Hui Autonomous Region, China; 3Basic Medical School, Ningxia Medical University, Ningxia Hui Autonomous Region, China; 4Department of Orthopedics, General Hospital of Ningxia Medical University, Ningxia Hui Autonomous Region, China

Received:2020-06-17 Revised:2020-06-20 Accepted:2020-07-20 Online:2021-05-28 Published:2021-01-05
Contact: Chen Desheng, MD, Chief physician, Professor, Department of Orthopedics, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
About author:Liu Zige, Master candidate, Physician, School of Clinical Medicine of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; Key Laboratory of Fertility Preservation and Maintenance, Key Laboratory of Reproduction and Genetics in Ningxia, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81560364, 81760405 (to CDS); the National Natural Science Foundation of China, No. 81760395 (to LY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
磨损颗粒的作用：磨损颗粒刺激假体周围的巨噬细胞、成骨细胞等产生多种细胞因子诱导破骨细胞生成，导致骨吸收；另一方面，磨损颗粒也影响骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，抑制骨形成。
汉防己甲素：又称粉防己碱，是从汉防己科植物粉防己Stephania tetrandra中提取得到的一种双苄基异喹啉类生物碱，是一种具有多种生物活性的中药单体。

背景：国内鲜有关于汉防己甲素对磨损颗粒诱导的破骨细胞形成与分化方面的相关研究。
目的：探讨汉防己甲素在不同浓度作用下对钛颗粒诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞体外骨溶解模型的积极作用。
方法：将小鼠RAW264.7巨噬细胞分为5组培养：空白组，实验组(含0.1 g/L钛颗粒悬液)，低、中、高浓度药物组(实验组成分+0.1，0.5，1.0 μmol/L汉防己甲素)。CCK-8法检测RAW264.7细胞的增殖活性；抗酒石酸酸性磷酸酶和鬼笔环钛染色法检测成熟破骨细胞的功能和数量；酶联免疫法检测细胞上清液中肿瘤坏死因子α和基质金属蛋白酶9的表达；RT-PCR检测活化T细胞核因子c1、肿瘤坏死因子α和基质金属蛋白酶9的mRNA表达；Western blot法检测核转录因子κBp65、IκBα两者磷酸化蛋白的水平。
结果与结论：①与空白组比较，各浓度的汉防己甲素对RAW264.7细胞增殖没有影响(P > 0.05)；②对照组可观察到较多体积较大、酒红色、F-actin环被荧光绿染的多核破骨细胞，而应用不同浓度的汉防己甲素处理后，破骨的细胞数显著降低(P < 0.05)，F-actin环大小随着药物浓度的增加而减少；③与空白组比较，实验组的IκBα、核转录因子κBp65及其磷酸化程度，细胞培养上清肿瘤坏死因子α和基质金属蛋白酶9蛋白表达量，活化T细胞核因子c1、肿瘤坏死因子α和基质金属蛋白酶9的mRNA显著升高(P < 0.05)，汉防己甲素呈浓度依赖性降低上述指标表达；④综上，汉防己甲素通过抑制NF-κB信号通路可以对钛颗粒诱导下小鼠RAW264.7巨噬细胞体外骨溶解模型产生积极作用。
https://orcid.org/0000-0001-5667-4272(陈德胜)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

关键词: 汉防己甲素, 钛颗粒, 核转录因子κB, 无菌性松动, 骨溶解, 人工假体

Abstract: BACKGROUND: There are few domestic studies on the formation and differentiation of osteoclasts induced by wear particles by tetrandrine.
OBJECTIVE: To explore the positive effect of tetrandrine on the osteolysis model of mouse RAW264.7 macrophages induced by titanium particles under different concentrations.
METHODS: Mouse RAW264.7 macrophages were divided into five groups for culture: blank group, experimental group (0.1 g/L titanium particle suspension), and low, medium, and high concentration drug groups (component+0.1, 0.5, and 1.0 μmol/L tetrandrine). CCK-8 assay was used to detect the proliferative activity of RAW264.7. The anti-tartaric acid phosphatase staining method and the phalloidin staining method were used to detect the function and number of mature osteoclasts. The enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect the cell supernatant expression of tumor necrosis factor-α and matrix metalloproteinase-9. RT-PCR was applied to detect mRNA expression of activated T cell nuclear factor c1, tumor necrosis factor-α, and matrix metalloproteinase 9. Western blot assay was utilized to detect the levels of phosphorylated proteins of nuclear factor κB p65 and IκBα.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the blank group, the various concentrations of tetrandrine had no effect on the proliferation of RAW264.7 cells (P > 0.05). (2) In the control group, more bigger, wine red, and F-actin ring stained with fluorescent green multinucleated osteoclasts were observed, and after treatment with different concentrations of tetrandrine, the number of osteoclast cells decreased significantly (P < 0.05); and the size of F-actin ring decreased with the increase of drug concentration. (3) Compared with the blank group, IκBα and nuclear factor κB p65 and their phosphorylation levels, tumor necrosis factor-α, matrix metalloproteinase-9 cell culture supernatant protein expression, activated T cell nuclear factor c1 mRNA, tumor necrosis factor-α mRNA, matrix metalloproteinase-9 mRNA expression levels were significantly increased in the experimental group (P < 0.05). Tetrandrine reduced the expression of the above indexes in a concentration-dependent manner. (4) In summary, tetrandrine can have a positive effect on the in vitro osteolysis model of mouse RAW264.7 macrophages induced by titanium particles by inhibiting the nuclear factor κB signaling pathway.

Key words: tetrandrine, titanium particles, nuclear factor κB, aseptic loosening, osteolysis, artificial prosthesis

中图分类号:

刘子歌, 刘心蕊, 李燕, 宋国瑞, 张晨, 陈德胜. 汉防己甲素干预假体周围磨损颗粒诱导下骨溶解模型的体外实验[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(15): 2358-2363.

Liu Zige, Liu Xinrui, Li Yan, Song Guorui, Zhang Chen, Chen Desheng. In vitro experiment of tetrandrine on the model of osteolysis induced by wear particles around the prosthesis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(15): 2358-2363.

图/表（结果） 6

2.1 汉防己甲素对小鼠RAW264.7巨噬细胞增殖活性的影响结果表明，加入0，0.1，0.3，0.5，0.7，1.0 μmol/L汉防己甲素的各组细胞增殖活性比较，差异均无显著性意义(P > 0.05)，见图2。因此，该研究选择≤1.0 μmol/L的汉防己甲素用于后续实验。

2.2 汉防己甲素能够抑制钛颗粒诱导体外破骨细胞的形成 TRAP是破骨细胞特异性的标志酶，TRAP染色是鉴定破骨细胞分化成熟的金标准，如果观察到3个或以上细胞核，同时TRAP呈现阳性(酒红色)的细胞便可鉴定为是破骨细胞[5]。结果发现，对照组可观察到较多体积较大、酒红色、内含多个细胞核的破骨细胞；而应用不同浓度汉防己甲素干预后，染色呈阳性的破骨细胞数目随着药物浓度的增加而减少，见图3。实验组、低浓度药物组、中浓度药物组、高浓度药物组的破骨细胞数量分别为(134.31±6.21)，(101.65±4.72)，(67.18±5.71)，(43.28±3.51)个，各组破骨细胞数量比较差异均有显著性意义(P < 0.05)，说明汉防己甲素呈浓度趋势抑制体外破骨细胞的成熟。

2.3 汉防己甲素在有效浓度下能抑制破骨细胞环的形成检测了经汉防己甲素处理的 RAW264.7分化而来的破骨细胞的肌动蛋白骨架和细胞核数目，见图4。未加钛颗粒培养的空白组可见大部分单核细胞聚集，但不融合，加钛颗粒的实验组有少量较大且呈绿色的F-actin环，内含多核细胞，细胞核被DAPI蓝染，细胞膜可见些许伪足；低、中浓度药物组的肌动蛋白骨架环较钛颗粒对照组略有减少，且细胞核减少，高浓度药物组多核细胞明显减少。

2.4 汉防己甲素降低钛颗粒刺激下小鼠RAW264.7巨噬细胞的炎症因子产生量用ELISA试剂盒分别检测5组不同时间点细胞上清肿瘤坏死因子α和基质金属蛋白酶9的表达，评价了汉防己甲素的抗炎作用，见图5。结果发现汉防己甲素对这2种炎症因子有显著的抑制效果，并且这种抑制作用呈剂量依赖性，汉防己甲素浓度达到1.0 μmol/L时，细胞因子几乎不可检测，且抑制率大于95%。

2.5 汉防己甲素控制IκBα和p65的磷酸化影响NF-κB通路目前研究已经证明NF-κB通路在调控破骨细胞的成熟与分化中有重要作用，而p65和IκBα又是整个通路中的关键因子。通过收集汉防己甲素处理5 d后的各组细胞蛋白，发现药物处理组磷酸化的IκBα和p65相对于钛颗粒组有显著降低，且效果呈浓度依赖趋势，见图6。

2.6 汉防己甲素下调NFATc1、肿瘤坏死因子α和基质金属蛋白酶9 mRNA的表达 NFATc1、肿瘤坏死因子α和基质金属蛋白酶9等基因对破骨细胞的活性及骨吸收功能有重要作用，而且这些基因的表达增加伴随着破骨细胞的成熟和分化。实验结果显示，实验组NFATc1、肿瘤坏死因子α和基质金属蛋白酶9 mRNA的表达较空白组明显升高；相比实验组的钛颗粒刺激，在加入汉防己甲素后，NFATc1、肿瘤坏死因子α和基质金属蛋白酶9 mRNA的表达明显被抑制(P < 0.05)，且都体现出剂量依赖性和有统计学差异表现，见图7。

参考文献

[1] 巩栋,吴国泰,甄平.假体周围骨溶解动物模型的研究概况[J].中国组织工程研究,2018,22(15):2421-2426.
[2] GENG T, SUN S, YU H, et al. Strontium ranelate inhibits wear particle-induced aseptic loosening in mice. Braz J Med Biol Res. 2018;51(9): e7414.
[3] 席苑,张海静,叶祖光,等.汉防己甲素现代药理作用研究进展[J].中国中药杂志,2020, 45(1): 20-28.
[4] HE FQ, QIU BY, ZHANG XH, et al. Tetrandrine attenuates spatial memory impairment and hippocampal neuroinflammation via inhibiting NF-κB activation in a rat model of Alzheimer’s disease induced by amyloid-β (1-42). Brain Res. 2011;1384:89-96.
[5] HUANG J, YIN H, RAO S, et al. Harmine enhances type H vessel formation and prevents bone loss in ovariectomized mice. Theranostics. 2018;8(9):2435.
[6] AHN M, LIM H, AHN M, et al. Effect of Extract on Osteoclast Differentiation and Bone-pit Formation. J Korean Med. 2017;38(3): 59-72.
[7] CHEN D, LI Y, GUO F, et al. Protective effect of p38 MAPK inhibitor on wear debris-induced inflammatory osteolysis through downregulating RANK/RANKL in a mouse model. Genet Mol Res. 2015;14(1):40-52.
[8] 王伟,周自华,朱文峰,等.金属-金属假体中钴铬颗粒毒性的研究进展[J].中华骨与关节外科杂志,2019, 12(1):75-80.
[9] 张晓南,徐瑞泽,吴刚,等.不同生物材料假体在人工关节置换中的应用现状[J].中国组织工程研究,2012,16(47):8869-8874.
[10] Ihn HJ, Kim K, Cho H, et al. Pentamidine inhibits titanium particle-induced osteolysis in vivo and receptor activator of nuclear factor-κB ligand-mediated osteoclast differentiation in vitro. Tissue Eng Regen Med. 2019;16(3):265-273.
[11] 许丹,律颖,朱小语,等.小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)的培养及其在诱导破骨细胞中的应用[J].中国骨质疏松杂志,2016, 22(10):1355-1360.
[12] 谢冰洁,冯捷,韩向龙.破骨细胞生物学特征的研究与进展[J].中国组织工程研究,2017,21(11):1770-1775.
[13] 吴飞飞,郭明. 汉防己甲素对缺氧缺糖损伤BV2细胞炎症反应的影响[J].中国临床药理学杂志,2020,36(10):1350-1352.
[14] GAO LN, FENG QS, ZHANG XF, et al. Tetrandrine suppresses articular inflammatory response by inhibiting pro‐inflammatory factors via NF‐κB inactivation. J Orthop Res. 2016;34(9):1557-1568.
[15] LV Q, ZHU XY, XIA YF, et al. Tetrandrine inhibits migration and invasion of rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes through down-regulating the expressions of Rac1, Cdc42, and RhoA GTPases and activation of the PI3K/Akt and JNK signaling pathways. Chin J Nat Med. 2015;13(11):831-841.
[16] YAN L, LU L, HU F, et al. Piceatannol attenuates RANKL-induced osteoclast differentiation and bone resorption by suppressing MAPK, NF-κB and AKT signalling pathways and promotes Caspase3-mediated apoptosis of mature osteoclasts. R Soc Open Sci. 2019;6(6):190360.
[17] ZHA L, HE L, LIANG Y, et al. TNF-α contributes to postmenopausal osteoporosis by synergistically promoting RANKL-induced osteoclast formation. Biomed Pharmacother. 2018;102:369-374.
[18] KIM Y, KIM J, LEE H, et al. Tetracycline Analogs Inhibit Osteoclast Differentiation by Suppressing MMP-9-Mediated Histone H3 Cleavage. Int J Mol Sci. 2019;20(16):4038.
[19] CUI Y, ZHAO X, MEI L, et al. Osteon myospalacem baileyi attenuates osteoclast differentiation through RANKL induced NFAT pathways. J Ethnopharmacol. 2018;213:65-71.
[20] LI A, CONG Q, XIA X, et al. Pharmacologic calcitriol inhibits osteoclast lineage commitment via the BMP‐Smad1 and IκB‐NF‐κB pathways. J Bone Miner Res. 2017;32(7):1406-1420.
[21] DENG Z, JIN J, WANG Z, et al. The metal nanoparticle-induced inflammatory response is regulated by SIRT1 through NF-κB deacetylation in aseptic loosening. Int J Nanomedicine. 2017;12:3617.
[22] 张云鸽,宋科官. 假体周围磨损颗粒诱导骨溶解:钙调磷酸酶/活化T细胞核因子信号通路作用的研究进展[J].中国组织工程研究, 2017,21(7):1115-1122.
[23] 姜建浩,李朋,杜刚强,等.钴铬颗粒刺激成骨细胞前体细胞可能加重假体周围的炎症反应(英文)[J].中国组织工程研究,2019, 23(26):4101-4108.
[24] KITAZAWA R, HARAGUCHI R, FUKUSHIMA M, et al. Pathologic conditions of hard tissue: role of osteoclasts in osteolytic lesion. Histochem Cell Biol. 2018;149(4):405-415.

引言

材料方法

1.1 设计细胞学随机对照实验。
1.2 时间及地点实验于2019年2月至2020年2月在生育力保持教育部重点实验室宁夏生殖与遗传重点实验室完成。
1.3 材料 DMEM高糖培养基、胎牛血清(美国Gbico公司)；商品纯化钛颗粒，颗粒直径小于20 nm(美国Alfa Aesar公司)；小鼠巨噬细胞株RAW264.7(中国科学院上海细胞库)；汉防己甲素(C38H42N2O6，纯度≥99.5%，美国Selleck公司)，小鼠肿瘤坏死因子α及基质金属蛋白酶9酶联免疫(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(武汉伊莱瑞特生物技术公司)；抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)染色试剂盒(美国Sigma公司)；内毒素检测鲎试剂盒(厦门市鲎试剂实验厂有限公司)；细胞增殖-毒性检测试剂盒(江苏凯基生物技术公司)；反转录-聚合酶链反应试剂盒(日本TaKaRa公司)；β-actin抗体、核转录因子κBp65(nuclear factor kappa-B p65，NF-κBp65)、IκBα、p-NF-κBp65、p-IκBα(美国Cell Signalling公司)；鬼笔环钛染色试剂(武汉塞维尔公司)，荧光显微镜(日本OLYMPUS公司)；扫描电子显微镜(日本Hitachi公司)。
1.4 实验方法

1.4.1 钛颗粒及药物的准备用扫描电镜观察钛颗粒，以确定用于实验钛颗粒的直径与大小，见图1。然后180 ℃将钛颗粒焙烤6 h，向钛颗粒中加入体积分数75%乙醇，水平摇床晃动12 h，离心后收集钛颗粒并加入PBS并进行高温高压再次灭菌。将高压灭菌后的钛颗粒用PBS重悬至质量浓度为300 g/L。采用厦门鲎试剂-显色基质鲎试剂盒进行内毒素检测，确保内毒素含量<0.1 EU/mL，方可用于细胞实验。用于实验的钛颗粒终质量浓度为 0.1 g/L。将汉防己甲素溶于DMSO中，-20 ℃保存备用。

1.4.2 细胞培养及分组将RAW264.7细胞接种于含有体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基，在体积分数5%CO2，37 ℃细胞培养箱培养。细胞共分为5组：①空白组：细胞单纯培养；②实验组：细胞+0.1 g/L钛颗粒悬液；③低浓度药物组：实验组成分+0.1 μmol/L汉防己甲素；④中浓度药物组：实验组成分+0.5 μmol/L汉防己甲素；⑤高浓度药物组：实验组成分+1.0 μmol/L汉防己甲素。实验所使用细胞均在10代以内。
1.4.3 CCK-8细胞增殖实验将RAW264.7细胞以5×103/孔接种于96孔板(每孔培养基100 μL) ，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱过夜，用不同浓度的汉防己甲素(0，0.1，0.3，0.5，0.7，1.0，3.0，7.0，10.0 μmol/L)对RAW264.7干预48 h后，加入10 μL CCK-8溶液，使用酶标仪读取450 nm波长处的吸光度值。细胞增殖率按照(A加药-A空白)/(A未加药- A空白)×100%公式进行计算。
1.4.4 TRAP染色检测成熟破骨细胞数量将RAW264.7细胞以1×104/孔接种于6孔板(每孔3 mL培养基)，待细胞贴壁后按上述实验方法分组处理，总共培养5 d，每天换液。培养完成后用25 mL柠檬酸盐溶液，65 mL丙酮和8 mL体积分数37%甲醛混合制备固定溶液并固定细胞。用试剂盒提供的TRAP染液，将6孔板置入37 ℃生物培养箱中避光孵育1 h，碱性液冲洗干净，晾干，光镜下观察并计数(至少有3个及以上细胞核的TRAP染色阳性细胞被认为是成熟破骨细胞)。
1.4.5 鬼笔环钛染色检测成熟破骨细胞的功能将RAW264.7细胞以1×104/孔接种于6孔板(每孔3mL培养基)，待细胞贴壁后按上述实验方法分组处理，总共培养5 d，每天换液。培养完成后，40 g/L多聚甲醛室温下固定，0.1% Triton X-100穿膜5 min，鬼笔环肽染色液溶于 0.2%BSA，37 ℃生物培养箱中避光孵育2 h。DAPI溶于PBS(1︰10 000)室温染色细胞核5 min，冲洗干净，封固，荧光显微镜下观察并计数。
1.4.6 ELISA检测Ti颗粒刺激下RAW264.7巨噬细胞肿瘤坏死因子α及基质金属蛋白酶9的表达小鼠RAW264.7巨噬细胞以5×103/孔接种于96孔板；每天换液，然后收集1-5 d的细胞培养上清；离心(800 r/min，5 min)用以去除Ti颗粒和细胞；应用ELISA试剂盒检测细胞培养上清液中肿瘤坏死因子α及基质金属蛋白酶9蛋白含量。
1.4.7 Western blot检测NF-κBp65、IκBα磷酸化蛋白的水平各组细胞培养5 d后，用细胞蛋白试剂盒提取各组细胞的蛋白，BCA蛋白定量试剂定量，配置12%分离胶溶液，50 μg/孔加入蛋白匀浆，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，NC膜(硝酸纤维素膜)转膜，5%BSA封闭1 h后，一抗按1︰1 500用TBST稀释4 ℃封闭过夜。二抗按1︰10 000用TBST稀释室温孵育2 h。加入显色液上机曝光。
1.4.8 RT-PCR检测活化T细胞核因子c1(nuclear factor of activated T-cells，NFATc1)、肿瘤坏死因子α及基质金属蛋白酶9的mRNA表达将RAW264.7细胞以1×105个细胞的密度接种在6孔板中，贴壁24 h。然后，加入含0.1 g/L的钛颗粒和不同浓度汉防己甲素的完全培养基。每隔1 d更换一次培养基。培养5 d后，按照TRIzol试剂说明书规范提取总RNA。引物序列由上海生工设计和合成。然后，用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，随后放入反转录仪中进行反转录反应。具体序列引物如下：NFATc1正向引物为5′-CCA ATG AGC CAG GGG ATT AG-3′，反向引物为5′-GCA GGA GAG GAA AGG TCG TG-3′；肿瘤坏死因子α正向引物为5′-CCC TCA CAC TCA GAT CAT CTT-3′，反向引物为5′-CTG CTA CGA CGT GGG CTA CAG-3′；基质金属蛋白酶9正向引物为5′-GCT GAA ACC AGA CCC CAG AC-3′，反向引物为5′-TGA CCT GAA CCA TAA CGC ACA-3′；β-actin正向引物为5′-AGG GTG TGA TGG TGG GAA TG-3′，反向引物为5′-GCT GGG GTG TTG AAG GTC TC-3′。以2-ΔΔCt表示细胞中目的mRNA的相对表达量。
1.5 主要观察指标 CCK-8法检测RAW264.7细胞的增殖活性；TRAP和鬼笔环钛染色法检测成熟破骨细胞的功能和数量；ELISA法检测细胞上清液中肿瘤坏死因子α和基质金属蛋白酶9的表达；RT-PCR检测NFATc1、肿瘤坏死因子α和基质金属蛋白酶9的mRNA表达；Western blot法检测NF-κBp65、IκBα两者磷酸化蛋白的水平。
1.6 统计学分析所有数据采用SPSS 23.0软件进行统计学分析，计量资料以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，两两比较采用LSD-q检验。所有实验均独立重复3次，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

磨损颗粒诱导的骨溶解机制比较复杂，但是可以大致概括为假体周围局部炎症的诱导发生、促炎症因子信号的释放、免疫细胞的招募及破骨细胞的成熟与活化。磨损颗粒诱导的炎性反应主要是由于其自身刺激了巨噬细胞、成纤维细胞、成骨细胞及T淋巴细胞等释放大量肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶9和NFATc1等细胞因子和炎症递质所引起的[6]。课题组之前的研究已经证实，通过使用钛颗粒刺激破骨细胞表面核因子κB受体活化因子(receptor activator of nuclear factorκB，RANK)的激活，可以在体外较好地模拟磨损微粒造成的关节腔内无菌性松动的过程[7]。磨损颗粒的产生是行人工关节置换术后的必然结果，来自假体植入物所造成的磨损颗粒会进一步刺激单核细胞的释放和吞噬活性[8]，由此引起的炎症反应被广泛认为是假体周围骨溶解及随后发生的无菌性松动的主要原因，即所谓的“颗粒病”，进而需要进行二次翻修手术，这也是导致植入物失败的主要原因之一。为了解决这一问题，生物假体材料领域已经取得了不错的进展，假体材料从金属到陶瓷的使用，还有各种改进材料耐磨性的新方法[9]，但是由于陶瓷假体价格昂贵，加上本身材料脆性大和抗冲击能力差，限制了其在临床上的应用。现在临床上广泛使用的双膦酸盐和雌激素类药物，虽然可以在一定程度上缓解人工关节置换术后的假体松动问题，但是会引发轻度发烧、咽喉和胃溃疡等不良反应，严重者会导致恶性肿瘤形成和下颌骨坏死，限制了此类药物的长期和全身使用。目前基因干预疗法也远远未达到理想效果，因此探索新的和更安全的替代治疗化合物具有重要的临床意义。
鉴于破骨细胞在体内骨破坏过程中起到的重要作用，能够抑制破骨细胞形成或骨吸收的药物，是理想的预防和改善磨损颗粒诱导骨溶解的药物[10]。目前关于破骨细胞的实验研究中，体外诱导RAW264.7细胞分化为破骨细胞的天数多为5 d，因为从第6天开始破骨细胞就开始发生凋亡[11]。自1873年破骨细胞被发现以来，其起源问题就是广受争议的话题之一。现已证明破骨细胞是一种终末细胞，与体内的成骨细胞同源，都是由巨噬细胞分化和自我融合形成的[12]。此次实验中所采用的小鼠RAW264.7细胞已普遍应用于破骨细胞相关的体外实验研究。相比原代骨髓单核细胞的提取，RAW264.7具有细胞个体差异小、体外易于扩增、无需分离纯化等优点，更有利于对破骨细胞相关研究的开展。
汉防己甲素在临床上多用于抗风湿和镇痛，对于多种肿瘤细胞也都具有较强的抑制活性；同时，作为钙离子阻滞剂，汉防己甲素可以通过阻断Ca2+向细胞内的流动，从而影响NF-κB活化和核转位，下调炎症相关的细胞因子和递质，从而抑制炎症反应[13]。GAO等[14]研究发现汉防己甲素诱导的破骨细胞成熟机制可能包括抑制NF-κB p65的磷酸化。LV等[15]通过对类风湿性关节炎患者的滑膜和MH7A细胞系研究发现，汉防己甲素可以降低基质金属蛋白酶2/9的活化与表达，降低F-actin环的形成。因为特征性F-actin环的形成是破骨细胞表达骨吸收功能的前提。综上所述，作者提出如下假设，汉防己甲素可以通过这些特点抑制钛颗粒诱导的破骨细胞活化。
在破骨细胞分化过程中，核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nu-clear factor-κB ligand，RANKL)与RANK结合可诱导3种导致破骨细胞成熟的功能信号通路的激活，包括NF-κB通路、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路和Akt通路[16]。破骨细胞的成熟和分化主要是由于各种骨吸收刺激因子作用于未成熟的成骨细胞与骨髓基质细胞，通过RANK/RANKL/OPG系统诱导RANKL的表达上调，进而与破骨细胞前体细胞膜上被激活的RANK结合。这些细胞因子是刺激成骨细胞表达RANKL、造成局部骨吸收的重要潜在调节者。TRAP高度表达于破骨细胞中，所以被认为是破骨细胞的特异性标志物，可反映破骨细胞的成熟程度与活性。在此次实验中，TRAP染色实验显示汉防己甲素干预的3组TRAP阳性细胞数目有显著减少；对照组中有大量的不规则、多核的TRAP阳染细胞，而加入汉防己甲素的各组中TRAP阳染的细胞明显减少且呈浓度依赖趋势，这说明汉防己甲素在体外能显著抑制由钛颗粒诱导的破骨细胞生成，随后的鬼笔环钛染色实验也证实了这一观点。在之前的研究中，作者利用小鼠气囊植骨骨溶解模型，验证了通过RANK/RANKL信号通路可以下调基质金属蛋白酶9和肿瘤坏死因子α的表达进而抑制钛颗粒诱导的炎性破骨细胞生成的假说[7]。此次的ELISA结果表明，汉防己甲素可以显著降低钛颗粒引起的小鼠RAW264.7巨噬细胞分泌的肿瘤坏死因子α和基质金属蛋白酶9这两个重要的破骨细胞成熟因子。肿瘤坏死因子α被认为通过上调成骨细胞中RANKL的产生和通过刺激破骨细胞中RANK的表达来刺激破骨细胞的形成[17]。而基质金属蛋白酶9则是多核巨细胞在对界面膜上的磨屑作出机体-颗粒反应过程中释放的，在界面膜上，它可能通过降解存在于骨小梁周围和表面的细胞外基质大分子来促进正位破碎性骨吸收[18]。
NFATc1是RANKL诱导的破骨细胞分化的主要调节剂，并且可以上调负责破骨细胞黏附、迁移、酸化、无机和有机骨基质降解的各种基因[19]。RANKL与RANK的结合导致TRAF6的募集，并导致下游分子如NF-κB和c-Jun的活化。NFATc2和NF-κB的协同作用激活了NFATc1，c-Jun信号与NFAT协同作用在RANKL调控的破骨细胞分化中起到重要作用。NFATc1 转录因子常以高度磷酸化形式存在于细胞质中，当它受到Ca2+刺激后，去磷酸化的NFATc1可以导致一系列破骨细胞特异性基因如基质金属蛋白酶9、TRAP、组织蛋白酶 K等的表达。此次实验的RT-PCR结果显示，汉防己甲素能以浓度依赖性方式降低 NFATc1、肿瘤坏死因子α和基质金属蛋白酶9 mRNA的表达，表明汉防己甲素可以影响 NFATc1 及其下游因子的表达。IκBα作为IκB家族中最重要的成员之一，调控的是NF-κB这一关于机体免疫与炎症的最经典的细胞通路，它可以与p65/p50二聚体结合，抑制其活性[20]。Western blot结果表明，通过影响IκBα和NF-κBp65的磷酸化，汉防己甲素抑制了钛颗粒诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞中NF-κB通路的活化。NF-κB激活的起始过程涉及IκBα的磷酸化和降解，这促进了NF-κB蛋白质(如p65)核易位的发生及其与DNA靶点的结合，随之触发与破骨细胞生成相关的基因的表达。由于NF-κB在破骨细胞生成中起着至关重要的作用，因此靶向NF-κB可能降低假体周围的骨溶解，从而提高关节置换的寿命[21]。多项研究显示，抑制破骨细胞分化可以有效抑制骨溶解[22-24]。由于该实验尚欠缺动物实验结果的支持以及汉防己甲素抑制破骨细胞的分化的具体时间阶段，故实验结论还有待于进一步的验证。
综上所述，汉防己甲素对体外磨损颗粒诱导的破骨细胞生成和破骨细胞功能有积极的抑制作用，并且其作用机制主要是通过抑制NF-κB信号通路所介导的，这说明汉防己甲素可能成为治疗假体磨损颗粒引起的骨溶解的一种潜在药物。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

汉防己甲素干预假体周围磨损颗粒诱导下骨溶解模型的体外实验

In vitro experiment of tetrandrine on the model of osteolysis induced by wear particles around the prosthesis

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 6

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	陈俊名, 岳辰, 何沛霖, 张俊涛, 孙墨渊, 刘又文. 髋关节置换与股骨近端防旋髓内钉内固定修复高龄股骨转子间骨折效果的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1452-1457.
[2]	王秋霏, 顾叶, 彭育沁, 薛峰, 巨荣, 朱锋, 王熠军, 耿德春, 徐耀增. 人工假体磨损颗粒作用下Wnt/β-catenin信号通路对成骨细胞的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(24): 3894-3901.
[3]	蒋昇源, 李丹, 姜建浩, 杨上游, 杨淑野. 假体无菌性松动过程中Co2+对成骨前体细胞的生物学反应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(21): 3292-3299.
[4]	周祺, 高益, 魏康, 黎俊, 徐建达, 蒋阳, 瞿玉兴. 全膝关节置换治疗类风湿关节炎：关节功能及相关生化指标的变化[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(9): 1337-1341.
[5]	曹厚然, 邓鹏, 叶鹏程, 揭珂, 曾建春, 冯文俊, 陈锦伦, 齐新宇, 李杰, 谭雪秋, 张海涛, 曾意荣. 血小板计数可作为预测关节假体周围感染的新指标[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(30): 4795-4801.
[6]	黎鸿章, 杨坤, 刘玉文, 刘攀, 邱波, 邹杰. miR-155干预烧伤急性肺损伤模型大鼠：核转录因子κB通路的变化[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(2): 204-208.
[7]	福嘉欣，肖联平，王树森，李晓东，韩立强，王铜浩. 经肌间隙入路结合伤椎置钉短节段内固定与传统AF钉棒系统治疗胸腰段骨折的效果比较[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(8): 1177-1181.
[8]	李朋，杨淑野，张锴，贾龙，杜刚强，刘栋，张新军，张德刚，王志刚. 不同磨损颗粒对体外培养人外周血单核细胞的影响[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(6): 894-900.
[9]	东海潮，徐欣，李培楠，陈长健，郑连杰. 微型钢板、Herbert螺钉及可吸收棒内固定修复MasonⅡ型桡骨头骨折[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(4): 518-524.
[10]	辛超飞，许建中，赵世新，田进翔，常英健，史简铭. 全膝关节置换后需要异体输血的相关因素分析[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(28): 4461-4467.
[11]	刘文华，梁锦峰，邓少杰. 白藜芦醇调节氧化应激减少磨损颗粒诱导巨噬细胞肿瘤坏死因子α的表达[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(26): 4115-4120.
[12]	巩栋，甄平，王荣. 巨噬细胞极化在假体周围骨溶解中的作用：研究现状和进展[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(7): 1120-1125.
[13]	管明强，朱志霞，周观明. 骨水泥型与非骨水泥型半髋置换治疗老年股骨颈骨折[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(7): 991-996.
[14]	高益，瞿玉兴，周祺，王斌，郑冲，罗立立. 直接前侧入路与后外侧常规入路微创全髋关节置换的稳定性比较[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(7): 997-1002.
[15]	张涵，胡正霞，兰海. 微创全髋关节围置换期应用重组人促红细胞生成素联合氨甲环酸[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(7): 1003-1008.