程序性死亡分子5在退变腰椎间盘中的表达

中国组织工程研究 ›› 2010, Vol. 14 ›› Issue (50): 9311-9316.

程序性死亡分子5在退变腰椎间盘中的表达

崔冠宇¹，田伟¹，赵丹慧²，刘波¹，黎广平²，陈英玉³

¹北京积水潭医院脊柱外科，北京市 100035；²北京市创伤骨科研究所，北京市 100035；³北京大学人类基因中心，北京市 100191

出版日期:2010-12-10 发布日期:2010-12-10
通讯作者: 田伟，教授，主任医师，博士生导师，北京积水潭医院脊柱外科，北京市100035 tianweijst@vip.163.com
作者简介:崔冠宇★，男，1980年生，广东省茂名市人，汉族，2006年北京市创伤骨科研究所毕业，硕士，医师，主要从事脊柱外科的研究。 gycui98@yahoo.com.cn
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(30571752)：“椎间盘突出及退变分子免疫机制和Fas-Fas配体的研究”；国家自然科学基金面上项目(30470844)：“PDCD5在非凋亡程序性细胞死亡(Paraptosis)中的作用及其分子调控机制”。

Expression of programmed cell death 5 in degenerated lumbar intervertebral disc

Cui Guan-yu¹, Tian Wei¹, Zhao Dan-hui², Liu Bo¹, Li Guang-ping², Chen Ying-yu³

¹Department of Spinal Surgery, Beijing Jishuitan Hospital, Beijing 100035, China; ² Beijing Research Institute of Traumatology and Orthopaedics, Beijing 100035, China; ³ Center for Human Disease Genomics, Health Science Center, Peking University, Beijing 100191, China

Online:2010-12-10 Published:2010-12-10
Contact: Tian Wei, Professor, Chief physician, Doctoral supervisor, Department of Spinal Surgery, Beijing Jishuitan Hospital, Beijing 100035, China
About author:Cui Guan-yu★, Master, Physician, Department of Spinal Surgery, Beijing Jishuitan Hospital, Beijing 100035, China gycui98@yahoo.com.cn
Supported by:
the General Program of the National Natural Science Foundation of China, No. 30571752*, 30470844*

摘要/Abstract

摘要：

背景：细胞凋亡在腰椎间盘退变中起重要作用。程序性死亡分子5是一个促细胞凋亡的蛋白，在骨关节炎的软骨细胞中表达增高，但是至今未见在退变椎间盘中表达的报道。

目的：观察程序性死亡分子5在正常、突出和脱出腰椎间盘髓核细胞中的表达规律，分析其在腰椎间盘退变中的作用

方法：用SP免疫组织化学方法、免疫荧光方法检测程序性死亡分子5在2例正常、23例突出和17例脱出腰椎间盘髓核细胞中的表达，用脱氧核苷酸转移酶末端标记法和透射电镜检测髓核细胞凋亡情况；用天狼星红染色观察髓核组织细胞外基质Ⅰ，Ⅱ型胶原纤维的变化。

结果与结论：脱出组髓核细胞表达程序性死亡分子5的阳性率高于突出组(P < 0.05)，脱出组髓核细胞脱氧核苷酸转移酶末端标记阳性率高于突出组(P < 0.05)。荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察结果显示程序性死亡分子5表达定位于退变椎间盘的髓核细胞的细胞核；用透射电镜检测到凋亡的髓核细胞；天狼星红染色结果显示，随着年龄增长，髓核中Ⅱ型胶原纤维减少，Ⅰ型胶原纤维增多。结果提示退变椎间盘髓核细胞表达程序性死亡分子5上调，细胞凋亡增加，程序性死亡分子5介导的细胞凋亡在椎间盘退变中起到重要作用。

关键词: 程序性死亡分子5, 椎间盘, 退变, 细胞凋亡, 胶原纤维

Abstract:

BACKGROUND: Cell apoptosis plays an important role in intervertebral disc degeneration. Programmed cell death 5 (PDCD5) is a protein which promotes cell apoptosis and upgrade expressed in osteoarthritic cartilage. But the study of expression of PDCD5 on degenerated lumbar intervertebral disc has not been reported until now.
OBJECTIVE: To investigate the expression of PDCD5 in nucleus pulposus cells from normal, protruded and extruded lumbar intervertebral disc and to analyze the relationship between PDCD5 and lumbar intervertebral disc degeneration.
METHODS: Samples from 2 normal, 23 protruded and 17 extruded lumbar intervertebral discs were collected. The expression of PDCD5 was detected with immunohistochemical staining and immunofluorescence detection. Nucleus pulposus cell apoptosis was identified by TUNEL and transmission electronic microscope. The extracellular matrix degeneration was detected with sirius red staining.
RESULTS AND CONCLUSION: PDCD5 positive rate of nucleus pulposus cells from extruded intervertebral disc was higher than that from protruded intervertebral disc (P < 0.05). TUNEL detection positive rate of nucleus pulposus cells from extruded intervertebral disc was higher than that from protruded intervertebral disc (P < 0.05). PDCD5 was observed to be located in cell nucleus with confocal laser scanning microscopy. Cell apoptosis can be observed with transmission electronic microscope. With age increased, type Ⅰ collagen increased and typeⅡcollagen decreased in nucleus pulposus. In degenerated intervertebral disc, the expression of PDCD5 and nucleus pulposus cells apoptosis increased with age increased and disc degeneration scale increased. Nucleus pulposus cells apoptosis through PDCD5 pathway plays an important role in lumbar intervertebral disc degeneration.

中图分类号:

R318

崔冠宇，田伟，赵丹慧，刘波，黎广平，陈英玉. 程序性死亡分子5在退变腰椎间盘中的表达[J]. 中国组织工程研究, 2010, 14(50): 9311-9316.

Cui Guan-yu, Tian Wei, Zhao Dan-hui, Liu Bo, Li Guang-ping, Chen Ying-yu. Expression of programmed cell death 5 in degenerated lumbar intervertebral disc[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2010, 14(50): 9311-9316.

参考文献

引言

材料方法

讨论

细胞是腰椎间盘维持组织正常代谢的重要成分，有合成和修复细胞外基质等重要功能。退变腰椎间盘中细胞凋亡增加，活细胞数目比正常椎间盘少^[1] 。近年来针对退变椎间盘细胞凋亡机制进行了不少相关的研究^[2-3，7-8] 。

PDCD5是新发现的凋亡相关蛋白^[9] ，在细胞凋亡早期开始发挥作用，参与去除血清、VP-16作用以及Fas单克隆抗体诱导的细胞凋亡^[10] 。PDCD5能够促进细胞凋亡以及促进TAJ/TROY诱导的非凋亡细胞程序性死亡^[11] 。PDCD5在细胞凋亡时表达上调，并迅速移位从细胞浆进入细胞核^[4，12] 。PDCD5 可以通过和Tip60作用而增强其乙酰转移酶活性，损伤细胞DNA而诱导细胞凋亡^[13] 。PDCD5可促进成纤维样滑膜细胞以及多种肿瘤细胞凋亡^[14-17] 。

实验结果显示椎间盘髓核细胞表达PDCD5，脱出组PDCD5阳性率(64.5%)高于突出组(43.5%)，退变椎间盘髓核细胞表达PDCD5高于正常椎间盘；并且和年龄相关，和椎间盘的退变程度相关。Hoechst33258标记的是细胞核，激光共聚焦显微镜发现退变椎间盘髓核细胞中PDCD5与Hoechst33258的定位一致，表明PDCD5聚集于细胞核。PDCD5从细胞浆转移至细胞核是细胞凋亡的早期信号^[4] ，实验结果显示PDCD5参与髓核细胞凋亡过程。

TUNEL法通过DNA聚合酶和末端脱氧核糖核酸转移酶来标记DNA链断端的核酸，再显色来检测凋亡细胞。Gruber等^[1]最早用TUNEL方法检测退变椎间盘手术标本以及正常椎间盘标本中的凋亡细胞，发现对照标本中细胞的凋亡率为68%-78%，手术标本中细胞的凋亡率为48%-59%。实验发现椎间盘退变的髓核细胞凋亡率为14%-51%，正常椎间盘的髓核细胞凋亡率为7%和9%，可能是因为正常椎间盘取自年轻的个体，而Gruber等^[1]的对照组标本取自老年个体。统计发现椎间盘髓核细胞凋亡与年龄相关，与MRI的T2相显示的椎间盘退变程度相关；脱出髓核的细胞凋亡率高于突出髓核的细胞凋亡率。退变的椎间盘营养供应减少，细胞外基质发生变化，这些都可能是诱发髓核细胞凋亡的因素。椎间盘脱出椎管后细胞生存的环境进一步变化，细胞营养进一步减少，受各种炎症因素的刺激，进一步促进了其凋亡。椎间盘突出后细胞凋亡可能是部分椎间盘突出后体积逐渐缩小，患者症状逐渐减轻的原因。髓核中细胞在体积上只占1%左右，其余为细胞外基质。细胞外基质中Ⅱ型胶原结合水分子多，Ⅰ型胶原纤维结合水分子少，MRI的T2相主要反映的是细胞外基质的成分和排列特点。细胞外基质构成细胞生存的微环境，其维持的机械微环境对细胞的存活有重要作用^[18-19]，因此细胞凋亡和退变程度相关实质反映了椎间盘细胞外基质对细胞的影响。Roberts等^[20]指出细胞凋亡是细胞对环境化学、机械以及损伤刺激的一种反应机制，对渗透压以及压力等周围环境很敏感。本实验的标本取材过程中注意避免对组织的机械损伤，取材后迅速固定标本，防止取材过程造成细胞凋亡对实验结果的影响。

椎间盘中Ⅰ，Ⅱ型胶原各约占椎间盘总质量的40%，纤维环中以Ⅰ型胶原为主，髓核中以Ⅱ型胶原为主。天狼星红是一种与胶原分子中的碱性基因起反应的阴离子强酸性染料，是一种长型展开的分子，可与胶原分子特异性吸附[21]。在偏光显微镜下Ⅰ型胶原纤维呈黄色或红色，排列紧密，显示强双折光性；Ⅱ型胶原纤维呈蓝绿色或灰蓝色，为疏松网状分布，显示弱双折光性。本实验通过天狼星红染色定性分析了髓核细胞外基质Ⅰ型胶原纤维、Ⅱ型胶原纤维的变化。随着年龄增长，髓核中Ⅱ型胶原纤维减少、Ⅰ型胶原纤维增加，是髓核的细胞外基质发生退变的根本原因。同时髓核的细胞外基质发生退变后细胞生存的微环境发生改变，导致细胞的凋亡。

通过电镜观察到正常髓核中细胞功能活跃，胞浆中有丰富的粗面内质网，还可看到细胞以胞吐的方式向外分泌基质。而退变的髓核中细胞粗面内质网减少，功能减退。Walsh等^[22]通过对小鼠尾椎间盘加压，发现细胞凋亡增加，蛋白多糖的合成量减少，蛋白聚糖、Ⅱ型胶原纤维的mRNA的表达降低。髓核细胞长期处于高压力作用，一方面细胞凋亡细胞数量减少导致蛋白多糖、Ⅱ型胶原的合成减少，另一方面细胞在凋亡之前长期处于合成功能不活跃的状态，也导致蛋白多糖、Ⅱ型胶原的合成减少。

由于细胞凋亡在椎间盘退变中起重要作用，人们就希望通过抑制细胞凋亡以及利用干细胞和组织工程的方法来延缓椎间盘退变^[23-27] 。Gruber等^[23]发现撤除椎间盘细胞培养基中的血清诱导的细胞凋亡能够被胰岛素生长因子1以及血小板衍生生长因子所缓解。Wang等^[24]分离小鼠颈椎间盘软骨终板细胞进行培养，向培养基中加入Fas单克隆抗体时，Bax表达增加，Bcl-2表达下降，TUNEL阳性的凋亡细胞增加；再向培养基中加入胰岛素生长因子1可以阻断Fas单克隆抗体引起的这种改变。Park等^[25]通过Caspase抑制剂来抑制椎间盘细胞凋亡。以前的研究发现通过电穿孔将PDCD5单克隆抗体导入Hela细胞可抑制由依托泊甙诱导的细胞凋亡^[28] 。利用PDCD5为靶点抑制椎间盘细胞凋亡还需进一步深入研究。

综上所述，退变椎间盘的髓核细胞表达PDCD5上调，PDCD5转移至细胞核内，细胞凋亡增加，表明PDCD5介导的细胞凋亡在椎间盘退变中起到重要作用。进一步研究以PDCD5为靶点抑制髓核细胞凋亡，可为椎间盘退变的生物治疗提供新的方法。

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