昆明小鼠胚胎干细胞最佳分离方法及培养液选择

doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.49.025

中国组织工程研究

昆明小鼠胚胎干细胞最佳分离方法及培养液选择

田海清，蔡霞，腊晓琳，胡泊

新疆医科大学生殖医学中心，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054

出版日期:2010-12-03 发布日期:2010-12-03
通讯作者: 腊晓琳，博士，副主任医师，新疆医科大学生殖医学中心，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
作者简介:田海清，女，1976年生，山东省潍坊市人，汉族，2000年新疆医科大学毕业，主要从事妇产科专业研究。 tianhaiqing1118@163.com
基金资助:
新疆医科大学第一附属医院科研专项基金(GXB-001)，课题名称：不同来源胚胎干细胞分离培养及鉴定。

Optimized isolation method and medium choice of embryonic stem cells from Kunming mice

Tian Hai-qing, Cai Xia, La Xiao-lin, Hu Bo

Reproduction Medical Center, Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Online:2010-12-03 Published:2010-12-03
Contact: La Xiao-lin, Doctor, Associate chief physician, Reproduction Medical Center, Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Tian Hai-qing, Reproduction Medical Center, Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China tianhaiqing1118@163.com
Supported by:
the Scientific Research Foundation of First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, No. GXB-001

摘要/Abstract

摘要：

背景：到目前为止已经建立数百个小鼠胚胎干细胞系，昆明小鼠是中国应用最多的实验小鼠，其建系成功报道极少。
目的：建立一简单有效的昆明小鼠胚胎干细胞分离培养体系，以提高昆明鼠胚胎干细胞建系成功率。
方法：用添加血清替代物或胎牛血清培养液的小鼠胚胎成纤维细胞制备饲养层。昆明小鼠经孕马血清促性腺激素和人绒毛膜促性腺激素促排卵，交配后3.5 d冲洗子宫取胚胎，将胚胎接种在饲养层中培养，观察胚胎贴壁、内细胞团集落形成率。4~ 6 d后在0.05%trypsin-0.02%EDTA消化液中用切割法处理增殖的内细胞团块，再接种到新的饲养层上。倒置显微镜下观察形成的胚胎干细胞样集落形态。
结果与结论：妊娠3.5 d孕鼠适合胚胎干细胞的分离培养；在0.05%trypsin-0.02%EDTA消化液中采用切割法进行内细胞团集落的分离，集落增殖快、分化低；在含胎牛血清培养液中进行干细胞培养较血清替代物培养液中传代次数多，此培养液更适宜进行分离培养昆明鼠胚胎干细胞。

关键词: 昆明小鼠, 胚胎干细胞, 分离培养, 胎牛血清, 血清替代物

Abstract:

BACKGROUND: Up to date, hundreds of mouse embryonic stem cell (ESC) line has been established. Mouse of Kunming line is commonly used in experiment, and rare reports have addressed the success establishment.
OBJECTIVE: To establish simple, efficient protocol for the derivation of ESCs from Kunming mice, and to elevate the success rate of establishment.
METHODS: Mouse ESCs were incubated with the media containing serum surrogate or fetal bovine serum. Females of Kunming mice were superovulated with an injection of priganant mare’s serum gonadotropin and human chorionic gonadotropin. Blastocysts were collected by flushing the uterus at 3.5 days after copulation. Embryos were transferred in dish with fresh mouse embryonic fibroblasts feeder layer. Blastocysts detachment and colony forming efficiency of inner cell mass were observed. 4-6 days after culture, inner cell masses were digested mechanically in 0.05% trypsin-0.02%ethylenediamine tetraacetic acid.The disaggregated inner cell masses were transferred into a new feeder layer. Typical ESCs morphology was observed through an inverted microscope.
RESULTS AND CONCLUSION: Pregnant mice of 3.5 days were the best choice to derive ESCs. Inner cell masses were separated through cutting in drops of 0.05% trypsin-0.02% ethylenediamine tetraacetic acid. The disaggregated inner cell masses grew more rapidly and maintained less differentiation. The ESCs were passaged many times in fetal bovine serum medium. This medium is more suitable to separate ESCs from Kunming mouse.

中图分类号:

R394.2

田海清，蔡霞，腊晓琳，胡泊. 昆明小鼠胚胎干细胞最佳分离方法及培养液选择[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.1673-8225.2010.49.025.

Tian Hai-qing, Cai Xia, La Xiao-lin, Hu Bo. Optimized isolation method and medium choice of embryonic stem cells from Kunming mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.1673-8225.2010.49.025.

参考文献

引言

材料方法

讨论

国际上通用的ESC系有129，C57BL/6J，BALB/C等品系，不同小鼠品系来源的ESC有不同的特性，为了各种不同的研究和应用目的，最好能有不同品系来源的ESC系。优良的ESC系是ESC相关研究的基础，从国外购买的ESC系，会因培养条件的改变以及传代次数的增加，失去其作为重要研究材料的意义。昆明系小鼠是中国生物实验中应用最多的实验动物，材料来源广泛，适应力强、抗病力强，不需要高质量的饲养环境。国内关于昆明小鼠ESC建系的报道，均认为建系率低，成功建系的报道很少。近年来仅谢安等^[9]报道成功从昆明小鼠中分离并建立一株胚胎干细胞系。品系对小鼠ESC的分离有显著影响，适用于其他品系小鼠ESC系建立的方法和培养条件，可能并不适宜昆明系小鼠。因此不断建立新的、可供使用的ESC系是十分有必要的。
实验中采用超排卵的方法获得胚泡，这样可以利用较少的实验动物获得较多的胚泡，节省动物使用量，而且母鼠受精时间易于控制，并不影响ESC的克隆率。在实验中发现，胚胎发育不同步，3.5 d冲洗子宫获取的胚胎，可以出现桑葚胚、囊胚、个别2~8细胞期胚等不同发育阶段的胚胎，实验结果提示3.5 d龄的胚胎约49%为桑葚胚；4 d冲洗子宫获取的胚胎几乎全部为囊胚，与李为东等^[10]结论相同，但妊娠4 d孕鼠囊胚部分已经着床不能冲出，能收集的囊胚数量较少。妊娠3.5 d孕鼠较4 d获得胚泡数明显多。一般而言，获取的桑葚胚，在体外培养中也要经历囊胚、扩张囊胚和孵化胚^[11] 。研究提示体外培养2~8细胞期胚几乎不贴壁，无内细胞团增殖；囊胚的贴壁率、内细胞团增殖率要显著好于桑葚胚 (P < 0.05)，结果同张海峰等^[12]的研究，原因可能是桑葚胚体外适应能力不如囊胚，培养后容易退化，或者是由于培养系统不完全适宜于桑葚胚发育^[13] 。3.5 d冲洗子宫能获得较多的桑葚胚和囊胚，为最适合时期，有助于提高ESC建系率。
分离胚胎干细胞的重要环节之一是培养胚胎^[14] 。实验发现，胚胎干细胞集落的及时传代和消化时间非常重要，胚泡接种后五六天即对内细胞团及时进行传代,以后每两三天传代一次，胚胎干细胞离散的时机非常重要，传代时间过早，细胞数较少，很难形成新的集落；传代时间太晚，细胞开始分化，也很难形成新的集落。
小鼠胚胎干细胞对消化液很敏感，常用的消化酶是胰蛋白酶，如果消化过度，对内细胞团以及ESC的损害较大，成为单个细胞难以形成新的集落；如果消化不足，往往不能吹打为小细胞团块，而大的细胞团块重新接种后又极易分化，最容易出现的情况是细胞团块或集落外围细胞消化过度，而内部细胞消化不足，严重影响了胚胎干细胞的扩增。实验采用0.05%胰酶-0.02%乙二胺四乙酸联合切割法，在低浓度酶溶液中，迅速用1 mL注射器针尖机械分离4~8个小块后，将分离的小团块吸置饲养层上培养，胚胎干细胞分离与克隆效果较好。即能将集落周围分化的单个或数个细胞消化掉，同时保证有较大的细胞团形成新的集落。实验分离的小鼠胚胎干细胞集落具有胚胎干细胞典型的“鸟巢”状的生长状态，通过对此细胞集落进行碱性磷酸酶染色、光镜观察证实符合小鼠胚胎干细胞的特征。此方法有利于内细胞团培养的分离传代。
由于小鼠的胚胎干细胞较易发生分化，昆明种属更是如此，成功分离和克隆胚胎干细胞的关键是一方面要促进其分裂增殖，一方面要最大限度抑制其分化。ESC对体外培养环境的要求相当严格，而培养液是ESC分离培养中重要的因素，其很小的变化都会影响ESC的增殖和分化。目前多数鼠ESC都是在添加胎牛血清的培养液基础上进行^[8-9] 。优质的血清可保证胚胎干细胞的充分增殖和抑制其分化，胎牛血清的成分复杂，也含有未知因素能使ESC分化不同，批号不同效果也不相同。KSR是一种商品化的人工合成试剂，提供ESC成分明确营养条件，已用于人和小鼠ESC 的分离培养^[15-18] 。KSR的使用是否能克服KM鼠ESC细胞建系中，遇到的易分化和不能稳定传代的困难。KSR 替代胎牛血清是否适合于昆明系小鼠ESCs 的分离培养，目前仅有个别报道。本实验结果表明，胎牛血清培养液较KSR培养液能提高未分化ESC的增殖，使从胚泡扩展来的总细胞数量高几倍。因为血清除了提供细胞生长的营养成分外，还能促进细胞DNA的合成，并含有细胞增殖所必需的生长因子。同时使细胞进行有效的贴壁。相比之下，KSR不包含全部生长和幸存因素，KSR不含有酶抑制剂，酶在KSR培养液中不能被移除或灭活。因此不能单纯用KSR培养液分离培养ESC，结果同Bryja等^[15]报道，与余树民等^[19]研究相反。本实验中单纯用添加血清替代物的胚胎干细胞培养液培养胚胎最多传3代，传代后在添加血清替代物的培养液中胚胎死亡率高。Cheng等^[20]报道添加血清替代物培养液渗透压低，细胞不能有效的贴壁。
ESC极易受外界因素的影响，对生长条件要求非常苛刻分离培养的过程较为复杂，影响环节较多，任何一方面的不适当都可以导致建系的失败。胚胎干细胞的获得、克隆及传代对实验条件及技术人员的操作水平要求较高。实验室用上述方法将一ICR小鼠ESC传至第14代，但昆明鼠多传至6代，因此有待寻找一稳定、高效的分离培养昆明鼠ESC体系的方法。

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