液氮冷冻法制作兔股骨头坏死模型：可行，理想与可信

doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.02.020

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前缺乏一种理想股骨头坏死动物模型，从而制约了对其进一步的研究。
目的：验证以液氮冷冻法制作兔股骨头坏死修复模型的可行行，为后续研究奠定基础。
方法：取成年新西兰大白兔20只，双侧进行实验，在不切断股骨头圆韧带、髋关节不脱位的基础上，以液氮棉签连续快速冷冻股骨头25次，约10 s/次。分别于术后第3，7天，2，4，6，8周拍双侧髋关节正位片X射线片、MRI，并进行股骨头标本的大体解剖学观察和组织学观察。
结果与结论：在造模3 d时的股骨头组织切片上，冷冻区和周围部的软骨细胞、骨细胞和骨髓组织呈现坏死。2周，可见坏死的骨小梁周围开始出现修复表现。4周，部分出现剥脱，6周，软骨剥脱更加明显，8周，呈骨性关节炎改变，关节软骨剥脱严重，有2例股骨头正常外形改变。证实非髋关节脱位情况下液氮冷冻股骨头，可以成功建立的兔股骨头坏死模型，简便易行成功率高，可作为其后续研究的理想模型。

关键词: 冷冻, 股骨头坏死, 动物模型, 实验造模, 组织构建, 骨组织工程

Abstract:

BACKGROUND: The deficiency of perfect animal femoral head necrosis model limited its further investigation.
OBJECTIVE: To verify the feasibility of establishing rabbit femoral head necrosis models using liquid nitrogen refrigeration method, and to provide a foundation for subsequent research.
METHODS: A total of 20 adult, New Zealand, white rabbits were selected in the study. The round ligament of femur was not cut off and femoral head was not dislocated, and the exposed femoral head were quick frozen using cotton bud carrying liquid nitrogen for successive 25 times, with 10 s per time. The specimens were examined by gross anatomy, X-ray film, MRI and histological observation at day 3, 7 and weeks 2, 4, 6, and 8 after operation.
RESULTS AND CONCLUSION: The histological section showed that chondrocyte, osteocyte, and myeloid tissues presented necrosis in freezing and periphery at 3 days after model preparation, and the repair process appeared at 2 weeks after operation. The articular surface of femoral heads appeared collapse at 4 weeks after operation, and these changes became obvious at 6 weeks. The femoral head presented osteoarthritis-like disorder, with seriously collapsed articular surface at 8 weeks, and the contour of femoral head changed in 2 animals. The results demonstrated that without hip dislocation, rabbit femoral head necrosis models can be established successfully using liquid nitrogen refrigeration method. This method is simple, feasible, with high succeed rate, which can be used in subsequent research.

中图分类号:

R318

戴双武，丁帅，李章华，吴茂葵，奚江明，孟繁胜，熊文华. 液氮冷冻法制作兔股骨头坏死模型：可行，理想与可信[J]. 中国组织工程研究, 2010, 14(2): 276-279.

Dai Shuang-wu, Ding Shuai, Li Zhang-hua, Wu Mao-kui, Xi Jiang-ming, Meng Fan-sheng, Xiong Wen-hua. Establishment of rabbit femoral head necrosis models using liquid nitrogen refrigeration method: Is it feasible, ideal and confident?[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2010, 14(2): 276-279.

参考文献

引言

材料方法

讨论

3.1 研究现状 股骨头坏死病理过程复杂^[4] ，病因及发病机制尚未完全明了，治疗方法也多种多样^[5-6] ，治疗方法的选择存在很大争议，往往效果也不是很尽人意^[7]。建立理想的股骨头坏死动物模型是进行股骨头坏死治疗研究的基础。股骨头坏死分创伤性和非创伤性两种类型^[8] ，同样，建立股骨头坏死动物模型的方法也可以分为创伤性模型和非创伤性模型两种。近30年来，国内外学者对股骨头坏死动物模型的建立进行了许多研究^[9-14] 。遗憾的是，到目前为止仍无一种理想的模型适合于股骨头坏死的研究之用。其主要原因为难于模拟出成人股骨头坏死的自然病理过程和人股骨头坏死软骨下骨塌陷的临床特征^[15] 。
创伤性股骨头坏死模型主要是模拟临床上股骨颈骨折和髋关节脱位后股骨头坏死的形成过程，即人为造成动物的股骨头脱位，对股骨颈截骨或阻断股骨头血供而造成股骨头坏死。建立非创伤性股骨头缺血坏死动物模型的方法很多，应该根据实验的具体需要加以选择。主要包括了激素性模型、减压性模型、液氮模型、缺损模型、酸碱法、白酒灌胃以及其他如射线照射模型等。非创伤性模型有的未出现坏死，有的出现坏死但无修复反应，因而只适用于研究病因和发病机制，而不适用于研究治疗^[16] 。缺损模型适合于开窗刮除死骨和髓芯减压的治疗研究。激素和酒精性股骨头坏死多用于病因及病理机制研究。由于其坏死需要时间较长，有的不出现坏死，有的出现坏死但无修复反应，因而此类模型不适用于治疗研究。Takoaka等^[17]利用相同的液氮冷冻方法建立了犬股骨头坏死模型，但在这种方法髋关节脱位后容易出现饲养困难，并发腹泻，动物存活率低等问题，而且冻死面积过大，容易损伤坐骨神经，不利于后续研究。杨述华等^[16]曾经报道,采用液氮冷冻法建立家兔股骨头坏死模型,是将股骨头脱位，冷冻3 min，复温后再复位。该造模方法导致整个股骨头坏死，骨组织的修复现象出现较晚(术后1个月)，而且不活跃。
3.2 实验特点 本文在总结前人成功经验的基础上，参考Takaoka等^[17]的方法建立了液氮冷冻股骨头坏死，对模型加以改进采用了液氮棉签冷冻法，不造成动物兔股骨头脱位，所需时间短，坏死塌陷成功率高，动物死亡率低，可重复性大。实验中行X射线片检测、大体标本观察、组织学观察外，还做了全面的MRI扫描，MRI可以用来早期诊断股骨头坏死，这一点早己得到公认，许多研究表明MRI对于股骨头坏死的诊断最敏感、最特异^[18] 。而目前没有报道对股骨头坏死模型进行系列MRI记录。因此，实验对股骨头坏死各个时期的做了MRI扫描。2周后MRI表现为坏死区在T1WI上为中低信号，在T2WI上呈较高信号，周围环绕线样低信号。4周后MRI表现为坏死区低信号围绕的信号不均的坏死区。8周时关表现为股骨头脂肪高信号中出现不同形态的低信号区，呈环形、带状和灶状。
实验另一个特点是组织切片采用改良的Masson三色染色，Masson三色主要应用于胶原染色, 色彩鲜艳。骨组织中的胶原是Ⅰ型胶原,着鲜红色；软骨胶原是Ⅱ型胶原，染色着绿色；新生骨在成熟过程中着绿色至红绿相间^[19] 。因为Masson染色对骨组织胶原的染色反应和胶原成熟程度有关，因此可以用来评价骨质的成熟程度。同样也可以用此染色观察骨细胞和成骨细胞的活动状况，在这些细胞周围出现的绿色着染胶原系新生部分，明显不同于已成熟的外围部红色胶原，细胞周围绿染区域的大小，代表着这些细胞新近的活动程度。作者也用该种染色观察软骨退变，退变软骨从潮线升起很多红色火焰状突起。从切片可以看出术后2周骨小梁出现坏死，术后4周坏死骨小梁周围出现新生附加骨，术后6关节软骨下骨小梁变细、骨折、破坏，术后8周关节软骨面破坏，与X射线片、MRI影像学相符合。
本实验中在非髋关节脱位情况下用液氮冷冻股骨头，可以成功建立的兔股骨头坏死模型。本方法简便易行成功率高，可作为其后续研究的理想动物模型。

[1]	李中峰, 陈明海, 凡一诺, 魏秋实, 何伟, 陈镇秋. 右归饮治疗激素性股骨头坏死作用机制的网络药理学分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1256-1263.
[2]	刘立华, 孙伟, 王云亭, 高福强, 程立明, 李子荣, 王江宁. 头颈部开窗减压治疗L1型激素性股骨头坏死：单中心前瞻性临床研究[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(6): 906-911.
[3]	刘钊, 徐西林, 申意伟, 张晓峰, 吕航, 赵军, 王政春, 刘旭卓, 王海涛. 塌陷预测方法联合分期分型对股骨头坏死治疗的指导作用与前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(6): 929-934.
[4]	李时斌, 赖渝, 周毅, 廖建钊, 章晓云, 张璇. 激素性股骨头坏死发病机制及相关信号通路的靶点效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(6): 935-941.
[5]	郑小龙, 何晓铭, 龚水帝, 庞凤祥, 杨帆, 何伟, 刘少军, 魏秋实. 酒精性股骨头坏死患者的骨转换特点[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 657-661.
[6]	吴子健, 胡昭端, 谢有琼, 王峰, 李佳, 李柏村, 蔡国伟, 彭锐. 3D打印技术与骨组织工程研究文献计量及研究热点可视化分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 564-569.
[7]	李晓壮, 段浩, 王伟舟, 唐志宏, 王旸昊, 何飞. 骨组织工程材料治疗骨缺损疾病在体内实验中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 626-631.
[8]	曾祥洪, 梁博伟. 股骨头坏死保髋治疗的新策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(3): 431-437.
[9]	陈崧, 何远丽, 谢雯佳, 钟林娜, 王剑. 磷酸钙纳米颗粒药物递送系统在骨组织工程研究与应用中的优势[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3565-3570.
[10]	张振华, 刘姿辰, 禹宝庆. 聚己内酯及其复合材料在组织工程骨构建中的地位与问题[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3571-3577.
[11]	陈宇彤, 李晨晨, 刘阳, 郑亚琴, 杨喜花, 安美文. 急性放射性皮肤损伤Wistar大鼠模型的建立[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 237-241.
[12]	王岩, 董本超, 王颖, 孙磊, 卢斌, 柏豪豪, 田爱现, 马剑雄, 马信龙. 股骨头坏死动物模型的造模方法及特点[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 292-297.
[13]	马笃军, 彭力平, 陈锋, 蒋顺琬, 姜劲挺, 高坤, 林展鹏. 基因编辑技术在骨关节炎基因治疗中的作用与意义[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 298-303.
[14]	许辉, 康冰心, 钟声, 高晨鑫, 赵翅, 邱国伟, 孙松涛, 解骏, 肖涟波, 施杞. 点按局部腧穴与坐位调膝法联用治疗膝关节骨关节炎：随机对照研究[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 216-221.
[15]	汪鎏, 宋东哲, 黄定明. 骨形态发生蛋白9调控干细胞分化与骨再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 3064-3070.