六味地黄丸调节肠道微生物组平衡抑制卵巢早衰小鼠的氧化应激

doi:10.12307/2025.366

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (11): 2285-2293.doi: 10.12307/2025.366

• 组织构建实验造模 experimental modeling in tissue construction • 上一篇下一篇

六味地黄丸调节肠道微生物组平衡抑制卵巢早衰小鼠的氧化应激

仲佳雯1，2，3，姜波1，2，3，张文燕1，2，3，李晓荣3，4，秦岭1，2，3，高婷1，2，3

宁夏医科大学，1中医学院，2生育力保持重点实验室，3少数民族医药现代化教育部重点实验室，宁夏回族自治区银川市 750004；4宁夏医科大学总医院，宁夏回族自治区银川市 750000

收稿日期:2024-04-07 接受日期:2024-05-10 出版日期:2025-04-18 发布日期:2024-08-10
通讯作者: 李晓荣，博士，副主任医师，宁夏医科大学少数民族医药现代化教育部重点实验室，宁夏回族自治区银川市 750004；宁夏医科大学总医院，宁夏回族自治区银川市 750000
作者简介:仲佳雯，女，1998年生，宁夏医科大学中医内科学在读硕士，主要从事中医药治疗不孕不育的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(82260947)，项目负责人：李晓荣；宁夏自然科学基金(2023AAC05059)，项目负责人：李晓荣

Liuwei Dihuang Wan inhibits oxidative stress in premature ovarian failure mice by regulating intestinal microbiota #br#
#br#

Zhong Jiawen1, 2, 3, Jiang Bo1, 2, 3, Zhang Wenyan1, 2, 3, Li Xiaorong3, 4, Qin Ling1, 2, 3, Gao Ting1, 2, 3

1School of Traditional Chinese Medicine, 2Fertility Maintenance Key Laboratory, 3Key Laboratory of Ethnic Medicine Modernization of Ministry of Education, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; 4Ningxia Medical University General Hospital, Yinchuan 750000, Ningxia Hui Autonomous Region, China

Received:2024-04-07 Accepted:2024-05-10 Online:2025-04-18 Published:2024-08-10
Contact: Li Xiaorong, MD, Associate chief physician, Key Laboratory of Ethnic Medicine Modernization, Ministry of Education, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; Ningxia Medical University General Hospital, Yinchuan 750000, Ningxia Hui Autonomous Region, China
About author:Zhong Jiawen, Master candidate, School of Traditional Chinese Medicine, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; Fertility Maintenance Key Laboratory of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; Key Laboratory of Ethnic Medicine Modernization, Ministry of Education, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 82260947 (to LXR); the Natural Science Foundation of Ningxia, No. 2023AAC05059 (to LXR)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
肠道微生物组：又称为肠道菌群或肠道微生物群落，是指生活在人体肠道内的大量微生物的总称。这些微生物与宿主之间存在着复杂而密切的相互作用，共同维持着肠道的微生态平衡。
卵巢早衰(Premature Ovarian Failure，POF)：是指女性在40岁之前出现卵巢功能减退或丧失，导致月经不规律、停经、生育能力下降或丧失等症状。

背景：研究表明，卵巢早衰患者肠道菌群结构发生变化，肠道菌群失调可能是卵巢早衰发生的重要机制之一。
目的：探讨六味地黄丸对环磷酰胺诱导卵巢早衰小鼠氧化应激和肠道微生物群的影响。
方法：45只雌性ICR小鼠随机分为3组：空白组(正常小鼠)、模型组(卵巢早衰小鼠)、六味地黄丸组，后2组小鼠一次性腹腔注射环磷酰胺(120 mg/kg)制备卵巢早衰小鼠模型，造模成功后六味地黄丸组小鼠连续灌胃六味地黄丸(1.56 g/kg)28 d，其余2组灌胃等量生理盐水28 d，灌胃结束后取材。每周记录小鼠体质量，计算卵巢指数，苏木精-伊红染色观察小鼠卵泡的发育情况，ELISA法检测血清抗苗勒管激素、雌二醇、促卵泡激素、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和丙二醛水平，并通过16S rDNA测序检测所有小鼠的肠道微生物组。
结果与结论：①模型组小鼠的毛发疏松，活力及抓力下降，体质量几乎无增长，卵巢指数下降；六味地黄丸治疗后小鼠的体质量高于模型组，卵巢指数也随之升高(P < 0.05)。②模型组小鼠动情周期紊乱；六味地黄丸能恢复卵巢早衰小鼠的发情周期，减少闭锁卵泡数量。③模型组小鼠血清中促卵泡激素、丙二醛水平显著升高(P < 0.01)，血清雌二醇、抗苗勒管激素、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶水平显著下降 (P < 0.01)；六味地黄丸组小鼠血清促卵泡激素、丙二醛水平显著降低(P < 0.01)，雌二醇、抗苗勒管激素、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶水平升高。④根据16S rDNA测序结果，六味地黄丸可调控肠道微生物群的丰度和多样性，可增加有益菌的相对丰度，KEGG通路分析显示，肠道微生物群与代谢途径、次生代谢产物的生物合成、不同环境中的微生物代谢、氨基酸的生物合成等通路受六味地黄丸的调控。⑤结论：肠道微生物组的改变可能是六味地黄丸治疗卵巢早衰的潜在机制之一。六味地黄丸能调节肠道微生物组结构，增加有益菌数量，减少有害菌数量，从而改善肠道微生态平衡。这种调节作用有助于降低氧化应激水平，进一步抑制卵巢早衰小鼠卵巢氧化应激。
https://orcid.org/0009-0007-4428-3291(仲佳雯)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: ">六味地黄丸, 卵巢早衰, 肠道微生物组, 氧化应激

Abstract: BACKGROUND: Studies have shown that patients with premature ovarian failure have changes in the structure of intestinal flora and that imbalance of intestinal microbiota may be one of the important mechanisms in the development of premature ovarian failure.
OBJECTIVE: To investigate the effect of Liuwei Dihuang Wan on oxidative stress and intestinal microbiota in premature ovarian failure mice induced by cyclophosphamide.
METHODS: Forty-five female ICR mice were randomized into three groups: blank group (normal mice), model group (premature ovarian failure mice), and Liuwei Dihuang Wan group. A mouse model of premature ovarian failure was prepared by one-time intraperitoneal injection of cyclophosphamide (120 mg/kg)
in the latter two groups. After successful modeling, the Liuwei Dihuang Wan group was intragastrically administered for 28 continuous days, and the other two groups were intragastrically administered with the same amount of normal saline for 28 days. Mouse body mass was recorded weekly and ovarian index was calculated. The development of mouse follicles was observed using hematoxylin-eosin staining. ELISA method was used to detect serum levels of anti-Mullerian hormone, estradiol, follicle stimulating hormone, superoxide dismutase, glutathione peroxidase, and malondialdehyde. Meanwhile, the gut microbiome of all mice was detected through 16S rDNA sequencing.
RESULTS AND CONCLUSION: The mice in the model group had loose hair, decreased vigor and grip strength, almost no increase in body mass, and decreased ovarian index. Whereas, the mouse body mass and ovarian index were increased after treatment with Liuwei Dihuang Wan (P < 0.05). The estrous cycle of mice in the model group was disorganized; Liuwei Dihuang Wan could restore the estrous cycle and reduce the number of atretic follicles in mice with premature ovarian failure. The serum levels of follicle stimulating hormone and malondialdehyde in the model group significantly increased (P < 0.01), while the levels of estradiol, anti-Mullerian hormone, superoxide dismutase, and glutathione peroxidase significantly decreased (P < 0.01). Liuwei Dihuang Wan could significantly decrease the serum levels of follicle stimulating hormone and malondialdehyde (P < 0.01), and increase the levels of estradiol, anti-Mullerian hormone, superoxide dismutase, and glutathione peroxidase. According to the 16S rDNA sequencing results, Liuwei Dihuang Wan could regulate the abundance and diversity of intestinal microbiota, and increase the relative abundance of beneficial bacteria. KEGG pathway analysis showed that the intestinal microbiota and metabolic pathways, biosynthesis of secondary metabolites, microbial metabolism in different environments, and biosynthesis of amino acids were regulated by Liuwei Dihuang Wan. To conclude, the changes in the structure of intestinal microbiome may be one of the potential mechanisms of Liuwei Dihuang Wan in treating premature ovarian failure. Liuwei Dihuang Wan can regulate the structure of intestinal microbiome, increase the number of beneficial bacteria, reduce the number of harmful bacteria, and thus improve the balance of intestinal microbiota. This regulatory effect helps to reduce oxidative stress levels and further inhibit ovarian oxidative stress in mice with premature ovarian failure.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: ">Liuwei Dihuang Wan, premature ovarian failure, intestinal microbiome, oxidative stress

中图分类号:

仲佳雯, 姜波, 张文燕, 李晓荣, 秦岭, 高婷. 六味地黄丸调节肠道微生物组平衡抑制卵巢早衰小鼠的氧化应激[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(11): 2285-2293.

Zhong Jiawen, Jiang Bo, Zhang Wenyan, Li Xiaorong, Qin Ling, Gao Ting . Liuwei Dihuang Wan inhibits oxidative stress in premature ovarian failure mice by regulating intestinal microbiota #br#

#br#

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(11): 2285-2293.

图/表（结果） 10

2.1 实验动物数量分析实验选用小鼠45只，实验过程中六味地黄丸组灌胃死亡1只，进入结果分析的有44只。
2.2 六味地黄丸对小鼠体质量及卵巢指数的影响在使用环磷酰胺造模后，与空白组小鼠相比，模型组小鼠的毛发疏松，活力及抓力下降，体质量几乎无增长(图1A)，卵巢指数下降(图1B)；随着给药时间的增加各组小鼠的体质量稳步增加，小鼠卵巢指数也随之升高(P < 0.05)，六味地黄丸组小鼠体质量高于模型组，见表1。

2.3 六味地黄丸对小鼠动情周期的影响采用阴道涂片法观察小鼠的动情周期，并将阴道脱落细胞进行染色(图2)，

环磷酰胺腹腔注射后连续10 d观察小鼠动情周期，发现小鼠动情周期紊乱，说明环磷酰胺诱导的卵巢早衰小鼠模型建立成功。用六味地黄丸治疗4周后，小鼠的动情周期逐渐恢复。空白组小鼠在整个实验过程中表现出正常的动情周期。正常的ICR雌性小鼠的发情周期为五六天，动情周期各阶段的形态学特征如下[8]：动情前期(P)：主要是大量有核上皮细胞；动情期(E)：主要是大的、扁平的、无核的角质化鳞状上皮细胞，边缘不规则，无白细胞；动情后期(M)：角质化的上皮细胞，具有有核上皮细胞和白细胞；动情间期(D)：以大量白细胞为主。
2.4 六味地黄丸对小鼠卵巢形态的影响苏木精-伊红染色结果显示空白组小鼠卵巢中各种卵泡的形态和数量是正常的，颗粒细胞排列整齐；模型组小鼠卵巢萎缩并出现不规则的卵泡形态，闭锁卵泡增加，黄体数量减少，卵巢颗粒细胞排列松散；在六味地黄丸治疗后出现更多完整的卵泡，闭锁卵泡减少，见图3。

2.5 六味地黄丸对小鼠激素水平影响与空白组相比，模型组小鼠血清中促卵泡激素水平显著升高(P < 0.01)，雌二醇和抗苗勒管激素水平显著下降 (P < 0.01)；与模型组相比，六味地黄丸组促卵泡激素水平显著下降(P < 0.01)，抗苗勒管激素显著升高(P < 0.01)，同时雌二醇也有一定程度的改善，见图4。

2.6 六味地黄丸抑制卵巢早衰小鼠卵巢氧化应激丙二醛是脂质过氧化的终产物之一，其含量与机体的氧化应激程度呈正相关[9]。超氧化物歧化酶是一种重要的抗氧化酶，能够清除体内的活性氧自由基，保护细胞免受氧化损伤[10]。谷胱甘肽过氧化物酶作为一种重要的生物标志物，对于评估生物体的氧化应激状态和抗氧化能力具有重要意义。通过ELISA检测这些氧化相关指标，发现与空白组相比，模型组小鼠血清中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性显著降低(P < 0.01)，丙二醛水平显著上调(P <
0.01)，六味地黄丸治疗后显著升高了超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶水平(P < 0.01)，并降低丙二醛水平(P < 0.01)，见图5。

2.7 六味地黄丸减轻卵巢早衰小鼠肠道微生物组失调
2.7.1 肠道微生物组的多样性六味地黄丸给药治疗4周结束后，收集各组小鼠的粪便样本进行 16S rRNA 测序分析。通过MiSeq测序平台获得双端序列数据。根据不同测序深度下各样品的Sobs指数构建稀疏曲线(图6A)和等级丰度曲线 (图6B)。随着测序深度的增加，稀释曲线和等级丰度曲线的生长方式相似，说明测序数据量和物种丰富度符合进一步分析的条件。α多样性指标Chao和Ace(图6C，D)显示模型组的α多样性显著降低(P < 0.05)，六味地黄丸治疗后Chao和Ace指数又显著上升(P < 0.05)；根据Shannon和Simpson指数(图6E，F)评估显示3组的物种多样性无差异，说明卵巢早衰显著降低了肠道微生物组的丰富度，而六味地黄丸治疗后又使卵巢早衰小鼠肠道微生物组的丰度显著提升，但3组肠道微生物组的多样性无显著差异。根据组间差异的ANOSIM和NMDS分析(图6G，H)测定了3组肠道微生物组的β多样性，结果表明3组之间存在显著差异。
2.7.2 肠道微生物组的物种变化为了分析各组肠道微生物的差异并研究六味地黄丸对肠道微生物组的影响，分析了不同水平的肠道微生物组组成。门水平分类分析表明，各类群的粪便菌群主要由厚壁菌门、拟杆菌门组成，约占比80%(图7A)；在属水平上，粪便菌群包括颤螺旋菌属、唾液乳杆菌属、乳酸杆菌、罗氏菌属等，这些属的相对丰度在各类群之间各不相同(图7B)。为了进一步确定以分类群形式呈现的生物标志物，使用LEfSe方法对每组进行统计分析，采用LDA分析法估计物种丰富度对差异效应。LDA的临界阈值设定为2.0。结果发现，空白组小鼠中富集了乳酸杆菌科、芽孢杆菌、乳酸杆菌目，卵巢早衰小鼠中富集了颤螺菌科、真细菌目、梭状芽胞杆菌，六味地黄丸组小鼠中也富集了Lachnoclostridium、链球菌、链球菌族(图7C)，这一观察结果表明，卵巢早衰小鼠肠道微生物组经六味地黄丸干预后发生了巨大变化。厚壁菌门/拟杆菌门(F/B)比值被认为是肠道微生物组稳态的重要指标[11]。空白组厚壁菌门/拟杆菌门值为15.02，模型组值为5.96，六味地黄丸组值为15.60，模型组相比于空白组厚壁菌门/拟杆菌门值显著下降，六味地黄丸干预后又有所上升，说明六味地黄丸有效地调节了卵巢早衰小鼠肠道微生物组的失调。
2.7.3 肠道微生物组的功能预测通过PICRUSt2功能预测分析3组小鼠肠道微生物组的基因功能和组成的潜在差异。首先从通路一级分类确定了主要功能，包括新陈代谢、遗传信息处理、环境信息处理、细胞过程、人类疾病、生物体系统(图8A)。KEGG的进一步功能分析涉及全局和概述图谱、碳水化合物代谢、氨基酸代谢、翻译、能量代谢、膜运输、辅因子和维生素代谢等，功能丰度前20见图8B。更详细的功能体现在代谢途径、次生代谢产物的生物合成、不同环境中的微生物代谢、氨基酸的生物合成、碳代谢、核糖体、ABC转运蛋白、双组分调节系统中(图8C)。这些通路的变化与卵巢早衰的发病机制密切相关。

参考文献

[1] 苏比努尔·买买提,尼比热·阿布都瓦依提,易金玲.自身免疫性卵巢早衰发病机制的研究进展[J].妇儿健康导刊,2023,2(9):18-20+37.
[2] 柳晓亮,刘一鸣,苏原,等.卵巢早衰中西医病因病机及治疗研究进展[J].长春中医药大学学报,2023,39(7):811-816.
[3] 杨婷,王晓红,李怡.褪黑素对早发性卵巢功能不全的临床疗效及机制研究[J].实用临床医药杂志,2023,27(16):75-78+83.
[4] MIKHAEL S, PUNJALA-PATEL A, GAVRILOVA-JORDAN L.Hypothalamic-pituitary-ovarian axis disorders impacting femalefertility. Biomedicines. 2019;7(1):5.
[5] PARIDA S, SHARMA D. The Microbiome-Estrogen Connection and Breast Cancer Risk. Cells. 2019;8(12):1642.
[6] 游婷. 粪菌移植对D-半乳糖诱导的衰老大鼠模型抗氧化功能及肠道菌群影响的研究[D].泸州:西南医科大学,2023.
[7] 李慧,王双杰,叶雪,等.卵巢早衰动物模型的建立[J].中国医药生物技术,2020,15(6):572-576.
[8] 丁玉龙,孙莉,李丽亚.小鼠阴道涂片三种染色方法比较[J].实验动物科学,2010,27(1):67-69.
[9] 张万松.骨髓间充质干细胞(BMSCs)来源的外泌体对睾丸缺血再灌注损伤的保护作用[D].广州:南方医科大学,2018.
[10] 关博.哈尔滨市鸡饲料中DON和ZEA的调查及其对鸡脾淋巴细胞毒性的影响[D].哈尔滨:东北农业大学,2013.
[11] 赵玉兰.急性敌敌畏暴露致肉鸡小脑自噬及盲肠菌群改变的相关性分析[D].南昌:江西农业大学,2021.
[12] JANKOWSKA K. Premature ovarian failure. Prz Menopauzalny. 2017;16(2): 51-56.
[13] Bai X, Wang S. Signaling pathway intervention in premature ovarian failure. Front Med (Lausanne). 2022;9:999440.
[14] Armeni E, Paschou SA, Goulis DG, et al. Hormone therapy regimens for managing the menopause and premature ovarian insufficiency. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab. 2021;35(6):101561.
[15] 张艳. 归逍方加减联合人工周期治疗肾虚肝郁证型卵巢早衰闭经49例观察[J].安徽医药,2022,26(1):192-196.
[16] MOINI JAZANI A, NASIMI DOOST AZGOMI H, NASIMI DOOST AZGOMI A, et al. A comprehensive review of clinical studies with herbal medicine on polycystic ovary syndrome (PCOS). Daru. 2019;27(2):863-877.
[17] 李红波,王小琴,熊飞,等.六味地黄丸对D-半乳糖致衰老大鼠抗氧化功能影响的实验研究[J].中国中医药科技,2019,26(1):31-33.
[18] 梁秋峰,曹云桂,陈奇.六味地黄丸治疗卵巢早衰的研究进展[J].医学综述,2019,25(17):3508-3512.
[19] MELEKOGLU R, CIFTCI O, ERASLAN S, et al. Beneficial effects of curcumin and capsaicin on cyclophosphamide-induced premature ovarian failure in a rat model. J Ovarian Res. 2018;11(1):33.
[20] PARIDA S, SHARMA D. The microbiome-estrogen connection and breast cancer risk. Cells.2019;8(12):1642.
[21] MIKHAEL S, PUNJALA-PATEL A, GAVRILOVA-JORDAN L. Hypothalamic-pituitary-ovarian axis disorders impacting female fertility. Biomedicines. 2019;7(1):5.
[22] HAMILTON KJ, HEWITT SC, ARAO Y, et al. Estrogen hormone biology. Curr Top Dev Biol. 2017;125:109-146.
[23] TILG H, ZMORA N, ADOLPH TE, et al. The intestinal microbiota fuelling metabolic inflammation. Nat Rev Immunol. 2020;20(1):40-54.
[24] LINDHEIM L, BASHIR M, MÜNZKER J, et al. Alterations in Gut Microbiome Composition and Barrier Function Are Associated with Reproductive and Metabolic Defects in Women with Polycystic Ovary Syndrome (PCOS): A Pilot Study. PLoS One. 2017;12(1):e0168390.
[25] QI X, YUN C, PANG Y, et al. The impact of the gut microbiota on the reproductive and metabolic endocrine system. Gut Microbes. 2021;13(1):1-21.
[26] JIANG L, FEI H, TONG J, et al. Hormone replacement therapy reverses gut microbiome and serum metabolome alterations in premature ovarian insufficiency. Front Endocrinol (Lausanne). 2021;12:794496.
[27] WU J, ZHUO Y, LIU Y, et al. Association between premature ovarian insufficiency and gut microbiota. BMC Pregnancy Childbirth. 2021;21(1):418.
[28] WEBBER L, DAVIES M, ANDERSON R, et al. ESHRE guideline: management of women with premature ovarian insufficiency. Hum Reprod. 2016;31: 926-937.
[29] AGARWAL A, SALEH RA, BEDAIWY MA. Role of reactive oxygen species in the pathophysiology of human reproduction. Fertil Steril. 2003;79:829-843.
[30] XIE T, YE W, LIU J, et al. The emerging key role of Klotho in the hypothalamus-pituitary-ovarian axis. Reprod Sci. 2021;28(2):322-331.
[31] 董若曦.淫羊藿苷抑制氧化应激改善大鼠化疗损伤性卵巢早衰的机制研究[D].上海:上海中医药大学,2019.
[32] 潘晓. 番茄红素通过肠-肝轴预防环磷酰胺致小鼠肠道损伤的机制研究[D].保定:河北大学,2023.
[33] Helsby NA, Yong M, van Kan M, et al. The importance of both CYP2C19 and CYP2B6 germline variations in cyclophosphamide pharmacokinetics and clinical outcomes. Br J Clin Pharmacol. 2019;85:1925-1934.
[34] 陈奕颖.植物乳杆菌Lp2改善脂多糖诱导小鼠炎症反应作用机制研究[D].长春:吉林农业大学,2021.
[35] Wang J, Xu J, Han Q, et al. Changes in the vaginal microbiota associated with primary ovarian failure. BMC Microbiol. 2020;20(1):230.
[36] Ojo BA, O’Hara C, Wu L, et al. Wheat germ supplementation increases lactobacillaceae and promotes an anti-inflammatory gut milieu in C57BL/6 mice fed a high-fat, high-sucrose diet.J Nutr. 2019;149(7):1107-1115.
[37] Gopikrishna T, Suresh Kumar HK, Perumal K, et al. Impact of Bacillus in fermented soybean foods on human health. Ann Microbiol. 2021;71(1):30.
[38] Wong-Chew RM, de Castro JA, Morelli L, et al. Gut immune homeostasis: the immunomodulatory role of Bacillus clausii, from basic to clinical evidence. Expert Rev Clin Immunol. 2022;18(7):717-729.
[39] 贺乐丽,刘楚鑫,肖毅,等.N-羟乙酰神经氨酸通过调节肠道菌群致小鼠的炎症机制[J/OL].食品科学,1-18[2024-05-06].http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.2206.TS.20231229.1411.006.html.
[40] 卫钰成,杨敏敏,施琳,等.滇黄精水提物联合间歇性禁食通过调节肠道菌群改善高脂饮食诱导的小鼠肥胖及肝损伤[J].食品与发酵工业, 2022,48(13):91-102.
[41] 娄毛闪,于海宁,沈生荣.膳食亚油酸与肠道菌群和慢性代谢性疾病的关系[J].现代医药卫生,2023,39(21):3611-3614+3619.
[42] 丁庞华,李军祥,毛堂友,等.微生态制剂治疗溃疡性结肠炎研究进展[J].辽宁中医药大学学报,2018,20(9):140-143.

引言

卵巢早衰是一种以卵巢卵母细胞过多丧失和性激素异常为特征的严重疾病[1]。卵巢早衰患者血清促卵泡激素水平升高，雌二醇降低。卵巢早衰可由代谢紊乱、促性腺激素功能障碍、免疫损伤、化学损伤、遗传因素等引起[2]，然而，近一半的卵巢早衰患者的病因尚不清楚。激素替代疗法是目前最常见的治疗卵巢早衰的方法，主要是通过补充患者体内缺乏的雌激素和孕激素，以达到缓解症状、保护患者骨密度、改善心血管健康等目的。虽然激素替代疗法在治疗卵巢早衰方面具有显著效果，但长期使用激素替代疗法可能增加患乳腺癌、心血管疾病、中风等疾病的风险[3]。越来越多证据表明中医药治疗卵巢早衰具有显著的疗效，近年来研究发现六味地黄丸在治疗卵巢早衰方面具有显著的疗效。六味地黄丸能够调节女性内分泌系统，改善卵巢功能，滋补肝肾，延缓衰老进程。
据报道，肠道微生物组的平衡对于女性的卵巢功能具有重要影响，当肠道微生物组失衡时，可能会导致卵巢功能异常，进而引发卵巢早衰[4]。最近，肠道微生物群被证明参与雌激素的肠肝循环，调节血清中雌激素水平[5]。近年来，科学家们发现六味地黄丸中的一些成分具有调节肠道微生物组的作用，它们可以通过影响肠道微生物的代谢和生长，从而调节肠道微生物组的平衡[6]。因此，六味地黄丸可能通过调节肠道微生物组平衡来抑制卵巢早衰。文章探讨了六味地黄丸对环磷酰胺诱导卵巢早衰小鼠氧化应激和肠道微生物群的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，进行单因素方差分析和LSD-t检验。
1.2 时间及地点实验于2023年1-3月在宁夏医科大学少数民族医药现代化教育部重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 45只SPF级雌性ICR小鼠，体质量(20±2) g，随机分为3组(每组15只)：空白组(正常小鼠)、模型组(卵巢早衰小鼠)、六味地黄丸组。所有动物均由宁夏医科大学实验动物中心提供，使用许可证号：SYXK(宁)2020-0001。实验动物在宁夏医科大学实验动物中心进行饲养，给予普通小鼠生长繁殖饲料和纯净水，恒温恒湿，光暗周期12 h/12 h屏障环境，IVC笼具分笼饲养。该研究经宁夏医科大学动物委员会批准(批件号：IACUC-NYLAC-2022-038)。
1.3.2 主要药品、试剂与仪器六味地黄丸(水蜜丸，0.2 g/丸，北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂)；环磷酰胺(MCE公司)；小鼠促卵泡激素、黄体生成素、抗苗勒管激素(anti-Mullerian hormone，AMH)、雌二醇、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、丙二醛测定ELISA试剂盒(上海江莱生物科技有限公司)；组织包埋机、石蜡切片机(Leica公司)、高速冷冻离心机、Multiskan GO 酶标仪、iBright FL1500智能成像仪系统、-80 ℃低温冰箱(Thermo公司)。16S rDNA测序检测由上海美吉生物医药科技有限公司完成。
1.4 实验方法
1.4.1 卵巢早衰模型建立及药物干预除空白组外，其余各组小鼠均一次性腹腔注射环磷酰胺(120 mg/kg)建立卵巢早衰模型[7]。造模后连续观察动情周期10 d，动情周期紊乱则造模成功。造模成功后给药，六味地黄丸组小鼠按照人和动物的体表面积计算，其中小鼠的日剂量相当于成人的9.1倍，则小鼠每日灌胃给药剂量为12 g/70 kg×9.1=1.56 g/kg，六味地黄丸水蜜丸溶于水制备成混悬液进行灌胃；其余两组小鼠均灌胃等量生理盐水，连续灌胃28 d。

1.4.2 测量体质量及计算卵巢指数实验小鼠入组当天称体质量，随后每周记录1次小鼠体质量，药物干预结束后取小鼠卵巢，称取两侧卵巢质量，计算卵巢指数。
卵巢指数=卵巢湿质量(mg)/体质量(g)×100%。
1.4.3 动情周期观察每日早晨9：00取小鼠，用移液枪将20 μL 生理盐水溶液注入小鼠阴道，轻轻抽吸数次。然后将溶液吸出到玻片上染色，显微镜下观察阴道脱落细胞。实验期间每天重复上述步骤观察小鼠的动情周期。
1.4.4 苏木精-伊红染色观察卵巢形态采用1%戊巴比妥钠 50 mg/kg腹腔注射麻醉小鼠，取血后处死，取卵巢并固定于40 g/L多聚甲醛，24-48 h后流水冲洗一夜，然后依次经过梯度乙醇脱水，最后用二甲苯透明。将透明后的卵巢组织包埋，随后将卵巢切片至5 μm厚度，苏木精-伊红染色后梯度乙醇脱水，然后用二甲苯透明，中性树胶封固在显微镜下观察卵巢形态。
1.4.5 ELISA法检测血清相关指标小鼠麻醉后进行摘眼球取血，取血样3 500 r/min离心15 min，4 ℃，取血清，采用ELISA试剂盒检测促卵泡激素、雌二醇、抗苗勒管激素、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、丙二醛。所有实验步骤均按照生产厂家提供的实验步骤进行。
1.4.6 16S-rDNA高通量测序在灌胃结束后收集各组小鼠新鲜粪便样本，交由上海美吉生物进行测序。从保存在-80 ℃的冷冻样品中提取细菌基因组DNA。采用特异性引物(F引物：5’-AGR GTT YGA TYM TGG CTC AG-3’；R引物：5’-RGY TAC CTT GTT ACG ACT T -3’)。根据DNA样品准备试剂盒构建16S rDNA基因克隆数据库。应用主成分分析(PCA)比较肠道微生物组的细菌多样性。采用线性判别分析(LDA)，通过LEfSe筛选出不同的物种。最后，根据KEGG数据库(https://www.genome.jp/kegg/)对肠道微生物组的功能进行标注。
1.5 主要观察指标 ①小鼠体质量及卵巢指数；②小鼠动情周期；③卵巢形态；④激素水平；⑤卵巢氧化应激指标；⑥肠道微生物群变化。
1.6 统计学分析运用SPSS 29.0统计分析软件对所得数据进行统计，计量资料用x±s表示。多个样本均数间比较采用完全随机设计的单因素方差分析(One-Way ANOVA)，多个样本均数之间的多重比较采用LSD-t检验；当各组方差不齐时用非参检验，检验水准为α=0.05。该文章的统计学方法已经通过宁夏医科大学生物统计学专家审核。

讨论

卵巢早衰是一种多因素疾病，是指40岁以下女性继发性闭经、雌激素减少和促性腺激素升高的发生[12]。随着生活节奏的加快和女性社会角色的日益重要，卵巢早衰问题愈发凸显出其严重性。卵巢早衰可导致具有生理或心理问题的女性不孕症[13]。卵巢早衰的病因和发病机制尚不清楚，主要与永久性卵巢损伤有关。临床上，长期激素替代疗法，主要是雌激素和黄体酮，是卵巢早衰女性最常见的治疗方法，但长期使用激素替代疗法可能会增加心血管疾病和癌症的风险[14]。因此，有必要寻找替代治疗形式。在中医学中，卵巢早衰归属于“闭经”“不孕症”等范畴，而肾虚是中医认为的卵巢早衰的主要原因之一[15]。中医药长期以来一直用于治疗各种疾病，并可有效治疗多种妇科疾病，如多囊卵巢综合征和不孕症[16]。六味地黄丸是滋阴补肾的经典方，现代医学研究表明，六味地黄丸具有抗氧化、抗衰老[17]、调节雌激素水平的作用，能够调节女性内分泌系统，改善卵巢功能，从而有效缓解卵巢早衰的症状[18]。
化疗被认为是卵巢早衰的主要原因之一，尤其是烷化剂的广泛应用，如乳腺癌化疗的核心药物环磷酰胺，具有很高的临床毒性。许多研究表明，环磷酰胺通过加速滤泡闭锁来诱导卵巢早衰，由多种机制诱导，包括氧化应激和脂质过氧化，细胞凋亡和炎症[7]。研究表明，当小鼠腹腔注射120 mg/kg 环磷酰胺时，卵巢中的所有卵泡都减少了，原始卵泡也减少了[19]。因此，此次研究采用一次性腹腔注射120 mg/kg 环磷酰胺来建立小鼠卵巢早衰模型。
实验结果表明，注射环磷酰胺后，小鼠闭锁卵泡明显增加，黄体明显减少，卵泡颗粒细胞层变薄，提示卵巢受损。此外，模型组小鼠血清中促卵泡激素表达水平显著升高，血清抗苗勒管激素和雌二醇含量显著降低，与卵巢早衰的临床表现基本一致。而在六味地黄丸治疗后小鼠血清中抗苗勒管激素、雌二醇的表达明显上升，促卵泡激素明显下降。这些结果表明，六味地黄丸对环磷酰胺诱导的卵巢早衰小鼠卵巢具有保护作用。六味地黄丸可以增加小鼠卵巢中的卵泡数量，改善卵巢功能。
近年来，随着微生物组学的发展，人们逐渐认识到肠道微生物组在卵巢早衰中扮演着重要的角色。最近的研究发现，肠道微生物组与雌激素的肠肝循环密切相关，能够参与调节血清中雌激素的水平[20]。据报道，雌激素水平可以通过下丘脑垂体卵巢(HPO)轴诱导正负反馈机制[21]。激素在体内的代谢过程涉及到肠肝循环，在这个过程中，雌激素被肝脏代谢后通过胆汁排入肠道，再被肠道微生物组分解代谢，这种分解代谢过程可以影响雌激素的再吸收和利用，从而调节血清中雌激素的水平[22]。研究表明肠道微生物组的紊乱会破坏肠黏膜的屏障[23]，致病菌及其代谢物通过血液循环到达卵巢，降低卵巢功能[24]；肠道微生物群-卵巢轴有助于卵泡发育[25]。此外，有学者通过肠道微生物组检测和代谢组学发现卵巢早衰患者在门水平上可以观察到较高的拟杆菌属和较低的厚壁菌属丰度[26]，这些微生物变化与促卵泡激素、黄体生成素、雌二醇和抗苗勒管激素的水平以及促卵泡激素/黄体生成素比值相关[27]。在实施激素替代疗法后发现肠道微生物组的β多样性，Eggerthella属的相对丰度，血清代谢物以及雌二醇和孕激素水平的改变显著逆转，这进一步验证了雌激素与肠道微生物群之间的相互作用[28]。因此，肠道微生物组可能与卵巢功能密切相关。
氧化应激是由活性氧的过度产生和抗氧化防御机制缺陷引起的，被认为是颗粒细胞凋亡的主要原因[29]。在卵巢组织中，正常水平的活性氧在卵泡生长、鞘内血管生成和性激素合成中起着重要的调节作用；然而，当活性氧水平过高时它们容易受到细胞损伤，这可能表现为卵泡卵母细胞发育受损、卵巢早衰和生育能力下降[30]。氧化应激损伤可下调抗氧化基因表达，导致卵巢脂质过氧化和DNA氧化损伤，影响卵巢功能和卵母细胞质量。减少颗粒细胞氧化应激可减轻其损伤，减少滤泡闭锁并延缓卵巢早衰[31]。环磷酰胺作用对象具有广谱性，会破坏肠道上皮细胞，增加肠道的通透性，破坏肠黏膜和肠道微生物组组成[32]，其毒性作用可阻碍DNA合成并干扰卵巢的抗氧化防御机制，导致活性氧和丙二醛过量产生[33]。超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的一个主要功能是通过维持细胞的氧化还原平衡来清除活性氧并防止氧化应激，丙二醛是氧化应激的重要生物标志物，被广泛用作氧化损伤的指标[34]。ELISA结果显示，模型组小鼠血清中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶含量显著降低，丙二醛含量显著增加，六味地黄丸治疗后增加了血清中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶的含量，降低了丙二醛的含量。综上，作者认为卵巢氧化应激可能会影响卵巢储备功能；六味地黄丸对环磷酰胺诱导的卵巢早衰具有保护作用，并可以逆转氧化应激状态。因卵巢功能与肠道微生物关系密切，由此推测卵巢早衰小鼠肠道微生物组紊乱可能与卵巢氧化应激有关。
同时，通过对各组小鼠粪便的16S rDNA测序，结果发现六味地黄丸治疗后增加了Ace和Chao指数，说明六味地黄丸增加了小鼠肠道微生物组的相对丰度。LDA分析法发现空白组小鼠肠道微生物组中相对表达量最高的3种优势微生物组是乳酸杆菌科、芽孢杆菌、乳酸杆菌目，乳酸菌在维持人体健康方面具有重要作用，被认为是肠道中最重要的益生菌之一[35]，乳酸菌可抑制病原菌的生长和繁殖[36]。芽孢杆菌主要栖息在大肠中，通过分解食物残渣产生短链脂肪酸等有益物质，为肠道细胞提供能量[37]。此外，它们还能合成多种维生素和矿物质，对维持人体健康至关重要。芽孢杆菌还具有抑制有害菌生长的能力，通过产生抗菌物质、竞争营养物质和占据肠道黏膜表面等方式，抑制病原菌的繁殖，维护肠道微生态平衡[38]。空白组的3种优势菌群都是益生菌，对维持肠道健康的生理功能具有重要意义。模型组小鼠的优势菌群为颤螺菌科、真细菌目、梭状芽胞杆菌。颤螺菌科是一种与肠道炎症密切相关的菌群[39]。真细菌目是一类具有代谢多样性的菌群，拥有灵活多变的代谢途径和酶系统。梭状芽胞杆菌是厌氧菌，可以通过产生抗氧化物质、调节宿主细胞代谢以及影响宿主细胞抗氧化防御系统等方式，减轻氧化应激对细胞的损伤[40]。在六味地黄丸组中，Lachnoclostridium、链球菌、链球菌族是相对表达最高的3种微生物组。Lachnoclostridium与人体内的多种生理过程密切相关，如碳水化合物代谢、维生素合成等，其与肥胖、糖尿病等代谢性疾病的发生和发展也有一定的关联[41]。链球菌是一种革兰阳性球菌，广泛存在于自然界和人体中，根据其表面抗原的不同，链球菌可分为多个不同的族群，可引起多种疾病，但某些链球菌在人体内具有益生作用，可以帮助维护肠道健康、增强免疫力等。链球菌族在维护人体肠道微生态平衡、促进营养物质吸收等方面发挥着重要作用[42]。同时，某些链球菌族菌株还具有潜在的益生功能，如调节免疫、抗氧化、抗肿瘤等。同时六味地黄丸相较与模型组可以显著升高厚壁菌门/拟杆菌门比值，说明六味地黄丸对改善肠道微生物组结构有很好的效果，主要表现为益生菌相对丰度的上调。PICRUSt2功能预测分析表明，六味地黄丸可能在调节代谢途径、次生代谢产物的生物合成、不同环境中的微生物代谢、氨基酸的生物合成等方面具有潜在作用。
然而，六味地黄丸调节肠道微生物平衡、抑制卵巢早衰小鼠氧化应激的具体机制尚不完全清楚，这需要更深入的研究来阐明药物与肠道微生物组之间的相互作用。此外，六味地黄丸虽然可以在一定程度上调节肠道微生物群的平衡，但其效果可能受到多种因素的影响。例如，每个人的肠道微生物组存在差异，这可能会导致每个人的药物效果存在差异。因此，在实际应用中，需要根据患者的具体情况进行个体化治疗。但是尽管有这些局限性，六味地黄丸在治疗卵巢早衰方面仍然具有重要意义。首先，六味地黄丸提供了一种新的治疗策略，通过调节肠道微生物组的平衡来抑制卵巢早衰的氧化应激；其次，作为中药制剂，其毒副作用低、安全性高，为患者提供了更温和的治疗方法。
综上所述，六味地黄丸能有效抑制卵巢早衰小鼠卵巢氧化应激，其潜在机制之一可能与肠道微生物组的改变有关。接下来作者将继续关注肠道微生物组与六味地黄丸治疗卵巢早衰之间的关系，并深入探讨其他潜在机制以验证和完善现有研究成果，为临床应用提供更多科学依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

六味地黄丸调节肠道微生物组平衡抑制卵巢早衰小鼠的氧化应激

Liuwei Dihuang Wan inhibits oxidative stress in premature ovarian failure mice by regulating intestinal microbiota #br#
#br#

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 10

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	赖鹏宇, 梁冉, 沈山. 组织工程技术修复颞下颌关节：问题与挑战[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(在线): 1-9.
[2]	孙家琪, 卞璐, 史文涛, 吴学潮, 鲁晓杰. 压电型机械门控离子通道组件1在大鼠压力性损伤中的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(8): 1578-1584.
[3]	刘琳, 刘世轩, 陆馨悦, 王侃. 慢性肌筋膜触发点模型大鼠的尿液代谢组学分析[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(8): 1585-1592.
[4]	苏晓杨, 陈文婷, 付怡丹, 赵燕, 兰丹凤, 杨秋萍. Mer受体酪氨酸激酶与SD大鼠糖尿病周围神经病变的相关性[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(8): 1593-1599.
[5]	李开颖, 魏晓歌, 宋斐, 杨楠, 赵振宁, 王燕, 穆静, 马惠昇. 理筋手法调控兔骨骼肌损伤修复中瘢痕形成的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(8): 1600-1608.
[6]	李俊, 巩晶晶, 孙国斌, 郭睿, 丁杨, 强立娟, 张晓莉, 方占海. miR-27a-3p激活MAPK信号通路促进人增生性瘢痕成纤维细胞的增殖[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(8): 1609-1617.
[7]	李花园, 李春, 刘君伟, 王亭, 李龙, 武永利. 温针灸干预慢性疲劳综合征大鼠骨骼肌PINK1/Parkin通路的变化[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(8): 1618-1625.
[8]	静如意, 陈颖欣, 曹蕾. 深板层角膜移植与穿透性角膜移植治疗基质角膜营养不良预后的比较[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(8): 1626-1633.
[9]	王选强, 张文洋, 李阳, 孔维签, 李伟, 王乐, 厉中山, 白石. 低频脉冲磁场慢性暴露对健康成年股四头肌收缩力及形态的影响[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(8): 1634-1642.
[10]	张雨馨, 于聪, 张翠, 丁建军, 陈岩. 轻度认知障碍老人与认知正常老人在不同单双任务下姿势控制能力的差异性[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(8): 1643-1649.
[11]	周盼盼, 崔应麟, 张文涛, 王姝瑞, 陈佳慧, 杨潼. 细胞自噬在脑缺血损伤中的作用及中药调控机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(8): 1650-1658.
[12]	于经邦, 吴亚云. 非编码RNA在肺纤维化过程中的调控作用[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(8): 1659-1666.
[13]	王秋月, 靳攀, 蒲锐. 运动干预与细胞焦亡在骨关节炎中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(8): 1667-1675.
[14]	朱汉民, 王松, 肖文琳, 张文静, 周茜, 何烨, 李微, . 线粒体自噬调控骨代谢[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(8): 1676-1683.
[15]	袁维勃, 刘婵, 余丽梅. 肝脏类器官在肝脏疾病模型与移植治疗中的应用潜力[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(8): 1684-1692.