尼古丁对鱼藤酮诱导帕金森病小鼠模型的神经保护作用机制

doi:10.12307/2024.821

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (35): 5612-5617.doi: 10.12307/2024.821

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尼古丁对鱼藤酮诱导帕金森病小鼠模型的神经保护作用机制

张歆悦1，2，祝柳慧1，何雨3，管莹2，朱洲海2，任惠1，杨兴隆1，2

1昆明医科大学第一附属医院老年神经内科，云南省昆明市 650032；2烟草与健康联合研究院，云南省昆明市 650231；3昆明医科大学第一临床学院，云南省昆明市 650500

收稿日期:2023-11-06 接受日期:2023-12-18 出版日期:2024-12-18 发布日期:2024-03-15
通讯作者: 杨兴隆，博士，副主任医师，昆明医科大学第一附属医院老年神经内科，云南省昆明市 650032；烟草与健康联合研究院，云南省昆明市 650231
作者简介:张歆悦，女，1993年生，云南省昆明市人，汉族，2020年昆明医科大学毕业，硕士，主要从事神经退行性疾病方面的研究。
基金资助:
云南省应用基础项目(202101AY070001-115)，项目负责人：杨兴隆；烟草与健康联合研究院开放基金(2021539200340039)，项目负责人：杨兴隆

Neuroprotective mechanism of nicotine in a mouse model of rotenone-induced Parkinson’s disease

Zhang Xinyue1, 2, Zhu Liuhui1, He Yu3, Guan Ying2, Zhu Zhouhai2, Ren Hui1, Yang Xinglong1, 2

1Department of Geriatric Neurology, The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650032, Yunnan Province, China; 2Joint Research Institute of Tobacco and Health, Kunming 650231, Yunnan Province, China; 3The First Clinical College of Kunming Medical University, Kunming 650500, Yunnan Province, China

Received:2023-11-06 Accepted:2023-12-18 Online:2024-12-18 Published:2024-03-15
Contact: Yang Xinglong, PhD, Associate chief physician, Department of Geriatric Neurology, The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650032, Yunnan Province, China; Joint Research Institute of Tobacco and Health, Kunming 650231, Yunnan Province, China
About author:Zhang Xinyue, Master, Department of Geriatric Neurology), The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650032, Yunnan Province, China; Joint Research Institute of Tobacco and Health, Kunming 650231, Yunnan Province, China
Supported by:
Yunnan Provincial Applied Basic Project, No. 202101AY070001-115 (to YXL); Open Fund for Joint Research Institute on Tobacco and Health, No. 2021539200340039 (to YXL)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

尼古丁：是烟草的主要成分之一，具有良好的血脑屏障通过性，半衰期短，可以作为药物制剂缓解帕金森病的运动症状和非运动症状。尼古丁可以通过激动黑质纹状体中的烟碱型乙酰胆碱受体途径和非烟碱型乙酰胆碱受体途径对多巴胺能神经元产生保护作用。
帕金森病：是一种常见的神经退行性疾病，特点是中脑多巴胺能神经元变性，病理特征是α-突触核蛋白的异常沉积和路易小体病变，临床表现主要是静止性震颤、肌肉强直、步态异常、运动迟缓等。

背景：研究发现尼古丁可以激活脑部的多巴胺系统，减缓帕金森病的发展，但具体机制尚不明确，目前缺乏对帕金森病动物模型神经保护作用的机制研究。

目的：探讨尼古丁对鱼藤酮诱导帕金森病小鼠的神经保护作用机制。
方法：将28只C57BL/6小鼠随机分为溶剂组、鱼藤酮组、自噬激动剂+鱼藤酮组和尼古丁+鱼藤酮组，每组7只，利用鱼藤酮诱导C57BL/6小鼠多巴胺能神经损害，在造模前给予自噬激动剂(雷帕霉素)或尼古丁，干预结束后进行旷场实验观察小鼠空间探索功能；采用Western blot和Q-PCR检测黑质中α-突触核蛋白的表达，自噬相关因子Beclin-1、P62的表达以及凋亡相关因子Bax、Bcl-2和Cleaved-caspase-3的表达；透射电镜观察黑质中线粒体、自噬小体和脂褐素沉积情况；尼氏染色观察神经元的存活情况；免疫荧光和免疫组化染色观察黑质中酪氨酸羟化酶的表达。

结果与结论：①旷场实验显示，与溶剂组相比，鱼藤酮组小鼠表现出运动距离、平均速度和运动时间均减少；与鱼藤酮组相比，尼古丁+鱼藤酮组和自噬激动剂+鱼藤酮组小鼠运动距离、平均速度和运动时间均增加(P < 0.05)。②免疫荧光和免疫组化结果显示，与溶剂组相比，鱼藤酮组酪氨酸羟化酶平均荧光强度和平均吸光度值减小；与鱼藤酮组相比，尼古丁+鱼藤酮组和自噬激动剂+鱼藤酮组酪氨酸羟化酶平均荧光强度和平均吸光度值增加。③Western blot和Q-PCR结果显示，与溶剂组相比，鱼藤酮组α-突触核蛋白、P62表达升高，Beclin-1表达减少(P < 0.05)；与鱼藤酮组相比，尼古丁+鱼藤酮组和自噬激动剂+鱼藤酮组α-突触核蛋白、P62表达减少，Beclin-1表达增多(P < 0.05)。与溶剂组相比，鱼藤酮组Bax、Cleaved-caspase-3表达增多，Bcl-2表达减少(P < 0.05)；与鱼藤酮组相比，尼古丁+鱼藤酮组和自噬激动剂+鱼藤酮组Bax、Cleaved-caspase-3表达减少，Bcl-2 表达增多(P < 0.05)。结果提示，尼古丁可能是通过改善自噬功能障碍和减少细胞凋亡，对鱼藤酮诱导的帕金森病小鼠模型产生多巴胺能神经保护作用。

https://orcid.org/0000-0001-5801-5211(杨兴隆)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 尼古丁, 自噬, 凋亡, 鱼藤酮, 帕金森病, 神经保护, α-突触核蛋白, 酪氨酸羟化酶

Abstract: BACKGROUND: Studies have found that nicotine can activate the dopamine system, slowing the progression of Parkinson’s disease, but the specific mechanism is still unclear. Research on the neuroprotective mechanism of nicotine in animal models of Parkinson’s disease is lacking.
OBJECTIVE: To investigate the neuroprotective effect of nicotine on rotenone-induced Parkinson’s disease in mice.
METHODS: Twenty-eight C57BL/6 mice were randomly divided into vehicle group, rotenone group, autophagy agonist group and nicotine group, with seven mice in each group. Dopaminergic nerve damage was induced by rotenone in C57BL/6 mice, and the autophagy agonist (rapamycin) or nicotine was given before modeling. The spatial exploration function of the mice was observed by open field test. Western blot and Q-PCR were used to detect the expression of α-synuclein, autophagy related factors Beclin-1 and P62, and apoptosis-related factors Bax, Bcl-2 and Cleaved-caspase3 in the nigra of each group. The deposition of mitochondria, autophagosomes and lipofuscin in nigra cells were observed by transmission electron microscopy. The survival of neurons was observed by Nissl staining. The expression of tyrosine hydroxylase was observed by immunofluorescence and immunohistochemical staining.
RESULTS AND CONCLUSION: The open field test showed that the distance, average speed and time of movement were reduced in the rotenone group compared with the solvent group. Compared with the rotenone group, the exercise distance, average speed and exercise time of mice were increased in the nicotine group and autophagy agonist group (P < 0.05). The results of immunofluorescence and immunohistochemistry showed that the mean fluorescence intensity and mean absorbance value of tyrosine hydroxylase in the rotenone group decreased compared with that in the solvent group. Compared with the rotenone group, the mean fluorescence intensity and mean absorbance value of tyrosine hydroxylase were increased in the nicotine group and autophagy agonist group. Western blot and Q-PCR results showed that compared with the solvent group, the expressions of α-synuclein and P62 in the rotenone group were increased, while Beclin-1 expression was decreased (P < 0.05); compared with the rotenone group, the expression of α-synuclein and P62 decreased in the nicotine group and autophagy agonist group, and the expression of Beclin-1 increased (P < 0.05). Compared with the solvent group, the expressions of Bax and Cleaved caspase3 were increased and Bcl-2 expression was decreased in the rotenone group (P < 0.05); compared with the rothenone group, the expressions of Bax and Cleaved-caspase3 were decreased and the expression of Bcl-2 was increased in the nicotine and autophagy agonist groups (P < 0.05). To conclude, nicotine may have a dopaminergic neuroprotective effect on rotenone-induced Parkinson’s disease mouse models by improving autophagy dysfunction and reducing apoptosis.

Key words: nicotine, autophagy, apoptosis, rotenone, Parkinson’s disease, neuroprotection, alpha-synuclein, tyrosine hydroxylase

中图分类号:

张歆悦, 祝柳慧, 何雨, 管莹, 朱洲海, 任惠, 杨兴隆. 尼古丁对鱼藤酮诱导帕金森病小鼠模型的神经保护作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(35): 5612-5617.

Zhang Xinyue, Zhu Liuhui, He Yu, Guan Ying, Zhu Zhouhai, Ren Hui, Yang Xinglong. Neuroprotective mechanism of nicotine in a mouse model of rotenone-induced Parkinson’s disease[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(35): 5612-5617.

图/表（结果） 7

2.1 实验动物数量分析实验选用C57BL/6小鼠28只，随机分为4组，无脱落，均进入结果分析。
2.2 旷场实验结果与溶剂组相比，鱼藤酮组小鼠垂直站立次数明显下降，总运动路程减少，平均运动速度减慢，总静止时间延长，进入中心区域次数减少，差异均有显著性意义(P < 0.05)；与鱼藤酮组相比，自噬激动剂+鱼藤酮组和尼古丁+鱼藤酮组小鼠垂直站立次数明显增多，总运动路程增长，平均运动速度增加，总静止时间减少，进入中心区域次数增多，差异均有显著性意义(P < 0.05)，见图1。

2.3 尼氏染色结果溶剂组小鼠纹状体中尼氏小体丰富，呈深蓝色，鱼藤酮组尼氏体减少、解体甚至消失，说明鱼藤酮对神经元具有毒性作用；自噬激动剂+鱼藤酮组和尼古丁+鱼藤酮组尼氏小体重新出现并明显增加，说明激活自噬或者添加尼古丁能够挽救鱼藤酮造成的毒性，见图2。

2.4 免疫荧光和免疫组化染色结果与溶剂组相比，鱼藤酮组酪氨酸羟化酶的免疫组化平均吸光度值和免疫荧光平均荧光强度减低，差异均有显著性意义(P < 0.05)，证明鱼藤酮诱导损害小鼠多巴胺能神经；与鱼藤酮组相比，尼古丁+鱼藤酮组以及自噬激动剂+鱼藤酮组酪氨酸羟化酶的免疫组化平均吸光度值和免疫荧光平均荧光强度增多，差异均有显著性意义(P < 0.05)，证明尼古丁预处理可以挽救多巴胺能神经损伤，并且雷帕霉素激活了自噬功能，使得多巴胺能神经损伤得到改善，见图3，4。

2.5 透射电镜观察结果溶剂组线粒体形态结构正常，鱼藤酮组出现许多双层膜的自噬小体，其中含有线粒体和内质网碎片等被消化的细胞器，线粒体形态肿胀，线粒体嵴消失，并伴有脂褐素的沉积；尼古丁组+鱼藤酮和自噬激动剂+鱼藤酮组自噬小体减少，线粒体形态改善，脂褐素减少，见图5。

2.6 Western blot和Q-PCR检测α-突触核蛋白、自噬以及凋亡相关蛋白的mRNA和蛋白表达水平与溶剂组相比，鱼藤酮组α-突触核蛋白、P62 mRNA和蛋白的表达增多，Beclin-1 mRNA和蛋白表达减少，差异均有显著性意义(P < 0.05)；与鱼藤酮组相比，尼古丁+鱼藤酮组以及自噬激动剂+鱼藤酮组α-突触核蛋白、P62 mRNA和蛋白表达减少，Beclin-1 mRNA和蛋白表达增多，差异均有显著性意义(P < 0.05)，见图6。与溶剂组相比，鱼藤酮组Bax、Cleaved-caspase-3 mRNA和蛋白表达增多，Bcl-2 mRNA和蛋白表达减少，差异均有显著性意义(P < 0.05)；与鱼藤酮组相比，尼古丁+鱼藤酮组以及自噬激动剂+鱼藤酮组Bax、Cleaved-caspase-3 mRNA和蛋白表达减少，Bcl-2 mRNA和蛋白表达增多，差异均有显著性意义(P < 0.05)，见图7。

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引言

帕金森病是一种常见的神经退行性疾病，主要病理表现为中脑黑质多巴胺神经元退变以及残存神经元中路易小体的沉积，最终导致多巴胺的分泌减少。帕金森病的临床特征包括静止性震颤、运动缓慢、肌肉僵直和姿势步态异常等运动症状[1]，并且有认知功能障碍、抑郁、睡眠障碍等非运动症状，主要病因是在老龄背景下环境和遗传因素交互作用的结果[2]。然而，目前鲜有能够减缓帕金森病发病且具有神经保护作用的药物，其根本原因在于帕金森病的发病机制尚不清楚。因此，加强帕金森病发病机制和延缓疾病进展的研究，对于积极应对人口老龄化和提高生活质量有着重要意义。
既往的流行病学研究报告显示吸烟可以降低帕金森病的发病率[3-4]，并且孟德尔随机化研究也提示尼古丁与帕金森病有因果关系[5-6]。尼古丁是烟草中生物碱的主要成分，具有良好的血脑屏障透过能力，所以在神经病学临床研究中有很好的前景[7]。研究表明，经皮给予尼古丁贴剂可以有效改善帕金森病患者的异动症和减少左旋多巴服用量[8]。然而尼古丁治疗帕金森病的具体机制尚未阐明。因此，进一步研究尼古丁对帕金森病所表现出的神经保护作用，对于开展尼古丁的临床应用以及发现帕金森病新的治疗靶点均有着积极的意义。
自噬是一种细胞自身降解细胞器和错误折叠蛋白的过程，神经退行性疾病的产生常伴有细胞自噬水平的下降，而激活自噬可以通过清除神经元细胞中的异常蛋白，从而阻碍或者延缓神经退行性疾病的发生[9-11]。因此，改善自噬功能障碍可能是潜在的治疗神经退行性疾病的有效方法。
该研究采用鱼藤酮制备C57BL/6小鼠帕金森病模型，研究尼古丁发挥多巴胺能神经保护作用的机制，为尼古丁应用于帕金森病的治疗提供理论和实验基础。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2022年4-12月在昆明医科大学生物医学工程研究中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 28只8-10周龄雄性C57BL/6小鼠，SPF级，体质量30 g左右，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证编号：SCXK(湘)2019-0004，饲养于云南洛宇生物科技有限公司，许可证编号：SYXK(滇)K2021-0003，饲养条件：室温25 ℃，湿度50%-60%，12 h昼夜交替光照，自由饮食饮水，适应性饲养1周后进行实验。
实验方案经云南洛宇生物科技有限公司动物实验伦理委员会批准，审批号为PZ20220407。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.3.2 主要试剂及仪器尼古丁、鱼藤酮购于美国Sigma公司；兔抗α-突触核蛋白抗体购于Abcam公司；兔抗P62抗体、兔抗Beclin-1抗体、兔抗Bax抗体、兔抗Bcl-2抗体、兔抗Cleaved-caspase-3抗体购于CST公司；兔抗酪氨酸羟化酶抗体和荧光二抗购于Proteintech公司；ECL化学发光检测试剂购于合肥白鲨公司；蛋白电泳仪、半干转膜仪和凝胶成像系统购于美国Bio-Rad公司；戊二醛固定液、锇酸固定液、磷酸缓冲液购于北京索莱宝公司。
1.4 方法
1.4.1 动物分组、造模及干预 28只C57BL/6小鼠随机分为以下4组，每组7只。①溶剂组：腹腔注射0.2 mL含2%二甲基亚砜的生理盐水，每天1次，连续注射3周。②鱼藤酮组：腹腔注射3 mg/kg鱼藤酮(鱼藤酮溶于含2%二甲基亚砜的生理盐水中)，然后立即腹腔注射0.2 mL含2%二甲基亚砜的生理盐水，每天1次，连续注射3周。③自噬激动剂+鱼藤酮组：腹腔注射雷帕霉素2.0 mg/kg，每隔1 d注射1次，第28天停止注射雷帕霉素，开始腹腔注射3 mg/kg鱼藤酮，每天1次，连续注射3周。④尼古丁+鱼藤酮组：腹腔注射1.0 mg/kg尼古丁，连续注射7 d，第8天停止注射尼古丁，开始腹腔注射3 mg/kg鱼藤酮，每天1次，连续注射3周。
1.4.2 旷场实验各组实验动物干预结束后进行旷场实验。选择规格为50 cm×50 cm×40 cm的实验箱，将小鼠放在实验箱中央区域，并迅速将手抽离实验箱范围。打开动物行为学分析软件，自动记录5 min内动物在实验箱内的活动轨迹。每换1只小鼠进入实验箱之前应擦净实验箱中的粪便并喷洒体积分数75%乙醇，以免气味对小鼠的活动产生影响。
1.4.3 取材旷场实验结束后取材，进行下一步的形态学和分子生物学检测，每组取3只小鼠的脑组织用于脑切片染色和透射电镜观察，每组取4只小鼠的脑组织用于Western blot和PCR实验。
组织冰冻切片的制作：将固定好的脑组织从4 ℃冰箱中取出，依次经10%，15%，30%蔗糖溶液梯度脱水，取出脑组织用滤纸小心吸干表面液体后，用OCT包埋剂包埋，然后快速放入液氮速冻15 s左右，置于低温冰冻切片机中进行切片，切片厚度为8-10 μm，组织切片后贴在0.75%明胶溶液均匀涂抹的正电荷黏附载玻片上，在室温下过夜晾干。
1.4.4 尼氏染色尼氏染液常温保存，于染色前1 d放入37 ℃温箱预热过夜，将组织切片室温下复温30 min，将组织切片放入染色架，在蒸馏水中漂洗2 min，切片放入染缸中染色8 min，将组织切片放入蒸馏水中终止染色，切片放入体积分数95%乙醇中分色3 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，普通光学显微镜观察并拍照。
1.4.5 免疫荧光染色将组织切片取出复温到室温，0.1 mol/L PBS漂洗，体积分数5%山羊血清室温孵育1 h，分别加入一抗(兔抗酪氨酸羟化酶抗体，1∶500)于4 ℃冰箱孵育过夜，PBS漂洗后，加入Cy3标记的山羊抗兔 IgG荧光二抗(1∶200)，置于室温下避光孵育1 h，用含有DAPI的封片剂进行封固，正置荧光显微镜观察并拍照。
1.4.6 免疫组化染色将组织切片放在染色架上，浸入蒸馏水中，然后放在摇床上水化漂洗，用组画笔圈住组织；放入免疫组化湿盒，滴加A试剂(内源性过氧化物酶阻断剂)反应30 min；组织切片浸入PBS-3% TritonX-100，放在摇床上漂洗10 min，使其破膜；放入免疫组化湿盒，滴加正常山羊血清封闭液，避光反应15 min；弃去血清，将组织切片浸入PBS-0.01% TritonX-100，放在摇床上漂洗3次，每次3 min；用一抗稀释液稀释一抗(酪氨酸羟化酶一抗1∶500)，4 ℃冰箱孵育过夜；次日将切片从4 ℃冰箱取出，于室温复温后，滴加C试剂(生物素标记的羊抗鼠/兔 IgG)，避光反应15 min；滴加D试剂(链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶)，避光反应15 min，DAB显色后，进行梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，普通光学显微镜观察并拍照。
1.4.7 透射电镜观察使用解剖器械取小鼠脑组织，在冰盒上操作，应注意操作宜轻，避免牵拉、挫伤与挤压，脑组织体积不超过1 mm×1 mm×1 mm，应在最短时间内(1 min内)投入2.5%戊二醛固定液固定2 h以上，然后使用1%锇酸固定液固定一两个小时，用PBS漂洗20 min，使用体积分数40%，50%，60%，80%乙醇进行梯度浓度脱水，然后换成丙酮继续脱水，使用环氧树脂包埋，用超薄切片机切成50-70 nm的超薄切片。超薄切片先用醋酸双氧铀染色，使细胞核及结缔组织着色，然后用柠檬酸铅染色，以提高细胞质成分的反差，最后透射电镜观察。
1.4.8 Western blot检测用生理盐水心脏灌流小鼠，观察肝脏变白之后取出小鼠脑组织，分离出黑质，用0.1 mol/L PBS轻柔冲洗，按照每100 mg新鲜脑组织中加入1 000 μL RIPA裂解液和10 μL PMSF，使用超声低温匀浆机匀浆，冰上静置裂解15 min，在4 ℃高速低温离心机中离心15 min后吸取上清，用蛋白浓度检测试剂盒(BCA法)检测其蛋白浓度，然后进行SDS-PAGE蛋白电泳，采用22 V/80 min的半干转进行转膜，加入5%脱脂牛奶于室温封闭2 h，加入一抗(兔抗α-突触核蛋白抗体，兔抗P62抗体，兔抗Beclin-1抗体，兔抗Bax抗体，兔抗Bcl-2抗体，兔抗Cleaved-caspase-3抗体，稀释比例均为1∶1 000)于4 ℃冰箱在水平摇床上过夜，TBST洗涤3遍，用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(1∶10 000)于室温孵育1.5 h，TBST洗涤3遍，采用化学发光法加入ECL试剂于凝胶成像系统显影。

1.4.9 实时荧光定量PCR检测 Trizol试剂提取各组脑组织的总RNA，参考PrimeScript RT reagent Kit将总RNA反转录为cDNA。以β-actin为内参，采用PrimeScript™ RT-PCR Kit进行mRNA的定量分析。qPCR反应体系(50 μL)：PCR BufferⅡ 5 μL，dNTP Mixture 2 μL，PCR正反引物各0.5 μL，TaKaRa Ex TaqHS 0.5 μL，DNA模板5 μL，添加H2O2至50 μL。qPCR反应条件：94 ℃ 1 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，进行至少35个循环。实验结果采用2-ΔΔCt进行计算。各基因引物序列及内参引物序列见表1。

1.5 主要观察指标 ①小鼠运动距离、平均速度和运动时间；②酪氨酸羟化酶平均荧光强度和平均吸光度值；③α-突触核蛋白表达水平；④自噬相关因子P62、Beclin-1表达水平；⑤凋亡相关因子Bax、Cleaved-caspase-3、Bcl-2表达水平；⑥尼氏小体、自噬小体状态。
1.6 统计学分析实验结果采用Image J进行计算，实验数据采用SPSS 20.0统计学软件进行分析，统计图采用Graphpad prism 8.0软件进行绘制。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过昆明医科大学生物统计学专家审核。

讨论

帕金森病的病因复杂，基因、神经退变和环境因素都可能参与帕金森病的发生，病因学研究认为环境因素是神经退行性变的一个重要致病原因，帕金森病是由于暴露于多巴胺能神经毒素所致。研究表示居住在农村环境中以及接触除草剂和杀虫剂会增加患帕金森病的风险[12]。鱼藤酮是一种存在于环境中的线粒体毒素，是从热带植物中提取的天然细胞毒性化合物类鱼藤酮中最有效的成分，被广泛用作杀虫剂和鱼毒。鱼藤酮可以作用于线粒体复合物Ⅰ，从而阻断细胞的氧化呼吸[13]。该研究采用鱼藤酮溶解于二甲基亚砜后腹腔注射构建帕金森病小鼠模型进行研究。
关于尼古丁的神经保护作用研究由来已久，早在1968年的一项回顾性研究报道了吸烟者比不吸烟者发生帕金森病的风险更低[14]。为了排除遗传因素或环境因素造成的混杂因素影响，在同卵双胞胎中进行了研究，同样得出结论是患帕金森病的风险与吸烟剂量呈负相关[15]。尼古丁相关的多项研究表明，尼古丁对帕金森病的神经保护作用机制主要包括对抗蛋白聚集、抗氧化应激、抗炎反应、抗细胞凋亡作用，能够拮抗6-羟基多巴胺、1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶、谷氨酸代谢失衡和铁死亡所引起的神经元损伤等[16-17]。
对于帕金森病的动物模型研究发现，尼古丁可以抵抗1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶、6-羟多巴胺和鱼藤酮等神经毒性物质，也能抵抗由于金属离子诱导的细胞凋亡，发挥神经保护作用；另一方面，尼古丁可以激发脑内多巴胺的释放，缓解帕金森病症状等作用[18]。另外，尼古丁可以激动α7烟碱型乙酰胆碱受体，这个受体的激活利于抗炎信号通路的激活和促进神经元的存活[19-20]。此外，还有研究表明，尼古丁也可能通过抑制黑质星形胶质细胞的激活从而发挥神经保护作用[21]。旷场实验是一种经典的行为学检测方法，主要用于观察啮齿动物的探索行为和焦虑状态[22]，该研究对帕金森病模型小鼠进行旷场实验，观察到鱼藤酮组小鼠的活动量减少，也就是活动速度和距离均小于正常小鼠，并且垂直站立次数也减少，说明鱼藤酮组小鼠的好奇心减少，对新环境的适应性差，探索行为明显下降；根据活动轨迹图观察到尼古丁+鱼藤酮组中心活动增加，说明尼古丁可改善帕金森病小鼠运动能力和焦虑状态。尼氏染色发现溶剂组小鼠脑切片中存在大量深蓝色的尼氏体，说明神经元形态分布正常，鱼藤酮组小鼠尼氏体减少、解体甚至消失，证明帕金森病小鼠多巴胺能神经元丢失，同样免疫荧光和免疫组化染色观察鱼藤酮组小鼠脑黑质部分酪氨酸羟化酶表达明显减少，证明鱼藤酮诱导损害小鼠多巴胺能神经，尼古丁+鱼藤酮组以及自噬激动剂+鱼藤酮组酪氨酸羟化酶表达明显增多，说明尼古丁治疗能够明显改善神经元损害，并且与自噬激动剂的效果类似。因此，该研究认为尼古丁可能通过激活自噬，改善帕金森病的自噬功能障碍而发挥神经保护作用。众所周知，帕金森病的重要病理改变就是多巴胺能神经元变性，酪氨酸羟化酶是多巴胺合成中的限速酶，酪氨酸羟化酶合成的启动子Bcl-2过表达可以增加小鼠出生后多巴胺能神经元的数量，并保护多巴胺能神经元免受神经毒素诱导的死亡[23]。帕金森病患者脑中Bcl-2水平显著降低，与病程和严重程度呈负相关[24]。与此相反，在帕金森病患者大脑的黑质致密部神经元中观察到促凋亡成员Bax积累[25]，并且在含有路易小体的神经元中检测到Bax的内含物[26]。该研究检测了凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达，得到了与文献报道相似的结果，鱼藤酮会造成黑质中Bax表达增多和Bcl-2表达减少，并且尼古丁治疗可以减少凋亡，可以挽救鱼藤酮的神经毒性，这在动物层面证明了尼古丁的抗凋亡作用。
自噬是真核细胞特有的生物学过程，在进化上高度保守，能够介导细胞内长寿命蛋白以及受损或多余细胞器的降解，是细胞自我保护和代谢途径[27-28]。P62是选择性自噬最重要的受体蛋白，P62能结合泛素化底物蛋白进入自噬小体，因此监测P62蛋白水平可以反映出细胞自噬的水平。帕金森病的病理标志包括黑质多巴胺能神经元的退变以及残存神经元中以α-突触核蛋白为主要成分的路易小体形成[29]。编码α-突触核蛋白的SNCA基因错义突变或修饰会阻遏泛素蛋白酶复合体系统和分子伴侣介导的自噬降解途径，从而导致细胞质内毒性α-突触核蛋白累积[30]，这时自噬能够作为一个补偿途径来降解α-突触核蛋白，从而发挥神经保护作用[31]。该研究检测α-突触核蛋白、P62和Beclin-1水平，发现尼古丁治疗能显著降低α-突触核蛋白的表达，并且自噬功能障碍得到改善；应用自噬激动剂雷帕霉素处理后也能观察到P62、Beclin-1 mRNA和蛋白水平发生同样变化，证明自噬激动剂能够部分抵抗多巴胺能神经损害，说明自噬功能障碍参与了帕金森病的病理过程，并且调控自噬水平能够影响帕金森病的发病。
综上所述，该研究显示尼古丁干预可能通过激活自噬对帕金森病产生神经保护作用，这为进一步研究尼古丁作为有效成分应用于帕金森病的治疗提供了实验和理论基础。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

尼古丁对鱼藤酮诱导帕金森病小鼠模型的神经保护作用机制

Neuroprotective mechanism of nicotine in a mouse model of rotenone-induced Parkinson’s disease

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