Atf7ip是骨形态发生蛋白2促小鼠胚胎成体细胞成骨分化的负调节因子

doi:10.12307/2024.716

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (31): 4931-4936.doi: 10.12307/2024.716

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

Atf7ip是骨形态发生蛋白2促小鼠胚胎成体细胞成骨分化的负调节因子

石现，韩淳青，胡安然，况舒韵，冉依梦，吴郁

江南大学无锡医学院，江苏省无锡市 214122

收稿日期:2023-08-31 接受日期:2023-10-20 出版日期:2024-11-08 发布日期:2024-01-22
通讯作者: 吴郁，博士，教授，江南大学无锡医学院，江苏省无锡市 214122
作者简介:石现，女，1997年生，四川省自贡市人，汉族，江南大学无锡医学院在读硕士，主要从事环境因子致骨质疏松的病理机制及干预研究。
基金资助:

Atf7ip is a negative regulator of bone morphogenetic protein 2 promoting osteogenic differentiation in mouse embryonic adult cells

Shi Xian, Han Chunqing, Hu Anran, Kuang Shuyun, Ran Yimeng, Wu Yu

Wuxi School of Medicine, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu Province, China

Received:2023-08-31 Accepted:2023-10-20 Online:2024-11-08 Published:2024-01-22
Contact: Wu Yu, PhD, Professor, Wuxi School of Medicine, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu Province, China
About author:Shi Xian, Master candidate, Wuxi School of Medicine, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu Province, China

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

激活转录因子7相互作用蛋白(activating transcription factor 7 interacting protein，Atf7ip)：作为组蛋白甲基转移酶SETDB1的辅因子共同调节组蛋白甲基化，通过调控特定转录因子的表达从而调控成骨分化。
成骨分化：骨生成的关键步骤，即骨髓间充质干细胞经历成骨祖细胞、成骨前体细胞、成骨细胞并最终分化为成熟骨细胞的过程，其中涉及到多种信号通路、转录因子、生长因子等的改变。

背景：Atf7ip是否参与成骨分化的调控尚未明确，研究其对成骨分化的影响及具体机制具有重要意义。

目的：探讨Atf7ip对骨形态发生蛋白2促小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)成骨分化的影响。
方法：将体外培养的MC3T3-E1细胞分为正常组、干扰组(NC-siRNA组、Atf7ip-siRNA组)、高表达组(CMV-VC组、CMV-Atf7ip组)，转染处理24 h，然后使用200 ng/mL骨形态发生蛋白2分别处理0，12，24，48 h，qRT-PCR检测各组细胞中Atf7ip、碱性磷酸酶、骨钙素、Ⅰ型胶原α1的mRNA表达水平，Western blot检测成骨分化标记分子Sp7、Runx2的蛋白表达以及Atf7ip结合分子SETDB1、组蛋白H3、H3K9me3甲基化的表达，并进行碱性磷酸酶活性分析。

结果与结论：①随骨形态发生蛋白2处理时间增加，Atf7ip的蛋白及mRNA表达减少，而Sp7、Runx2的蛋白表达和骨钙素、碱性磷酸酶的mRNA表达显著增加(P < 0.05)；Atf7ip结合分子SETDB1的蛋白表达并无明显改变；②与NC-siRNA组比较，Atf7ip-siRNA组Sp7、Runx2的蛋白表达和骨钙素、Ⅰ型胶原α1的mRNA表达显著上调(P < 0.05)，碱性磷酸酶活性明显增强，且H3K9甲基化明显降低(P < 0.05)；③与CMV-VC组比较，CMV-Atf7ip组Sp7、Runx的蛋白表达和骨钙素、碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原α1的mRNA表达显著下调(P < 0.05)，碱性磷酸酶活性显著减弱，而CMV-Atf7ip组的H3K9甲基化蛋白较对照组明显上调(P < 0.05)；④结果表明，Atf7ip在骨形态发生蛋白2诱导MC3T3-E1成骨分化过程中表达降低，敲降Atf7ip后成骨分化显著增强，过表达Atf7ip后成骨分化显著减弱，即Atf7ip是骨形态发生蛋白2促MC3T3-E1细胞成骨分化的负调节因子。

https://orcid.org/0009-0002-4992-3140 (石现)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: MC3T3-E1, Atf7ip, 骨形态发生蛋白2, 成骨分化, H3, H3K9me3

Abstract: BACKGROUND: Whether activating transcription factor 7 interacting protein (Atf7ip) is involved in the regulation in osteogenic differentiation is still controversial, and studying its impact on osteogenic differentiation and its specific mechanisms is of great significance.
OBJECTIVE: To investigate the effect of Atf7ip on bone morphogenetic protein 2 promoting osteogenic differentiation of mouse embryonic osteoblast precursor cells (MC3T3-E1).
METHODS: MC3T3-E1 cells cultured in vitro were divided into three groups: normal group, interference group (NC-siRNA group, Atf7ip-siRNA group), and high expression group (CMV-VC group and CMV-Atf7ip group), and were transfected for 24 hours, and then treated with 200 ng/mL bone morphogenetic protein 2 for 0, 12, 24, and 48 hours, respectively. qRT-PCR was used to detect the mRNA expression levels of Atf7ip, alkaline phosphatase, osteocalcin, type I collagen α1 in the cells of each group. Western blot assay was used to detect the protein expression of osteogenic differentiation markers Sp7 and Runx2, and the expression of Atf7ip binding molecule SETDB1, histone H3 and H3K9me3. Alkaline phosphatase activity was detected by alkaline phosphatase staining.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) With the increase of bone morphogenetic protein 2 treatment time, the protein and mRNA expression of Atf7ip decreased, while the protein expression of Sp7, Runx2 and the mRNA expression of osteocalcin and alkaline phosphatase increased significantly (P < 0.05). There was no significant change in the protein expression of Atf7ip binding molecule SETDB1. (2) Compared with the NC-siRNA group, the protein expression of Sp7, Runx2 and the mRNA expression of osteocalcin and type I collagen α1 were significantly up-regulated (P < 0.05), and alkaline phosphatase activity was significantly enhanced; and H3K9 methylation significantly decreased in the Atf7ip-siRNA group (P < 0.05). (3) Compared with the CMV-VC group, the protein expression of Sp7 and Runx, as well as mRNA expression of osteocalcin, alkaline phosphatase, and type I collagen α1 was significantly downregulated (P < 0.05), and the alkaline phosphatase activity was significantly reduced in the CMV-Atf7ip group, while the H3K9 methylation protein in the CMV-Atf7ip group was significantly upregulated compared to the control group (P < 0.05). (4) In conclusion, Atf7ip expression was decreased during bone morphogenetic protein 2-induced osteogenic differentiation of MC3T3-E1, and osteogenic differentiation was significantly increased after knockdown of Atf7ip. Overexpression of Atf7ip significantly weakened osteogenic differentiation, indicating that Atf7ip is a negative regulatory factor of bone morphogenetic protein 2 promoting osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells.

Key words: MC3T3-E1, Atf7ip, bone morphogenetic protein 2, osteogenic differentiation, H3, H3K9me3

中图分类号:

石现, 韩淳青, 胡安然, 况舒韵, 冉依梦, 吴郁. Atf7ip是骨形态发生蛋白2促小鼠胚胎成体细胞成骨分化的负调节因子[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(31): 4931-4936.

Shi Xian, Han Chunqing, Hu Anran, Kuang Shuyun, Ran Yimeng, Wu Yu. Atf7ip is a negative regulator of bone morphogenetic protein 2 promoting osteogenic differentiation in mouse embryonic adult cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(31): 4931-4936.

图/表（结果） 3

2.1 Atf7ip、Sp7、Runx2在BMP-2诱导MC3T3-E1成骨分化中的表达使用200 ng/mL BMP-2处理MC3T3-E1细胞0，12，24，48 h，免疫印迹检测结果显示，成骨细胞分化相关蛋白Sp7、Runx2的表达水平随处理时间增加而显著增高(P < 0.05)，见图1A。与处理0 h相比，MC3T3-E1细胞在BMP-2处理12，24，48 h后，Atf7ip蛋白表达量均显著降低 (P < 0.01)，且随处理时间增长而逐渐降低，其相互作用分子SETDB1的表达未发生明显变化。qRT-PCR检测结果显示，BMP-2处理后，成骨分化标志物骨钙素和碱性磷酸酶以及Ⅰ型胶原α1的mRNA表达均明显增加(P < 0.05)，见图1B。

2.2 Atf7ip干扰对BMP-2作用下MC3T3-E1细胞成骨分化的影响使用Lipo2000对MC3T3-E1细胞进行转染处理24 h后，提取细胞总蛋白进行蛋白免疫印迹检测。与NC-siRNA组相比，Atf7ip-siRNA组Atf7ip的蛋白表达量显著下调(P < 0.001)，说明Atf7ip干扰模型构建成功，见图2A。200 ng/mL BMP-2分别处理转染组和对照组细胞0，12，24，48 h，蛋白免疫印迹法检测结果显示，与对照组(NC-siRNA或0 h)相比，Atf7ip-siRNA组的H3以及其甲基化分子 H3K9me3表达明显降低，且以H3作为内参，H3K9me3甲基化明显降低；而成骨分化标记分子Runx2、Sp7的蛋白表达量显著增加，见图2B； qRT-PCR检测结果显示，Atf7ip-siRNA组细胞经BMP-2处理后骨钙素、Ⅰ型胶原α1的 mRNA表达进一步升高(P < 0.05)，见图2C。碱性磷酸酶染色结果可以看出在24，48 h Atf7ip-siRNA组染色明显深于对照组，与NC-siRNA组相比，在BMP-2处理0，12，24，48 h时，Atf7ip-siRNA组的碱性磷酸酶活性均增加，见图2D。以上结果表明干扰Atf7ip可促进MC3T3-E1细胞的成骨分化。

2.3 Atf7ip过表达对BMP-2作用下MC3T3-E1细胞成骨分化的影响使用Atf7ip过表达载体(CMV-Atf7ip)和对照(CMV-VC)瞬时转染MC3T3-E1细胞24 h后，提取总蛋白进行蛋白免疫印迹法检测Atf7ip蛋白表达，结果显示，CMV-Atf7ip组的过表达效率明显高于对照组 (P < 0.05)，证明过表达模型构建成功，见图3A。Atf7ip过表达载体瞬时转染MC3T3-E1细胞24 h，经200 ng/mL BMP-2处理0，12，24，48 h后提取总蛋白和总RNA检测组蛋白H3、H3K9me3以及成骨分化标志物Sp7和Runx2的蛋白表达以及骨钙素和Ⅰ型胶原α1的mRNA表达。结果显示，与CMV-VC组相比，CMV-Atf7ip组H3K9me3的蛋白表达以及甲基化显著升高，成骨分化分子Sp7和Runx2的蛋白表达在Atf7ip基因过表达后明显下降，见图3B。qRT-PCR检测结果显示，CMV-Atf7ip组骨钙素、Ⅰ型胶原α1的mRNA表达较对照组显著下降(P < 0.05)，见图3C。碱性磷酸酶染色结果显示，CMV-Atf7ip组碱性磷酸酶阳性细胞明显少于对照组；碱性磷酸酶活性结果显示，与CMV-VC组相比，在BMP-2处理0，12，24，48 h时，CMV-Atf7ip组的碱性磷酸酶活性显著降低，见图3D。以上结果表明Atf7ip过表达抑制了MC3T3-E1细胞的成骨分化，且BMP-2处理并不能逆转其抑制成骨分化的效应。

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引言

随着中国人口老龄化进程的加速，骨质疏松已经成为严重危害中老年人骨骼健康的重大公共卫生疾病[1-2]。骨质疏松主要是由环境和增龄等各种因素诱导的骨形成减少和破骨吸收增加造成[3]。目前，骨质疏松的治疗药物作用机制主要为抑制骨吸收，但此类型药物存在着不可忽视的局限性和不良反应，且无法有效地改善骨骼完整性，需要辅以促骨形成药物[4]。因此深入探索成骨细胞分化的调控机制对研究骨质疏松防治新方法及探索新靶点具有非常重要的意义。
多种研究表明成骨细胞分化是一个受到多种关键转录因子如Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2，Runx2)、Sp7/Osterix、激活转录因子4(activating transcription factor 4， ATF4)及其靶基因严格调控的过程[5-6]。越来越多的证据表明，组蛋白修饰(甲基化、乙酰化、泛素化和ADP核糖基化)失调和相关的酶功能受损都可直接影响成骨关键转录因子的调控[7-8]。
激活转录因子7相互作用蛋白(activating transcription factor 7 interacting protein，Atf7ip)也称为 MCAF1或mAM，是一种通过促进组蛋白3(Histone 3，H3)第9位氨基酸三甲基化(H3K9me3)形成而参与基因抑制的表观遗传调节因子[9]，是SET 结构域分叉组蛋白赖氨酸甲基转移酶 1(SET domain bifurcated histone lysine methyltransferase 1，SETDB1)的辅因子[10]。SETDB1被证实可以通过调节Runx2活性以及Sp7表达调控成骨细胞分化，还可通过调节H3K9甲基化抑制过氧化物酶体增殖物激活受体γ的转录激活，从而抑制间充质干细胞向脂肪细胞分化并促进其向成骨细胞分化[11-13]。在目前的研究中，Atf7ip作为SETDB1的辅助因子，已被证实可参与甲状旁腺激素(parathyoid hormone，PTH)对成骨分化的调节[14]，但其是否参与其他骨形成因子的成骨分化作用以及Atf7ip介导的组蛋白甲基化调节机制在成骨分化中的作用，目前还未经证实。

该研究以组蛋白甲基化为切入点，拟通过控制骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein，BMP-2)作用下成骨分化过程中Atf7ip的表达水平，探讨Atf7ip在BMP-2促MC3T3-E1细胞成骨分化过程中的作用。

材料方法

1.1 设计体外细胞实验，实验结果的组间差异比较采用单因素方差分析，两两比较使用LSD-t 检验。
1.2 时间及地点实验于2022年1月至2023年5月在江南大学无锡医学院现代环境毒理学实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验细胞成骨细胞前体细胞MC3T3-E1购于上海中国科学院细胞库。
1.3.2 实验试剂 Atf7ip小干扰RNA(Atf7ip-siRNA)及其对照(NC-siRNA)(Dharmacon，美国)；过表达ATF7ip质粒(CMV-Atf7ip)及其对照(CMV-VC)(吉凯基因，中国)；α-MEM培养基、BMP-2(赛默飞，美国)；胎牛血清(天杭生物科技，浙江)；Trizol试剂、TRACP & ALP双染试剂盒、TRACP & ALP 活性检测试剂盒(TaKaRa，日本)；青霉素-链霉素溶液、RIPA裂解液、Western blot一抗稀释液(碧云天生物，上海)；PCR引物(上海生工生物)；PrimeScript RT Master Mix试剂盒、SYBR Premix Ex Taq Mix试剂盒(诺唯赞生物科技，中国)；5×蛋白上样缓冲液(索莱宝，中国)；HRP标记羊抗小鼠IgG抗体、HRP标记羊抗兔IgG抗体(Jackson免疫研究实验室，美国)；Atf7ip抗体(Santa Cruz，美国)；β-actin抗体、H3K9me3抗体(Abcam，美国)；Runx2抗体、Sp7抗体、SETDB1抗体、H3抗体(Proteintech，中国)。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞培养复苏MC3T3-E1细胞，接种于10 cm平皿中，内含体积分数10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的α-MEM培养基，将其置于37 ℃的CO2恒温培养箱中生长，24 h后换液，待细胞长至融合80%左右时，加入1.5 mL胰酶消化2 min，消化完成后1∶1加入α-MEM完全培养基中和，吹打转入15 mL离心管，1 000× g离心5 min，按1∶2的比例传代2次后进行后续实验。
1.4.2 siRNA干扰采用siRNA瞬时转染的方式对Atf7ip基因的表达进行干扰。将处于对数生长期的第4代MC3T3-E1细胞按8×104/孔接种于12孔板，过夜增殖至融合度约70%后移除完全培养基，1×PBS洗涤细胞2次。将40 pmol Atf7ip-siRNA或NC-siRNA、3 μL Lipofectamine 2000、100 μL α-MEM基础培养基混合后吹打均匀，静置5 min后分别加入Atf7ip-siRNA组或NC-siRNA组，轻摇混合均匀后，置于培养箱中继续培养24 h后换液，更换为含200 ng/mL BMP-2的α-MEM完全培养基，每组3个复孔，培养0，12，24，48 h后按实验方案进行收样检测。
1.4.3 过表达Atf7ip 使用Lipofectamine 2000转染试剂在第4代MC3T3-E1细胞中瞬时转染入 Atf7ip(CMV-Atf7ip，200 ng/µL)和空载体(CMV-VC，200 ng/µL)质粒(CMV-Atf7ip组和CMV-VC组)，24 h后使用1×PBS清洗后换液，更换为含200 ng/mL BMP-2的α-MEM完全培养基，每组3个复孔，培养0，12，24，48 h后按实验方案进行收样检测。

1.4.4 实时荧光定量PCR(qRT-PCR) 在上述干预后的MC3T3-E1细胞中加入250 μL/孔 Trizol试剂提取细胞RNA，提纯后测定浓度，进行反转录以及PCR扩增。反转录条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃ 15 s；退火温度60 ℃ 1 min，持续40个循环；设置熔解曲线温度95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min。标准化内参基因为β-actin，各引物序列信息见表1。各基因组的表达情况采用ΔΔCT法进行相对定量分析。

1.4.5 蛋白免疫印迹法检测相关蛋白表达在上述干预后的MC3T3-E1细胞中加入150 μL/孔 RIPA试剂提取细胞总蛋白，BCA法测定总蛋白浓度，加入5×蛋白上样缓冲液后金属浴100 ℃煮5 min，凝胶垂直电泳分离蛋白，300 V恒压转膜120 min，5%脱脂奶粉室温封闭1 h；用一抗稀释液按比例稀释Atf7ip(1∶200)、Sp7(1∶1 000)、Runx2(1∶1 000)、SETDB1(1∶1 000)、H3(1∶1 000)、H3K9(1∶1 000)、β-actin (1∶10 000)抗体，4 ℃下摇晃孵育过夜，1×TBST洗膜，采用1∶10 000比例用5%脱脂奶粉稀释辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠或抗兔二抗室温孵育1 h，ECL发光法观察蛋白表达。使用Image J计算蛋白灰度值。
1.4.6 碱性磷酸酶染色收集上述干预后的MC3T3-E1细胞，使用TRAP碱性磷酸酶双染试剂盒进行染色，完成后显微镜下拍照。
1.4.7 碱性磷酸酶活性检测收集上述干预后的MC3T3-E1细胞，使用TRAP碱性磷酸酶活性检测试剂盒按说明进行检测。
1.5 主要观察指标 ①蛋白免疫印迹法检测Atf7ip、Sp7、Runx2、SETDB1、H3、H3K9蛋白表达；②实时荧光定量PCR检测碱性磷酸酶、骨钙素、Ⅰ型胶原 α1的mRNA表达；③碱性磷酸酶染色分析和碱性磷酸酶活性检测。
1.6 统计学分析数据处理及分析使用软件GraphPad Prism 9.3.0；实验数据均以x±s表示。数据资料符合正态分布(S-W检验)，用单因素方差分析进行组间比较，LSD-t 检验进行两两比较，P < 0.05 为差异有显著性意义。该研究统计学方法已经通过江南大学无锡医学院医学统计学专家审核。

讨论

骨质疏松主要的病理特征为全身代谢性的骨丢失和骨微结构退化，造成骨量和骨强度下降、骨脆性增加，并易发骨折[15]。导致骨质疏松的重要原因是骨重建过程中的骨形成和骨吸收之间失衡，成骨分化异常所导致的骨形成下降是骨质疏松发生的核心[16]。
此次研究使用成骨分化诱导剂BMP-2处理MC3T3-E1细胞作为成骨细胞分化模型。MC3T3-E1细胞具有向成骨细胞和骨细胞分化的能力，为体外成骨分化研究提供了良好的模型[17]。在此模型中，BMP-2处理增加了成骨分化过程中的主要转录因子Runx2和Sp7的蛋白表达，以及成骨标志物骨钙素和碱性磷酸酶的mRNA表达，与以往的研究结果一致[18]，表明模型构建成功。利用此模型，该研究进一步探讨了Atf7ip对成骨细胞分化的影响。HU等[14]研究中Atf7ip在甲状旁腺激素以及β-磷酸甘油和抗坏血酸作用下表达上调，但作者这项研究创新性地发现Atf7ip的mRNA表达在BMP-2诱导成骨分化过程中降低，提示Atf7ip在BMP-2促MC3T3-E1细胞成骨分化中可能起负调节作用。实验进一步通过使用Atf7ip小干扰RNA或过表达载体验证Atf7ip在成骨分化中的作用，结果显示，Atf7ip-siRNA组Runx2和Sp7的蛋白水平、骨钙素和Ⅰ型胶原α1的mRNA水平升高，碱性磷酸酶染色结果表明碱性磷酸酶的表达也显著增加。这表明Atf7ip的敲降会显著增加BMP-2诱导的成骨分化，而在成骨细胞MC3T3-E1中过表达Atf7ip则会抑制成骨分化。以上结果证实Atf7ip是成骨细胞分化的负调控因子。
研究显示，Atf7ip通过增加SETDB1的核定位，促进H3K9me3修饰，降低Sp7的表达，进而抑制甲状旁腺激素作用下的MC3T3-E1细胞成骨分化[19]。该研究中，虽然Atf7ip并不影响SETDB1表达，但BMP-2作用下Atf7ip-siRNA组H3K9me3标记的形成较对照组明显减少，Runx2、Sp7的表达显著增加；而CMV-Atf7ip组H3K9me3标记的形成较CMV-VC组显著增加，同时Runx2、Sp7的表达显著下降。以上结果提示Atf7ip-SETDB1-H3K9me3-Runx2/Sp7调控轴在BMP-2促成骨分化中的关键作用。但由于H3K9me3修饰可能影响众多基因表达，当前证据并不能排除是否有其他因素参与Atf7ip对成骨分化因子的调控，后续研究中仍需获得依赖于染色质免疫共沉淀等技术以证明Atf7ip经由H3K9me3修饰调节Runx2和Sp7的表达。
该研究利用细胞模型初步明确了Atf7ip对BMP-2促成骨分化的作用，后续研究应结合体内Atf7ip基因特异性剔除小鼠模型进一步揭示其功能和作用。另外，在对成骨分化的研究中，除了对BMP等基本信号通路的研究，还有如Notch、Hedgehog以及Wnt/β-catenin等通路在骨髓间充质干细胞成骨分化中起关键作用[20-23]。Atf7ip是否参与相关信号通路对成骨细胞分化的调节值得进一步研究。尽管如此，目前对骨质疏松与组蛋白修饰之间的关系研究数量甚少，仍然不清楚组蛋白修饰是骨质疏松的主要原因还是次要原因，并且不能排除是否有其他因素参与Atf7ip对成骨分化因子的调控。另外，该研究只在体外使用了MC3T3-E1一类细胞系模型，未验证Atf7ip在其他类型细胞和体内模型中的作用，具有一定的局限性，后续研究可在骨髓间充质干细胞或其他类型细胞中进一步验证其作用，以及考虑使用动物模型和工具鼠增加其体内研究证据。
有趣的是，目前越来越多的研究开始探索能选择性抑制SETDB1-Atf7ip结合的小分子化合物。Atf7ip通过SETDB1氨基端的Tudor结构域与Setdb1结合(PMID: 31576654)。研究发现通过靶向SETDB1特定的结合域调节H3K9甲基化从而调控异染色质缩合[24]；GUO等[25]研究靶向抑制SETDB1结合域的化合物(R,R)-59可完全阻止其与组蛋白H3结合。基于以上研究结果，推测是否可通过与抑制SETDB1-Atf7ip结合的化合物联合使用以加强促成骨药物的促进作用，或者降低成骨促进药物的使用浓度或剂量而达到同等的成骨效果，为治疗骨质疏松提供新方法。
综上所述，该研究证实了Atf7ip在BMP-2诱导的MC3T3-E1细胞成骨分化中起抑制作用，其作用机制可能与Atf7ip调节SETDB1-H3K9me3-Runx2/Sp7调控轴有关。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Atf7ip是骨形态发生蛋白2促小鼠胚胎成体细胞成骨分化的负调节因子

Atf7ip is a negative regulator of bone morphogenetic protein 2 promoting osteogenic differentiation in mouse embryonic adult cells

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