过表达长链非编码RNA Gm16104影响C3H10T1/2间充质干细胞的成骨分化

doi:10.12307/2024.710

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (31): 4964-4969.doi: 10.12307/2024.710

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过表达长链非编码RNA Gm16104影响C3H10T1/2间充质干细胞的成骨分化

林展莹，林紫云，黄柳艳，张文烯，左长清

广东医科大学药学院，广东省东莞市 523808

收稿日期:2023-08-30 接受日期:2023-09-22 出版日期:2024-11-08 发布日期:2024-01-22
通讯作者: 左长清，副教授，广东医科大学药学院，广东省东莞市 523808
作者简介:林展莹，女，1998年生，广东省云浮市人，汉族，广东医科大学在读硕士，主要从事干细胞多向分化调控研究。
基金资助:
省级大学生创新创业训练项目(S202210571052)，项目负责人：林紫云；广东省自然科学基金面上项目(2017A030313641，2018A0303130203)，项目负责人：左长清

Overexpression of long non-coding RNA Gm16104 affects osteogenic differentiation of C3H10T1/2 mesenchymal stem cells

Lin Zhanying, Lin Ziyun, Huang Liuyan, Zhang Wenxi, Zuo Changqing

School of Pharmacy, Guangdong Medical University, Dongguan 523808, Guangdong Province, China

Received:2023-08-30 Accepted:2023-09-22 Online:2024-11-08 Published:2024-01-22
Contact: Zuo Changqing, Associate professor, School of Pharmacy, Guangdong Medical University, Dongguan 523808, Guangdong Province, China
About author:Lin Zhanying, Master candidate, School of Pharmacy, Guangdong Medical University, Dongguan 523808, Guangdong Province, China
Supported by:
Provincial Innovation Training Program for College Students, No. S202210571052 (to LZY); Guangdong Provincial Natural Science Foundation (General Program), No. 2017A030313641, No. 2018A0303130203 (to ZCQ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA) Gm16104：Gm16104位于小鼠10号染色体qC1和qC2区之间，其包含2个外显子，转录本长度为401 bp，目前关于Gm16104的功能尚未见文献报道。
骨形态发生蛋白2：作为转化生长因子β超家族的一员，骨形态发生蛋白2是一种含有396个氨基酸的多肽分子。骨形态发生蛋白2能促进间充质干细胞分化为成骨细胞和软骨细胞，是体内一种重要的成骨诱导因子。

背景：间充质干细胞的成骨分化过程受多种分子调控，长链非编码RNA因可参与调控多种生物学过程而备受关注，但其对间充质干细胞成骨分化的调控作用尚未得到充分探索。

目的：探讨长链非编码RNA Gm16104对C3H10T1/2间充质干细胞成骨分化的影响。
方法：采用骨形态发生蛋白2诱导C3H10T1/2间充质干细胞成骨分化，成骨诱导5 d进行碱性磷酸酶染色检测细胞成骨分化情况，成骨分化第0，1，3，5天，采用qRT-PCR检测Alpl和Gm16104的表达水平。转染Gm16104过表达质粒然后诱导成骨分化，成骨诱导4 d进行碱性磷酸酶染色和qRT-PCR检测细胞的成骨分化状况，Western blot检测成骨相关信号通路蛋白的表达水平。

结果与结论：①成骨诱导5 d后，碱性磷酸酶活性显著提高；②与第0天比较，成骨诱导第1，3，5天，成骨标志基因Alpl表达升高，而Gm16104的表达水平下调；③pcDNA-Gm16104质粒转染C3H10T1/2细胞后Gm16104表达水平显著增加；④过表达Gm16104可抑制细胞的碱性磷酸酶活性以及成骨标志基因Alpl和成骨相关转录因子Osterix的表达水平；⑤过表达Gm16104显著抑制PI3K和Akt的磷酸化蛋白表达水平；⑥结果表明，过表达Gm16104可能通过PI3K/Akt信号通路抑制C3H10T1/2间充质干细胞成骨分化。

https://orcid.org/0009-0004-0075-0634 (林展莹)；https://orcid.org/0000-0002-0536-5733 (左长清)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 长链非编码RNA, 间充质干细胞, Gm16104, 骨形态发生蛋白2, 成骨分化, PI3K, Akt

Abstract: BACKGROUND: The osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells is regulated by a variety of molecules. Long non-coding RNA (lncRNA) has attracted much attention because they can participate in regulating a variety of biological processes, but the regulatory role of lncRNA on osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells has not been fully explored.
OBJECTIVE: To explore the effect of lncRNA Gm16104 on osteogenic differentiation of C3H10T1/2 mesenchymal stem cells.
METHODS: The C3H10T1/2 mesenchymal stem cells were induced into osteogenic differentiation by bone morphogenetic protein-2. Alkaline phosphatase staining was performed to identify the osteogenic differentiation of the cells 5 days after osteogenic induction. Expression levels of alkaline phosphatase and lncRNA Gm16104 were detected by qRT-PCR after 0, 1, 3, and 5 days of osteogenic differentiation. After transfection of the overexpression plasmid of pcDNA-Gm16104, the osteogenic differentiation was identified by alkaline phosphatase staining and qRT-PCR 4 days after osteogenic induction. The expression levels of osteogenesis-related signalling pathway proteins were detected by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) After 5 days of osteogenic induction, alkaline phosphatase activity was significantly increased. (2) Compared with 0 days, expression levels of the osteogenic marker gene alkaline phosphatase increased and expression levels of Gm16104 decreased after 1, 3, and 5 days of osteogenic induction. (3) Transfection of C3H10T1/2 cells with pcDNA-Gm16104 plasmid significantly increased the expression level of Gm16104. (4) Overexpression of Gm16104 inhibited alkaline phosphatase activity, the expression levels of the osteogenic marker gene alkaline phosphatase and the osteogenesis-related transcription factor Osterix. (5) Overexpression of Gm16104 inhibited phosphorylated protein expression of PI3K and Akt. (6) The above results suggest that overexpression of Gm16104 may inhibit osteogenic differentiation of C3H10T1/2 mesenchymal stem cells through the PI3K/Akt signaling pathway.

Key words: long non-coding RNA, mesenchymal stem cell, Gm16104, bone morphogenetic protein-2, osteogenic differentiation, PI3K, Akt

中图分类号:

林展莹, 林紫云, 黄柳艳, 张文烯, 左长清 . 过表达长链非编码RNA Gm16104影响C3H10T1/2间充质干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(31): 4964-4969.

Lin Zhanying, Lin Ziyun, Huang Liuyan, Zhang Wenxi, Zuo Changqing. Overexpression of long non-coding RNA Gm16104 affects osteogenic differentiation of C3H10T1/2 mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(31): 4964-4969.

图/表（结果） 6

2.1 BMP-2可诱导C3H10T1/2间充质干细胞成骨分化碱性磷酸酶在矿化组织细胞中高度表达，在骨的钙化过程起关键作用，是成骨细胞的表型标志物之一，根据碱性磷酸酶活性可判断细胞成骨分化程度[18-19]。该研究采用100 ng/mL BMP-2诱导细胞成骨分化，诱导5 d后进行碱性磷酸酶染色，结果显示：与对照组比较，诱导组80%以上细胞染色阳性呈紫蓝色，见图2A。提取成骨诱导第0，1，3，5天的细胞总RNA用于进行反转录反应，采用qRT-PCR检测成骨标志基因Alpl的表达水平，结果显示：在成骨分化过程中，Alpl的表达水平升高，见图2B，以上结果表明BMP-2可成功诱导C3H10T1/2细胞成骨分化。

2.2 qRT-PCR鉴定Gm16104在成骨分化过程中的时序表达在NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上查询Gm16104的基因信息，见图3A。使用Coding Potential Calculator 2 (http://cpc2.gao-lab.org/)分析Gm16104的编码潜能，结果显示Gm16104不具有编码潜能，见图3B。前期通过lncRNA芯片筛选发现Gm16104在成骨分化过程中差异表达，进一步通过qRT-PCR检测Gm16104在成骨分化中时序表达。结果显示Gm16104在细胞成骨分化中表达水平逐渐降低，见图3C，表明Gm16104的表达在成骨分化中受到抑制。

2.3 pcDNA-Gm16104质粒显著增加Gm16104的表达水平质粒转染48 h后，采用qRT-PCR检测Gm16104的过表达效率，结果显示，与对照组比较，pcDNA-Gm16104组的Gm16104表达水平可升高约500倍，见图4，表明过表达Gm16104质粒构建成功。

2.4 过表达Gm16104对C3H10T1/2细胞成骨分化的影响质粒转染12 h后，加入成骨诱导液诱导细胞分化，成骨分化4 d进行碱性磷酸酶染色，采用qRT-PCR检测成骨分化相关标志基因的表达水平。碱性磷酸酶染色结果显示，与pcDNA3.1对照组相比，pcDNA-Gm16104过表达组碱性磷酸酶染色阳性细胞显著减少，见图5A。qRT-PCR结果显示，过表达Gm16104可导致成骨标志基因Alpl表达水平降低，见图5B，表明过表达Gm16104可抑制C3H10T1/2细胞成骨分化。

2.5 过表达Gm16104可抑制成骨相关转录因子的表达成骨细胞的分化过程受到各种转录因子的调控，其中Osterix，也称SP7，被认为是成骨细胞分化和骨矿化的重要转录因子。为了进一步研究Gm16104在细胞成骨分化过程中的分子机制，检测过表达Gm16104后成骨分化4 d成骨相关转录因子的表达，结果显示：与pcDNA3.1对照组比较，pcDNA-Gm16104过表达组Osterix表达水平显著降低，Runx2表达水平无统计学差异，见图6，提示Gm16104可通过调控转录因子Osterix来影响细胞的成骨分化过程。

2.6 过表达Gm16104可通PI3K/Akt通路影响C3H10T1/2细胞成骨分化成骨分化过程受多种信号通路调控，PI3K/Akt信号通路已被证明可正向调控成骨分化过程，为了进一步探索Gm16104是否通过调控PI3K/Akt信号通路来调控C3H10T1/2细胞成骨分化过程，成骨分化2 d采用Western blot检测过表达Gm16104后PI3K、Akt、p-PI3K和p-Akt的表达水平，见图7，过表达Gm16104可明显抑制PI3K和Akt的磷酸化蛋白水平，提示Gm16104可能通过PI3K/Akt信号通路调控C3H10T1/2细胞成骨分化过程。

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引言

近年来，干细胞用于骨相关疾病的治疗得到越来越多的关注，推动了骨疾病治疗的细胞疗法发展[1]。先前已有研究报道移植自体骨髓用于治疗萎缩性胫骨干骨不连是一种有效且低风险的治疗方法[2]。来源于中胚层并普遍存在于多种组织的间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一类具有强大自我更新能力和多向分化潜能的细胞，在体外经过多次传代和冻存仍可保持其干细胞特性[3-4]，如何控制间充质干细胞的分化命运对推动间充质干细胞用于临床治疗十分重要。
骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)是一种成骨诱导因子，未分化的间充质干细胞在BMP-2的作用下，可分化为软骨细胞和成骨细胞[5]，临床上BMP-2已被批准用于开放性骨折、骨不连的治疗[5-7]。虽然BMP-2治疗相关骨疾病得到了广泛应用，但BMP-2诱导间充质干细胞的成骨分化过程尚未得到充分研究。
随着人类基因组计划的开展，研究表明在人体中大约有80%的基因组能被转录生成RNA，但只有2%的基因组能够被翻译为蛋白质，大部分转录组由非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)组成[8]，其中长度超过200个碱基、由RNA聚合酶Ⅱ转录产生、位于细胞核或细胞质、缺乏完整的功能开放阅读框的非编码RNA分子称为长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)[9-10]。近年来有研究发现lncRNA可在表观遗传调控、转录调控和转录后调控等多层面调控基因的表达[11]，且lncRNA的表达异常与肿瘤、心血管疾病等密切相关[12-14]。此外，有少量研究表明lncRNA与干细胞的分化命运息息相关。WANG等[15]报道lnc-OAD可通过AKT/Osterix轴来促进BMP-2诱导的间充质干细胞成骨分化进程；CHEN等[16]报道过表达lnc HOTAIRM1可促进颅骨缺损大鼠骨再生。通过基因芯片或高通量筛选等技术发现在干细胞成骨分化过程中存在大量差异性表达的lncRNAs，虽然已有部分lncRNAs被鉴定为可促进或抑制干细胞成骨分化进程，但有大量lncRNAs的功能仍未被鉴定，lncRNAs调控干细胞成骨分化的机制尚未明确。
前期课题组报道BMP-2可诱导C3H10T1/2间充质干细胞成骨分化，基因芯片分析发现众多差异表达的lncRNAs分子，其中包含Gm16104[17]。但目前关于 Gm16104的研究尚未见文献报道。该研究首次报道了Gm16104对小鼠间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化过程的调控作用，为lncRNA参与间充质干细胞成骨分化过程的作用提供新的见解。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞观察实验。
1.2 时间及地点实验于2021年10月至2023年8月在广东医科大学完成。
1.3 材料
1.3.1 实验细胞 C3H10T1/2间充质干细胞购自中国科学院上海干细胞库。
1.3.2 主要试剂胎牛血清、0.25%胰酶(Hyclone，美国)；MEM培养基(Gibco，美国)；rhBMP-2(proteintech，美国)；Lipofectamine 3000、OptiMEM培养(Thermo，美国)；pcDNA3.1质粒、pcDNA-Gm16104质粒、qRT-PCR引物(上海生工生物工程股份有限公司)；RNA裂解液、PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒、SYBR@Premix Ex TapTM Ⅱ试剂盒(TAKARA，日本)；PMSF、RIPA裂解液、QuickBlockTM封闭液、β-actin抗体(碧云天生物技术有限公司)；Protease Inhibitor Cocktail、mini-Tablet、Phosphatase Inhibitor Cocktail Ⅰ、Phosphatase Inhibitor Cocktail Ⅱ(MCE，美国)；p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt抗体(Abcam，英国)。
1.3.3 主要仪器 CO2细胞培养箱(Thermo，美国)；超净工作台(苏州佳宝净化工程设备有限公司)；可调式微量移液器、低温离心机(Eppendorf，德国)；倒置相差显微镜(日本尼康株式会社)；核酸蛋白定量检测仪(上海托赫机电科技有限公司)；LightCycler96 荧光定量PCR仪(上海罗氏诊断产品有限公司)；电泳仪、转膜仪(Bio-Rad，美国)；FCM成像系统(上海普诺森生物科技有限公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 C3H10T1/2间充质干细胞培养及成骨诱导分化
(1)细胞培养：C3H10T1/2间充质干细胞用完全培养基(体积分数10%胎牛血清+87%MEM培养基+1% L-谷氨酰胺+1% NEAA+1%丙酮酸钠)培养，每3 d更换1次完全培养基，待细胞汇合度达85%左右进行传代。
(2)成骨诱导分化：将第15-20代C3H10T1/2细胞接种于12孔或24孔细胞培养板，接种2 d后细胞汇合度达90%左右，将培养基更换为成骨诱导液(含100 ng/mL BMP-2的完全培养基)，每2 d更换1次成骨诱导液，成骨诱导5 d进行碱性磷酸酶染色。成骨诱导第0，1，3，5天，采用qRT-PCR检测成骨标志基因Alpl的表达水平以及Gm16104的表达水平。

1.4.2 pcDNA-Gm16104质粒构建 pcDNA3.1对照质粒和pcDNA-Gm16104质粒委托上海生工生物工程股份有限公司构建，测序结果见图1，测序结果与NCBI网站上lncRNA Gm16104的序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NR_152732.1)完全一致，质粒构建成功。

1.4.3 细胞转染根据Thermo公司的Lipofectamine 3000说明书进行细胞转染。C3H10T1/2间充质干细胞按1.8×104/cm2的密度接种于细胞培养板，待其汇合度达70%-80%时开始进行质粒转染。12孔板每孔加100 μL转染液，24孔板每孔加50 μL转染液。以12孔板为例：向50 μL OptiMEM培养基中加入1 μg质粒和2 μL转染促进剂P3000，混匀制作成A液；取3 μL Lipofectamine 3000加入50 μL OptiMEM培养基混匀制作成B液，静置5 min后将A液和B液混匀，再静置15 min后将混合液加至培养板，转染48 h后采用qRT-PCR检测Gm16104的过表达效率。质粒转染12 h后更换为成骨诱导液(含100 ng/mL BMP-2的完全培养基)，成骨诱导4 d后进行碱性磷酸酶染色，提取细胞总RNA采用qRT-PCR检测Osterix、Runx2 mRNA的表达水平，成骨诱导2 d后提取细胞总蛋白采用蛋白免疫印迹实验检测PI3K、Akt、p-PI3K和p-Akt蛋白的表达水平。
1.4.4 碱性磷酸酶染色弃掉培养基，PBS洗涤细胞2次，体积分数70%乙醇室温固定20 min，弃去固定液，PBS洗涤细胞2次，按照碱性磷酸酶染色试剂盒操作，室温避光染色15 min，弃去染色液，PBS洗涤细胞2次，将培养板置于显微镜下观察并拍照记录。
1.4.5 RNA提取和qRT-PCR 弃去培养基，加入RNA裂解液，按照说明书提取细胞总RNA，用NanoDrop® ND-1000检测RNA的浓度及纯度，然后用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒制备cDNA，置于-20 ℃保存。按照SYBR@Premix Ex TapTM Ⅱ试剂盒说明配制反应液进行qRT-PCR，反应体系为10 μL。qRT-PCR采用的引物为上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列见表1。

1.4.6 蛋白免疫印迹实验向含有Protease Inhibitor Cocktail mini-Tablet的RIPA裂解液加入1% Phosphatase Inhibitor Cocktail Ⅰ、Phosphatase Inhibitor Cocktail Ⅱ、PMSF，吹打裂解细胞，置于冰上裂解30 min，然后离心15 min(4 ℃，12 000 r/min)，收集上清液，按照比例加入蛋白上样缓冲液混匀，95 ℃水浴变性，等量的蛋白用10% SDS-PAGE分离，转移到0.22 μm的PVDF膜上；用QuickBlock™封闭液封闭30 min；用特异性一抗在4 ℃环境孵育过夜。一抗如下：p-PI3K(1∶500)、PI3K(1∶1 000)、p-Akt(1∶5 000)、Akt(1∶5 000)和β-actin (1∶1 000)。TBST洗膜3次，每次10 min，二抗室温孵育90 min；TBST洗膜3次，每次10 min，最后加入适量的显影液，采用FCM成像系统化学发光显影。
1.5 主要观察指标 ①碱性磷酸酶活性；②qRT-PCR检测Alpl、Osterix、Runx2、Gm16104的mRNA表达水平；③Western blot检测成骨分化信号通路p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt蛋白表达水平。
1.6 统计学分析应用Image J对蛋白免疫印迹实验的条带进行灰度值分析。应用GraphPad Prism 8软件处理实验数据，计量资料以x±s表示，两组间均数差异比较采用两样本t检验，多组间均数差异采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，以P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过广东医科大学生物统计学专家审核。

讨论

骨质疏松、骨坏死等骨疾病的治疗目前仍然是临床上一大挑战，而成骨细胞的形成是骨再生和骨形成的关键一步[20]，因此研究间充质干细胞成骨分化的机制对骨组织工程具有重要意义。间充质干细胞具有自我更新能力和多向分化潜能的特点，被广泛应用于骨质疏松症等骨相关疾病的治疗[21-22]。
间充质干细胞的成骨分化过程是一个多步骤、多因素调控的生物学过程，随着人类基因组计划的开展和哺乳类转录组数据的不断完善，越来越多的研究证明lncRNA可折叠成复杂的结构，在各种细胞生物学过程和疾病发病机制中起关键调控作用[23-25]。近年来，不断有研究报道lncRNA可参与调控细胞的成骨分化过程。如lnc-PPP2R1B可介导PPP2R1B基因的剪接从而促进间充质干细胞的成骨分化[26]。沉默lnc MIR181A1HG可影响其与染色质结合，从而下调成骨抑制转录因子SOX5及下游靶标的表达，促进间充质干细胞成骨分化[27]。LINC01119可靶向与卷曲类受体4(FZD4)结合，通过Wnt信号通路负调控间充质干细胞的成骨分化过程[28]。为了进一步明确lncRNA在间充质干细胞成骨分化过程中的调控作用，前期课题组采用基因芯片筛选C3H10T1/2细胞成骨分化过程中差异表达的lncRNA，发现Gm16104在成骨分化过程中表达下调，然而，目前关于Gm16104的研究尚未见文献报道，其在间充质干细胞成骨分化中的生物学功能有待进一步探索。
Gm16104是小鼠非编码基因(基因ID：102634174)。通过实验建立成骨分化细胞模型，qRT-PCR鉴定Gm16104在成骨分化的时序性表达，结果表明，随着成骨诱导时间增加，Gm16104的表达水平逐渐下降，与芯片结果一致。为了进一步研究Gm16104在成骨分化中的作用，采取功能获得实验，构建并转染过表达Gm16104质粒后诱导细胞成骨分化，碱性磷酸酶染色结果表明过表达Gm16104可显著抑制C3H10T1/2细胞成骨分化，成骨标志基因Alpl表达显著降低，以上表明Gm16104可能调控细胞的成骨分化过程。
属于SP/KLF家族的Osterix是含锌指结构的成骨分化特异性转录因子，研究表明Osterix缺失小鼠在膜内成骨和软骨内成骨2种成骨方式中皆无法形成皮质骨和骨小梁[29]。此外，Osterix可通过调控不同基因的表达来影响成骨分化过程和骨细胞的功能，如在正常骨细胞高表达的Dmp1和Phex基因在Osterix缺失小鼠体内表达水平明显降低，且小鼠骨骼结构明显被破坏，成骨细胞标志物表达受阻[30]；向C2C12细胞和C3H10T1/2细胞转染Osterix载体可诱导骨钙素表达[29]。
有研究报道Osterix缺失小鼠和Runx2缺失小鼠的骨表型不同，提示Osterix和Runx2可单独调控骨形成[31]。HE等[32]报道敲低或过表达lncRNA ODIR1可通过改变Osterix启动子上组蛋白的修饰来调控Osterix的表达水平，进而调控下游成骨标志基因的表达，却不改变Runx2的表达水平，提示lncRNA可通过Runx2非依赖性途径调节Osterix的表达水平。在该研究中，过表达Gm16104可显著抑制Osterix的表达水平，而Runx2的表达水平无显著改变，提示Gm16104可调控Osterix的表达从而调控细胞成骨分化。
已有相关研究报道Wnt信号通路[33]、TGF-β1/Smad信号通路[34]、MAPK信号通路[35]、PI3K/Akt信号通路等可调控成骨分化过程[36]，但Gm16104对成骨分化的调控机制尚未明确，因此研究Gm16104通过哪条信号通路来调控成骨分化十分重要。PI3K本身具有丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)激酶的活性，根据结构可将其分为3类(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)，其中Ⅰ类PI3K研究最为广泛，为1个调节亚基(p85)和1个催化亚基(p110)组成的异源二聚体，蛋白激酶B(Akt)是PI3K信号通路下游的关键靶点[37]。当细胞受到刺激后激活PI3K，活化的PI3K可将磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP2)转化生成3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)，PIP3与Akt结合，在3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDK1)和3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶2(PDK2)辅助下，使Akt蛋白上的Ser和Thr磷酸化位点发生磷酸化，生成活性Akt，活性Akt转移到各细胞器使底物发生磷酸化，从而调控细胞增殖、分化、代谢等生物学过程[38-39]。此外，已有相关文献报道PI3K/Akt信号通路是调控成骨分化的关键通路[40-41]。该研究为了验证PI3K/Akt信号通路是否参与了Gm16104调控间充质干细胞的成骨分化过程，在过表达Gm16104后诱导成骨分化2 d提取细胞总蛋白，结果显示过表达Gm16104可抑制PI3K和Akt的磷酸化水平，表明Gm16104可通过抑制PI3K/Akt信号通路的激活来调控间充质干细胞的成骨分化过程。
综上所述，该研究首次揭示了过表达lncRNA Gm16104可通过PI3K/Akt信号通路抑制成骨分化特异性转录因子Osterix的表达，从而调控间充质干细胞成骨分化。但Gm16104对间充质干细胞成骨分化的具体调控机制仍需进一步完善，Gm16104体内对成骨的调控作用仍需进一步探索。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

过表达长链非编码RNA Gm16104影响C3H10T1/2间充质干细胞的成骨分化

Overexpression of long non-coding RNA Gm16104 affects osteogenic differentiation of C3H10T1/2 mesenchymal stem cells

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