自噬对面神经损伤大鼠面神经元的保护作用

doi:10.12307/2024.508

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (27): 4378-4382.doi: 10.12307/2024.508

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自噬对面神经损伤大鼠面神经元的保护作用

段坤岭，费静，李雷激

西南医科大学附属医院耳鼻咽喉头颈外科，四川省泸州市 646000

收稿日期:2023-08-28 接受日期:2023-10-14 出版日期:2024-09-28 发布日期:2024-01-29
通讯作者: 李雷激，硕士，主任医师，西南医科大学附属医院耳鼻咽喉头颈外科，四川省泸州市 646000
作者简介:段坤岭，女，1996年生，四川省会理市人，汉族，西南医科大学在读硕士，主要从事面神经相关的基础及临床研究。
基金资助:
泸州市科技计划项目(2021-SYF-30)，项目负责人：李雷激

Autophagy protects neurons against facial nerve injury in rats

Duan Kunling, Fei Jing, Li Leiji

Department of Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China

Received:2023-08-28 Accepted:2023-10-14 Online:2024-09-28 Published:2024-01-29
Contact: Li Leiji, Master, Chief physician, Department of Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
About author:Duan Kunling, Master candidate, Department of Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
Supported by:
Luzhou Municipal Science and Technology Program, No. 2021-SYF-30 (to LLJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

自噬：是一种在进化上保守的细胞内分解代谢过程，它可清除受损或多余的细胞器，如内质网、高尔基体及线粒体等，在能量代谢、生长、衰老、人类疾病如癌症和神经退行性疾病等许多病理生理过程中扮演着非常重要的角色。
腺苷酸活化蛋白激酶：是一种广泛分布于真核细胞的高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是细胞能量状态的主要感受器和维持能量稳态的枢纽，与自噬过程有关。在应激状态下，如饥饿、缺血等，可激活腺苷酸活化蛋白激酶，同时激活如葡萄糖代谢和自噬的各种分解代谢过程，从而维持能量平衡。

背景：周围性面神经损伤后，胶质细胞源性神经营养因子(glial cell-derived neurotrophic factor，GDNF)可发挥面神经元保护作用，有研究发现，GDNF可通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白调控自噬水平，面神经损伤后其是否能通过腺苷酸活化蛋白激酶/Unc-51样激酶1(AMPK/ULK1)信号通路调控面神经元尚不清楚。

目的：建立SD大鼠面神经损伤模型，探讨自噬在面神经再生中的作用及GDNF/AMPK/ULK1信号通路促进面神经损伤修复的机制。
方法：72只SD大鼠随机分成假手术组、模型组及3-甲基腺嘌呤组，每组24只。假手术组仅暴露面神经主干，其余2组制作面神经干压榨损伤模型。造模成功后，模型组予以腹腔注射生理盐水，3-甲基腺嘌呤组腹腔注射自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤15 mg/kg，1次/d，连续7 d。术后1，4，7，14，21，28 d进行行为学评分，术后7，14，21，28 d进行尼氏染色观察面神经元细胞形态及数量，Western blot法检测面神经元组织p-AMPK、p-ULK1、Beclin1、GDNF蛋白表达水平。

结果与结论：①行为学评分显示：3-甲基腺嘌呤组面瘫症状改善较模型组差且晚(P < 0.05)；②尼氏染色显示，3-甲基腺嘌呤组面神经元尼氏体的形态及数量较模型组恢复差且少(P < 0.05)；③Western blot检测显示模型组Beclin1及p-AMPK蛋白表达高于3-甲基腺嘌呤组和假手术组(P < 0.05)，模型组p-ULK1蛋白表达低于3-甲基腺嘌呤组和假手术组(P < 0.05)，假手术组和模型组GDNF蛋白表达高于3-甲基腺嘌呤组(P < 0.05)； ④结果表明，自噬抑制剂延缓面神经损伤后的修复可能与下调GDNF表达，使AMPK失活，磷酸化ULK1，进而抑制神经元自噬水平有关。

https://orcid.org/0009-0000-3635-823X(段坤岭)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 面神经损伤, 周围性面瘫, 自噬, 面神经元, 胶质细胞源性神经营养因子, AMPK, ULK1, Beclin1, 尼氏体

Abstract: BACKGROUND: After peripheral facial nerve injury, glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) can play a protective role in facial neurons. It has been found that GDNF can regulate the level of autophagy through mammalian target of rapamycin (mTOR), but it is unclear whether it can regulate facial neurons through the adenylate-activated protein kinase/Unc-51-like kinase 1 (AMPK/ULK1) signaling pathway after facial nerve injury.
OBJECTIVE: To establish a facial nerve injury model in Sprague-Dawley rats and explore the role of autophagy in facial nerve regeneration and the mechanism by which the GDNF/AMPK/ULK1 signaling pathway promotes facial nerve repair after injury.
METHODS: Seventy-two Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group, model group and autophagy inhibitor 3-methyladenine (3-MA) group, with 24 rats in each group. Only the main trunk of the facial nerve was exposed in the sham group, while the remaining two groups were modeled for the compression injury of the facial nerve trunk. After successful modeling, the model group was given intraperitoneal injection of normal saline (15 mg/kg), and the 3-MA group was given intraperitoneal injection of 3-MA (15 mg/kg), both once daily for 7 days. The rats in each group were scored on the Simone 10-point behavioral scale at 1, 4, 7, 14, 21 and 28 days after surgery. Nissl staining was performed to observe the morphology and number of facial neuron cells at 7, 14, 21, and 28 days. The expression levels of p-AMPK, p-ULK1, Beclin1 and GDNF in the facial neuron tissues of rats were detected by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: Behavioral scoring showed that the improvement of facial paralysis symptoms in the 3-MA group was worse and later than that in the model group (P < 0.05). Nissl staining showed that the morphology and number of Nissl bodies in facial neurons in the 3-MA group recovered poorly and the number was less than that in the model group (P < 0.05). Western blot detection results showed that the expression of p-AMPK and Beclin1 in the model group was higher than that in the 3-MA group and the sham group (P < 0.05). The protein expression of p-ULK1 in the model group was lower than that in the 3-MA group and the sham group (P < 0.05). To conclude, autophagy inhibitor delays nerve repair after facial nerve injury, which may be related to down-regulation of GDNF expression, inactivation of AMPK, and phosphorylation of ULK1, thereby inhibiting neuronal autophagy levels.

Key words: facial nerve injury, peripheral facial paralysis, autophagy, facial neuron, glial cell-derived neurotrophic factor, AMPK, ULK1, Beclin1, Nissl body

中图分类号:

段坤岭, 费静, 李雷激. 自噬对面神经损伤大鼠面神经元的保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(27): 4378-4382.

Duan Kunling, Fei Jing, Li Leiji. Autophagy protects neurons against facial nerve injury in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(27): 4378-4382.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析共纳入72只SD大鼠，随机分为3组，全部进入结果分析，无脱落。
2.2 各组大鼠行为学比较假手术组大鼠无周围性面瘫表现，评分为0分。术后1 d，模型组及3-甲基腺嘌呤组大鼠均表现为鼻尖明显偏向左侧、右侧眼睑无法闭合、胡须倒伏无活动，评分为5分，与假手术组比较，差异有显著性意义(P < 0.05)，提示造模成功。术后4，7 d，模型组与3-甲基腺嘌呤组大鼠评分均为5分，上述面瘫症状无明显缓解，与假手术组比较，差异有显著性意义(P < 0.05)。术后14 d，模型组部分大鼠面瘫症状开始有一定的恢复，部分鼻尖稍向左侧倾斜、眨眼反射延迟、胡须运动较前明显，评分为3-5分；而3-甲基腺嘌呤组面瘫症状仍无明显缓解，评分仍为5分，与模型组比较，差异有显著性意义(P < 0.05)。术后28 d，模型组大鼠面瘫症状基本恢复，评分低于3分；3-甲基腺嘌呤组大鼠表现为鼻尖偏向左侧、右侧眼睑闭合稍差、胡须无自主活动，面瘫症状有一定程度恢复，但评分仍高于3分，与模型组比较，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图1。

2.3 各组大鼠面神经元尼氏体变化尼氏体是神经元的一种特征性结构。正常面神经元在低倍镜下大多呈角形细胞聚集，高倍镜下可见胞质淡红色，胞核呈淡蓝色或蓝色居中。尼氏染色显示：假手术组面神经元胞质染色均匀，尼氏体呈紫色“虎斑”样，胞核居中。术后7 d，模型组和3-甲基腺嘌呤组均出现神经元胞体皱缩，胞内染色不均，尼氏体减少，呈块状或颗粒状甚至粉末状，3-甲基腺嘌呤组更为严重。术后14 d，模型组尼氏体再现，呈颗粒状或块状，3-甲基腺嘌呤组大部分细胞内尼氏体缺失。术后28 d，模型组胞体大小及尼氏体形态基本恢复至术前，3-甲基腺嘌呤组逐渐恢复，可见部分细胞出现细颗粒状尼氏体。在术后各时间点，3组大鼠面神经核团平均吸光度值差异有显著性意义(P < 0.05)，见图2。

2.4 各组大鼠面神经元p-AMPK、p-ULK1、Beclin1、GDNF蛋白表达 Western blot检测显示，在术后各时间点，模型组的Beclin1和p-AMPK蛋白表达水平较假手术组明显增加，而GDNF和p-ULK1的蛋白表达水平明显下降，差异有显著性意义(P < 0.05)。与模型组相比，3-甲基腺嘌呤组Beclin1、p-AMPK和GDNF的蛋白表达明显下降，而p-ULK1的蛋白表达明显增加，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图3。

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引言

周围性面瘫是以面神经损伤为主要表现的一种临床常见病，其每年每10万人中有20-45人发病[1]，其中成人有17-35人[2]，并且逐年增加。该病严重影响了患者的面部表情、身心健康及生活质量[3-4]。目前，对该疾病的治疗多采用中西医结合方式，但其预后不佳[5]。
研究发现，胶质细胞源性神经营养因子(glial cell-derived neurotrophic factor，GDNF)在面神经损伤早期修复中发挥重要作用[6]，是促进神经损伤修复最具潜力的营养因子之一[7]，对神经元的发育及存活至关重要[8–10]，它能够促进多种神经细胞的存活，如感觉神经、运动神经、交感神经、副交感神经、多巴胺能神经元及胶质细胞等，也促进突触和髓鞘形成[11]。研究发现GDNF具有神经保护作用[12]，为神经损伤的治疗开辟了新的路径。
自噬是一种在进化上保守的细胞内分解代谢过程，它可清除受损或多余的细胞器，如内质网、高尔基体及线粒体等[13]，在能量代谢、生长、衰老、人类疾病如癌症和神经退行性疾病等许多病理生理过程中扮演着非常重要的角色[14-17]。有研究表明，自噬在保护细胞免于死亡及凋亡中起重要作用[18]。低浓度的GDNF可激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)通路[19-20]。mTOR是腺苷单磷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK)的下游靶点，活化的AMPK可触发AMPK/ULK1信号通路，进而启动细胞自噬[21]。GDNF是否可通过AMPK/ULK1自噬途径发挥神经保护作用尚未有报道。该研究通过建立SD大鼠面神经压榨损伤模型，探讨自噬在面神经损伤后再生中的作用及GDNF/AMPK/ULK1信号通路对面神经元的影响。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)结合事后Tukey检验。
1.2 时间及地点实验于2022年2月至2023年1月在西南医科大学实验动物中心和附属医院中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 SD大鼠72只，雌雄各半，三四个月龄，体质量190-240 g，由西南医科大学动物实验中心供应，动物许可证号为SYXK(川)2018-065，分笼饲养，每笼6只，饲养时温度、湿度适宜，人工调控明暗周期12 h，不限水，适应性饲养7 d后用于实验，术前禁水禁食6-8 h。研究方案经西南医科大学实验动物伦理委员会批准(批准文号：swmu20220093)。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2 实验药品、试剂及仪器自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(JK003972-1g)购自合肥基努生物；尼氏染液(G1032)购自赛维尔生物科技有限公司；p-AMPK(AF3423)、Beclin1 (AF5128)、p-ULK1(AF4378)、GDNF(DF7727)、β-actin(AF7018)一抗均购自Affinity；二抗(GAM0072)购自MultiSciences；BCA试剂盒(BL521A)、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(BL502B)均购自Biosharp；PVDF膜(孔径0.45 μm和0.2 μm)购自MerckMillipore；化学发光成像系统购自上海勤翔科学仪器有限公司；尼康显微镜成像系统、正置光学显微镜购自日本尼康公司。
1.4 实验方法

1.4.1 模型制备 2%戊巴比妥钠(50 mg/kg)对各组SD大鼠进行腹腔注射麻醉成功后，去除右侧面部术区毛发，手术区域常规消毒、铺巾，在耳郭后下方行“弧形”切口，约2 cm，止血钳钝性分离，暴露长1.0 cm面神经主干，用微血管钳闭合三齿夹持面神经主干持续约10 min[22]，逐层缝合皮肤，假手术组仅暴露面神经主干后逐层缝合皮肤。所有操作均由同一人完成。术后均用青霉素预防感染。造模成功标准：出现术侧口角下垂、口角向健侧歪斜等周围性面瘫表现，采用Simone行为学评分> 3分认为存在完全面瘫。

1.4.2 干预方法将SD大鼠采用随机数表法分为3组：假手术组、模型组、3-甲基腺嘌呤组，每组24只，各组于术后7，14，21，28 d再分为4个亚组，每个时间点6只。假手术组不予以药剂干扰，3-甲基腺嘌呤组术后予以15 mg/(kg•d) 3-甲基腺嘌呤腹腔注射[23]，模型组大鼠予以等体积生理盐水腹腔注射，持续应用7 d。
1.4.3 取材各组做标记后于术后7，14，21，28 d取材。用2%戊巴比妥钠行大鼠腹腔注射麻醉成功后，固定、备皮、消毒，沿腹正中线开腹，寻找腹主动脉并夹闭，开胸，暴露心脏，输液针沿左心室心尖位置进针进入主动脉后固定，剪开大鼠的右心耳，快速灌注100 mL生理盐水直到肝脏变白，再缓慢灌注40 g/L多聚甲醛500 mL预固定。每组取3只大鼠脑组织，40 g/L多聚甲醛固定，制备石蜡切片，用于尼氏染色实验，于冰台上取每组剩余3只大鼠含面神经元的脑组织放于提前预冷的冻存管内，转移至-80 ℃冰箱中储存，用于Western blot实验。
1.5 主要观察指标
1.5.1 大鼠面瘫症状评分术后1，4，7，14，28 d对各组大鼠的鼻尖位置、胡须运动及眨眼反射进行面瘫行为学评分[24-25]。①观察大鼠鼻尖位置，鼻尖居中为0分；鼻尖位置偏向左侧为1分；②观察大鼠胡须运动30 s，双侧无差别为0分；右侧胡须运动比左侧运动弱为1分；右侧胡须运动完全消失为2分；③用5 mL注射器抽取适量的空气，迅速将其吹至大鼠眼部，观察其眨眼反射，包括眼睑运动及闭合情况，双侧无差别为0分；相对于左边，眨眼反射延迟为1分；眨眼反射全部消失为2分。总评分为0分时表示无面瘫，认为恢复完全；总评分为1-3分时表示不完全面瘫，可认为有恢复；总评分大于3分时，认为存在完全面瘫[26]。
1.5.2 尼氏染色取大鼠灌流后脑组织石蜡切片，依次放入二甲苯Ⅰ 20 min、二甲苯Ⅱ 20 min常规脱蜡，乙醇脱水(无水乙醇Ⅰ 5 min、无水乙醇Ⅱ 5 min、体积分数75%乙醇5 min)；蒸馏水冲洗3次，每次5 min；用尼氏染液浸染组织45 min，自来水洗后置于烤箱烤干，二甲苯透明5 min，最后中性树胶封固。正置显微镜下观察拍照，观察面神经元尼氏体变化及平均吸光度值。
1.5.3 Western blot 检测取适量大鼠脑组织加入10倍组织体积的RIPA裂解液冰上匀浆，冰浴30 min，细胞裂解，12 000×g离心10 min，取上清液，BCA法测蛋白浓度，调整蛋白浓度后加入上样缓冲液，沸水浴5 min至蛋白变性，行SDS-PAGE电泳分离，用PVDF膜湿转法进行转膜，室温下5%脱脂奶粉封闭1 h，加入1∶1 000稀释兔抗p-AMPK、兔抗p-ULK1、兔抗Beclin1、兔抗GDNF 4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，二抗孵育1 h，再次TBST洗膜3次，将PVDF膜置于ECL混合液中，化学发光成像系统自动曝光，采集图像。采用Image J图像处理软件对目的条带进行灰度分析。
1.6 统计学分析采用Graphpad 9.5.1软件分析与作图，所有结果以x±s表示，采用单因素方差分析和Tukey事后检验，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经西南医科大学生物统计学专家审核。

讨论

周围神经损伤后神经功能的成功恢复不仅依赖于轴突的再生，还需依赖神经元的存活、髓鞘的再生、再生轴突与相应的末梢靶器官重建突触联系、轴突损伤神经元树突树的重构、中枢神经环路的重构等多种因素[27-30]。其中，受损神经元的存活对于神经成功再生以及恢复对靶器官的功能性支配至关重要。该研究中，在面神经主干受到压榨损伤后，模型组及3-甲基腺嘌呤组大鼠都表现出典型的周围性面瘫症状，如鼻尖偏移、嘴角歪斜、眼睑裂变宽、触须倒伏或运动消失。随着时间推移，实验大鼠面瘫评分均有不同程度下降，面瘫症状改善，但观察期内3-甲基腺嘌呤组面瘫症状并未完全恢复，评分仍然大于3分。早期自噬的发生可起到细胞保护作用，24 h内应用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤可增加神经元死亡率，但48 h后3-甲基腺嘌呤的使用可显著避免神经元死亡[31]。当神经元受到外部异常刺激损伤时，可观察到神经元独特结构尼氏体溶解及消失[32-33]。因此，术后各时间点，尼氏体形态学上模型组较3-甲基腺嘌呤组恢复得更早，神经元凋亡较轻，与既往研究一致[34-35]，3-甲基腺嘌呤抑制大鼠的自噬水平，可阻碍大鼠面神经损伤后尼氏体的合成。
自噬是真核细胞中广泛存在的一种细胞降解途径[36]，对维持细胞稳态和存活至关重要。自噬可通过清除轴突和髓鞘碎片，参与周围神经损伤的再生修复过程[37]。SEGLEN等[38]在1892年首次发现3-甲基腺嘌呤是自噬抑制剂，通过抑制自噬起相反的作用，使轴突和髓鞘再生受到抑制[39-40]。
Beclin1是哺乳动物的自噬标志蛋白，介导自噬体-溶酶体融合的下游步骤[41]。Beclin1含量越多说明自噬越强[42]。该研究术后各时间点模型组 Beclin1蛋白表达水平显著高于假手术组，模型组Beclin1的表达趋势为逐渐升高后逐渐下降，与面神经压榨损伤发生应激反应，随之自噬被激活有关，故自噬标志分子Beclin1的表达增强，随着面神经的自愈，自噬效应逐渐减弱。自噬受到抑制后，3-甲基腺嘌呤组Beclin1蛋白表达较模型组显著下降，其表达趋势为缓慢下降后逐渐升高，与大鼠体内药物随时间缓慢代谢、药物效应逐渐减弱有关。
GDNF是一种靶源性神经营养因子，不仅能促进多巴胺能神经元的存活，还可以修复损伤后的多巴胺能神经元[43]。有研究表明，GDNF有助于培养的神经元存活，促其生长，并能延缓受损运动神经元的萎缩和死亡[8]。GDNF对成熟脊髓的轴索和施万细胞有营养作用，利于轴突再生。切断大鼠坐骨神经后，在神经纤维中施万细胞可持续5个月以上高表达GDNF mRNA[44]。脑干中GDNF蛋白的合成较少，主要由其所支配的外周靶组织合成分泌后再摄取，沿轴突逆向运输至神经元胞体中发挥作用。周围神经损伤后，神经远端发生沃勒变性，神经生长因子与细胞外泌素大量产生并外渗[45-46]，但因轴突连续性被破坏，GDNF的逆行运输受阻，神经元胞体失去目标神经营养因子的供给。在该研究中，模型组、3-甲基腺嘌呤组与假手术组相比，面神经元中GDNF表达均降低；3-甲基腺嘌呤组抑制细胞自噬，周围神经及肌肉组织炎性反应较重，轴突恢复差，逆转运更少，所以3-甲基腺嘌呤组GDNF的表达低于模型组，与此前研究一致[35]。
已有研究显示，GDNF可作用于施万细胞内的信号通路[47]，AMPK/mTOR/ULK1信号通路在调控自噬防治疾病方面起着关键的作用[48-49]。ULK1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是自噬体形成的关键诱导因子，参与自噬的初始阶段[50]。ULK1可通过mTOR或AMPK在不同位点被磷酸化导致不同的生理反应，抑制自噬或激活自噬，不同位点 AMPK可通过直接激活ULK1或通过抑制mTOR间接磷酸化ULK1来增强自噬[51]。当细胞有足够的能量时，AMPK处于失活状态，mTOR被激活，进而对ULK1的Ser757位点磷酸化，自噬作用被抑制[52]。
当面神经受损时，AMPK的Thr172位点被磷酸化激活，进而抑制mTOR，使ULK1 Ser757位点的磷酸化被抑制，进而激活ULK1其他位点的磷酸化，发挥AMPK的促进作用，启动自
噬[53]。该机制与GDNF和PI3K/AKT/mTOR信号通路呈正性作用一致。该研究中，模型组大鼠面神经元p-AMPK水平较3-甲基腺嘌呤组高，而 p-ULK1水平相反，提示3-甲基腺嘌呤通过抑制AMPK/mTOR/ULK1 信号通路发挥自噬反应的抑制作用。
综上所述，自噬可以保护面神经并促进面神经损伤后修复；自噬抑制剂延缓面神经损伤后的修复可能与下调GDNF的表达，使AMPK失活，磷酸化ULK1(Ser757)，抑制神经元自噬水平有关。然而该研究并未用对应的自噬激动剂或者通路抑制剂进行对比实验，且面神经损伤过程会产生大量其他神经营养因子，抑制自噬也可能影响这些因子的产生，进而影响后续再生的机制，因此仍需进一步探讨。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

自噬对面神经损伤大鼠面神经元的保护作用

Autophagy protects neurons against facial nerve injury in rats

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