2.1   低浓度圣草素对成骨细胞无毒性，且促进成骨细胞增殖   使用CCK-8测量细胞活力，以检查圣草素是否对成骨细胞活性具有影响，并在体外找到最合适的处理浓度。使用不同浓度的圣草素(0，0.5，1，2.5，5和10 μmol/L)处理MC3T3‐E1细胞48 h，初步筛选最佳浓度。结果显示，低浓度的圣草素对MC3T3‐E1细胞无毒性，且10 μmol/L的圣草素促进MC3T3‐E1细胞增殖(P < 0.05，图1A)。接下来，使用不同浓度的圣草素(0，0.5，1，2.5，5和10 μmol/L)干预地塞米松处理的MC3T3‐E1细胞，结果显示地塞米松处理后MC3T3‐E1细胞的活性显著降低(P < 0.01)，而2.5 μmol/L的圣草素干预升高MC3T3‐E1细胞活性(P < 0.05)，5 μmol/L和10 μmol/L圣草素对地塞米松处理的MC3T3-E1细胞活性的促进作用更明显(P < 0.01，图1B)。以上结果提示，低浓度的圣草素对成骨细胞MC3T3-E1无毒性，且促进细胞增殖。



2.2   圣草素减轻地塞米松处理成骨细胞中Caspase依赖性细胞凋亡   细胞凋亡分析显示，圣草素以剂量依赖的方式降低地塞米松诱导的成骨细胞MC3T3-E1凋亡(P < 0.05，图2A，B)。Caspase的级联激活触发细胞凋亡，因此通过ELISA试剂盒检测MC3T3-E1细胞中Caspase-3(细胞凋亡途径中的主要Caspase)的活性。结果显示，地塞米松处理可显著升高MC3T3-E1细胞中Caspase-3的活性，而圣草素处理以剂量依赖性的方式抑制Caspase-3的活性(P < 0.05，图2C)。与此同时，Western blot结果显示，地塞米松可显著促进凋亡蛋白Bax的表达(P < 0.05)，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达(P < 0.05)；而圣草素逆转了地塞米松对MC3T3-E1细胞中凋亡蛋白和抗凋亡蛋白表达的影响(图2D-F)。这些结果表明圣草素抑制地塞米松诱导的成骨细胞Caspase依赖性凋亡。



2.3   圣草素通过促进地塞米松处理的成骨细胞的自噬抑制细胞凋亡   为了探索圣草素抑制成骨细胞凋亡的潜在机制，通过Western blot分析了MC3T3-E1细胞中的自噬水平。结果显示地塞米松处理显著减低MC3T3-E1细胞中的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率，抑制自噬相关蛋白p62、Atg5和Atg12的表达(P < 0.01)。圣草素以剂量依赖性升高细胞中的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率，促进p62、Atg5和Atg12的蛋白表达(P < 0.05，图3A-E)。这些结果表明，圣草素在地塞米松处理的成骨细胞中激活了自噬。此外，自噬抑制剂3-MA的加入显著逆转了圣草素对地塞米松诱导的成骨细胞中Caspase-3活性和细胞凋亡的抑制作用(P < 0.05，图3F-H)。




2.4   圣草素诱导成骨细胞中HMOX1表达上调   为了进一步研究圣草素对MC3T3-E1细胞活性的影响，检测了圣草素处理的MC3T3-E1细胞中的HMOX1表达。RT-qPCR和Western blot结果显示，地塞米松处理MC3T3-E2细胞显著抑制HMOX1表达，而圣草素呈剂量依赖性促进HMOX1的mRNA和蛋白表达(P < 0.05)，见图4。



2.5   HMOX1通过激活AMPK信号通路抑制成骨细胞凋亡   为了探究HMOX1对成骨细胞的影响，用HMOX1的过表达载体和空载体转染地塞米松诱导的MC3T3‐E1细胞，观察细胞的凋亡情况。流式细胞术分析显示过表达HMOX1显著抑制地塞米松诱导的MC3T3-E1细胞凋亡(P < 0.01，图5A)。ELISA试剂盒分析显示过表达HMOX1显著减低地塞米松诱导的MC3T3-E1细胞中的Caspase-3活性(P < 0.01，图5B)。Western blot分析显示过表达HMOX1显著减少Bax的蛋白表达，促进Bcl-2的表达(P < 0.01，图5C-E)。除此之外，Western blot分析结果还显示过表达HMOX1显著促进AMPK的磷酸化(P < 0.01，图5F)。以上结果表明HMOX1通过激活AMPK信号通路抑制地塞米松诱导的成骨细胞凋亡。




2.6   HMOX1通过诱导自噬激活抑制成骨细胞凋亡   为了阐明HMOX1是否通过自噬保护抑制成骨细胞凋亡，使用了自噬抑制剂3-MA干预MC3T3-E1细胞。Western blot结果显示过表达HMOX1显著升高MC3T3-E1细胞中的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率，促进自噬相关蛋白p62的表达(P < 0.01)，而3-MA干预减低LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率，抑制p62的表达(P < 0.01，图6A-C)。此外，过表达HMOX1显著抑制MC3T3-E1细胞中凋亡蛋白Bax的表达(P < 0.01)，促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达(P < 0.01)，而3-MA抵消了HMOX1过表达对Bax和Bcl-2蛋白表达的影响(P > 0.05)，见图6D，E。ELISA试剂盒检测结果显示过表达HMOX1显著减低MC3T3-E1细胞中Caspase-3活性(P < 0.01)，而3-MA升高Caspas-3活性(图6F)。流式细胞术分析显示过表达HMOX1显著抑制MC3T3-E1细胞凋亡(P < 0.01)，而3-MA逆转了HMOX1过表达对MC3T3-E1细胞凋亡的影响(P < 0.05，图6G)。这些结果表明，HMOX1通过激活自噬抑制地塞米松诱导的成骨细胞凋亡。

[1] GOPINATH V. Osteoporosis. Med Clin North Am. 2023;107(2):213-225. [2] SNODGRASS P, ZOU A, GRUNTMANIS U, et al. Osteoporosis Diagnosis, Management, and Referral Practice After Fragility Fractures. Curr Osteoporos Rep. 2022;20(3):163-169. [3] AIBAR-ALMAZáN A, VOLTES-MARTíNEZ A, CASTELLOTE-CABALLERO Y, et al. Current Status of the Diagnosis and Management of Osteoporosis. Int J Mol Sci. 2022;23(16):9465. [4] SRIVASTAVA RK, SAPRA L,MISHRA PK. Osteometabolism: Metabolic Alterations in Bone Pathologies. Cells. 2022;11(23):3943. [5] LIANG B, BURLEY G, LIN S, et al. Osteoporosis pathogenesis and treatment: existing and emerging avenues. Cell Mol Biol Lett. 2022; 27(1):72. [6] PATEL D, WAIRKAR S. Bone regeneration in osteoporosis: opportunities and challenges. Drug Deliv Transl Res. 2023;13(2):419-432. [7] LAURENT MR, GOEMAERE S, VERROKEN C, et al. Prevention and Treatment of Glucocorticoid-Induced Osteoporosis in Adults: Consensus Recommendations From the Belgian Bone Club. Front Endocrinol (Lausanne). 2022;13:908727. [8] URQUIAGA M,SAAG KG. Risk for osteoporosis and fracture with glucocorticoids. Best Pract Res Clin Rheumatol. 2022; 36(3): 101793. [9] CHEN M, FU W, XU H, et al. Pathogenic mechanisms of glucocorticoid-induced osteoporosis. Cytokine Growth Factor Rev. 2023;70:54-66. [10] VARGAS JNS, HAMASAKI M, KAWABATA T, et al. The mechanisms and roles of selective autophagy in mammals. Nat Rev Mol Cell Biol. 2023; 24(3):167-185. [11] ZHU C, SHEN S, ZHANG S, et al. Autophagy in Bone Remodeling: A Regulator of Oxidative Stress. Front Endocrinol (Lausanne). 2022;13: 898634. [12] WANG J, ZHANG Y, CAO J, et al. The role of autophagy in bone metabolism and clinical significance. Autophagy. 2023;19(9):2409-2427. [13] YAO L, LIU W, BASHIR M, et al. Eriocitrin: A review of pharmacological effects. Biomed Pharmacother. 2022;154:113563. [14] DENG Z, HASSAN S, RAFIQ M, et al. Pharmacological Activity of Eriodictyol: The Major Natural Polyphenolic Flavanone. Evid Based Complement Alternat Med. 2020;2020:6681352. [15] SONG F, ZHOU L, ZHAO J, et al. Eriodictyol Inhibits RANKL-Induced Osteoclast Formation and Function Via Inhibition of NFATc1 Activity. J Cell Physiol. 2016;231(9):1983-1993. [16] SFEIR JG, DRAKE MT, KHOSLA S, et al. Skeletal Aging. Mayo Clin Proc. 2022;97(6):1194-1208. [17] PLUSKIEWICZ W, ADAMCZYK P,DROZDZOWSKA B. Glucocorticoids Increase Fracture Risk and Fracture Prevalence Independently from Bone Mineral Density and Clinical Risk Factors: Results from the Gliwice Osteoporosis (GO) Study. Horm Metab Res. 2022;54(1):20-24. [18] HUANG J, YE Y, XIAO Y, et al. Geniposide ameliorates glucocorticoid-induced osteoblast apoptosis by activating autophagy. Biomed Pharmacother. 2022;155:113829. [19] ISLAM A, ISLAM MS, RAHMAN MK, et al. The pharmacological and biological roles of eriodictyol. Arch Pharm Res. 2020;43(6):582-592. [20] LI L, LI WJ, ZHENG XR, et al. Eriodictyol ameliorates cognitive dysfunction in APP/PS1 mice by inhibiting ferroptosis via vitamin D receptor-mediated Nrf2 activation. Mol Med. 2022;28(1):11. [21] SHAN H, ZHANG X, MI Y, et al. Eriodictyol Suppresses Gastric Cancer Cells via Inhibition of PI3K/AKT Pathway. Pharmaceuticals (Basel). 2022; 15(12):1477. [22] NISAR MF, LIU T, WANG M, et al. Eriodictyol protects skin cells from UVA irradiation-induced photodamage by inhibition of the MAPK signaling pathway. J Photochem Photobiol B. 2022;226:112350. [23] GUO YF, SU T, YANG M, et al. The role of autophagy in bone homeostasis. J Cell Physiol. 2021;236(6):4152-4173. [24] TROJANI MC, SANTUCCI-DARMANIN S, BREUIL V, et al. Autophagy and bone diseases. Joint Bone Spine. 2022;89(3):105301. [25] HUANG J, YE Y, XIAO Y, et al. Geniposide ameliorates glucocorticoid-induced osteoblast apoptosis by activating autophagy. Biomed Pharmacother. 2022;155:113829. [26] CAO L, ZHOU S, QIU X, et al. Trehalose improves palmitic acid-induced apoptosis of osteoblasts by regulating SIRT3-medicated autophagy via the AMPK/mTOR/ULK1 pathway. Faseb J. 2022;36(9):e22491. [27] VIDONI C, FERRARESI A, SECOMANDI E, et al. Autophagy drives osteogenic differentiation of human gingival mesenchymal stem cells. Cell Commun Signal. 2019;17(1):98. [28] CHENG CH, CHEN LR,CHEN KH. Osteoporosis Due to Hormone Imbalance: An Overview of the Effects of Estrogen Deficiency and Glucocorticoid Overuse on Bone Turnover. Int J Mol Sci. 2022;23(3): 1376. [29] ZHANG P, LIAO J, WANG X, et al. High glucose promotes apoptosis and autophagy of MC3T3-E1 osteoblasts. Arch Med Sci. 2023;19(1):138-150. [30] CHE J, YANG J, ZHAO B, et al. HO-1: A new potential therapeutic target to combat osteoporosis. Eur J Pharmacol. 2021;906:174219. [31] LIN TH, TANG CH, HUNG SY, et al. Upregulation of heme oxygenase-1 inhibits the maturation and mineralization of osteoblasts. J Cell Physiol. 2010;222(3):757-768. [32] GE Y, ZHOU M, CHEN C, et al. Role of AMPK mediated pathways in autophagy and aging. Biochimie. 2022;195:100-113. [33] GUO X,LIANG M. Metformin alleviates dexamethasone-induced apoptosis by regulating autophagy via AMPK/mTOR/p70S6K in osteoblasts. Exp Cell Res. 2022;415(1):113120.

[1]	谢 恒, 顾 叶, 顾赢楚, 吴泽睿, 方 涛, 王秋霏, 彭育沁, 耿德春, 徐耀增. 骨骼疾病中的铁死亡：骨质疏松治疗靶点[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(16): 2613-2618.
[2]	杨慧霞, 白志刚, 迟宏扬, 马天龙, 马胜超, 姜怡邓. 长链非编码RNA H19抑制地塞米松致成骨细胞凋亡的作用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(28): 4513-4518.
[3]	蒋一凡, 耿 煜, 张 新, 左中夫. 地塞米松对高糖诱导肾小球足细胞氧化损伤的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(24): 3852-3857.
[4]	王 磊, 白雪松, 杜 宇, 何爱民, 郑 钧, 张志鹏, 吕惠成. miR-27b/PPARγ2轴对小鼠胚胎成骨前体细胞增殖和成骨细胞分化的意义[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(11): 1780-1786.
[5]	王振恒, 王治栋, 刘乃澄, 陈广东, 高懋峰, 施卫东, 朱若夫. 单髁关节置换前静脉应用地塞米松对置换后患者疼痛及并发症的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(33): 5297-5302.
[6]	宋 伟, 张亚鑫, 贾大洲, 孙 钰. 辅助应用地塞米松联合呋塞米对全膝关节置换后早期疼痛和肿胀的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(33): 5317-5322.
[7]	王 雪, 刘 阳, 徐剑峰, 龙乾发, 王 童, 钟 俊. 脐带间充质干细胞来源外泌体对脑出血模型小鼠海马神经元的保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(31): 4928-4934.
[8]	宋建治, 徐礼森, 张 晨, 涂 峰, 牛 飞. Akt激活剂SC79抑制地塞米松诱导成骨细胞凋亡和程序性坏死的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(29): 4699-4703.
[9]	谷青芳, 郭敏芳, 刘晓琴, 穆秉桃, 李伟梅, 宋丽娟, 柴 智, 马存根, 尉杰忠. 骨髓间充质干细胞改善APP/ PS1模型小鼠认知功能的机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(19): 2964-2969.
[10]	罗秋锐, 宋小琴, 王荣丽. sirtinol与地塞米松对哮喘模型小鼠体内沉默信息调节蛋白1和白细胞介素5水平的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(17): 2720-2725.
[11]	张 磊, 严 玉, 刘 崟, 徐 隆, 杨行雷, 刘雨佳. 8周有氧运动改善肥胖诱导心肌纤维化过程中核因子E2相关因子2通路的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(17): 2650-2656.
[12]	乔久涛, 关德宏, 王冬艳, 刘艾芸. 左归丸对成骨细胞氧化应激损伤的保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1052-1056.
[13]	谭 静, 易国栋. 萝卜硫素对H2O2诱导人肝细胞氧化应激损伤模型的保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(31): 5052-5056.
[14]	张 晴, 范俊柏, 赵小雨. 地塞米松用于臂丛神经阻滞最佳途径及剂量的系统评价和Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(29): 4751-4756.
[15]	周倚墨, 张建宁, 单中书. 补骨脂提取物干预骨质疏松模型大鼠骨密度及骨生物力学的变化[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(2): 165-170.

骨质疏松症是一种进行性全身性骨骼代谢疾病，其特征是骨质减少和骨微结构退化，导致骨骼脆性和骨折风险增加[1-2]。随着骨质疏松性骨折发病率的增加，导致高残疾率和高死亡率，给全世界带来巨大的社会负担[3]。骨健康取决于破骨细胞介导的骨吸收和成骨细胞介导的骨形成之间的平衡[4]。破骨细胞过多导致骨吸收过多，成骨细胞过少导致骨形成不足，造成明显的骨质流失，最终发展为骨质疏松症[5-6]。糖皮质激素相关的骨质疏松症是糖皮质激素治疗中最具破坏性的不良事件[7-8]。长期使用糖皮质激素可通过减少成骨细胞的数量和活性以及延长破骨细胞的寿命来减少骨形成并促进骨吸收[9]。因此，开发有效的治疗方法对于减轻糖皮质激素引起的骨质疏松症至关重要。
自噬是一种高度保守的细胞机制，可以通过降解受损或老化的细胞器，分解不必要的大分子或病原体，释放营养物质和能量来保护细胞内稳态[10]。现有报道显示，自噬在成骨细胞早期增殖、分化和存活中发挥了积极作用，而该通路失调会导致骨质疏松症[11-12]。此外，有报道表明糖皮质激素对成骨细胞自噬具有抑制作用，这与糖皮质激素诱导的骨质疏松症的致病机制有关[9]。圣草素是一种从柑橘柠檬等植物中提取的类黄酮，具有广泛的生物医学和药理作用，包括抗氧化和抗炎活性[13-14]。此外，有报道显示圣草素抑制核因子κB受体激活因子诱导的破骨细胞形成和功能[15]。然而，圣草素是否对成骨细胞生成具有影响，以及其具体的作用机制尚不清楚。因而，在此次研究中探究了圣草素对地塞米松抑制的成骨细胞自噬和细胞凋亡的调节作用。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   细胞学体外实验，组间比较采用单因素方差分析。
1.2   时间及地点   实验于2022年3月至2023年3月在河南省中医药大学SPF级实验动物中心完成。
1.3   材料
1.3.1   细胞株   啮齿动物前成骨细胞系MC3T3-E1购自中国科学院细胞库。
1.3.2   主要试剂   地塞米松(D4902)购自Sigma(马萨诸塞州圣路易斯)；3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)(HY-19312)购自MCE；Anti-Bax抗体(ab32503)、Anti-Bcl-2抗体(ab32124)、Anti-LC3B抗体(ab192890)、Anti-SQSTM1/p62抗体(ab109012)、Anti-AMP蛋白激活激酶(AMP-activatedproteinkinase，AMPK)抗体(ab32047)、Anti-p-AMPK抗体(ab133448)和Anti-GAPDH抗体(ab8245)购自Abcam；α-MEM培养基(22571038)、胎牛血清(10099141C)、青霉素-链霉素(15140148)、TRIzol试剂(10296010CN)和细胞转染试剂Lipofectamine 3000TM(L3000008)购自美国Life Technologies；反转录试剂盒(638315)购自TaKaRa；QuantiFast SYBR® Green荧光定量PCR试剂盒(204056)购自德国QIAGEN；RIPA裂解缓冲液(P0013M)和BCA蛋白测定试剂盒(P0012S)购自上海碧云天生物科技有限公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteine aspastic acid-specific protease，Caspase-3)活性检测ELISA检测试剂盒(G015-1-3)购自南京建成工程研究所有限公司。
1.3.3   主要仪器   Multiskan FC酶标仪、-80 ℃超低温冰箱、Nano Drop 2000荧光分光光度计购自美国Thermo Fisher Scientific公司；Tanon 4100凝胶成像系统购自上海天能公司；Mini-PROTEAN Tetra蛋白电泳仪、The Trans-Blot Turbo蛋白转膜仪、IQ5实时荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司。
1.4   方法   

1.4.1   细胞培养和处理   MC3T3-E1细胞以6.0×108 L-1的细胞密度接种于24孔培养板中培养，每孔1 mL，培养基采用含有体积分数10%胎牛血清和100 U青霉素/链霉素的α-MEM培养基，在37 ℃体积分数5%的CO2箱中培养。为了诱导成骨细胞分化，在上述混合培养基中补充10 mmol/L β-甘油磷酸和50 μg/mL抗坏血酸，然后加入10 μmol/L地塞米松制备成骨诱导培养基，进行诱导处理，3 d后收集细胞。阴性对照组的细胞用相同体积的载体处理，不暴露于药物。为了评估圣草素对成骨细胞的影响，在存在或不存在3-MA (5 μmol/L) 的情况下，将MC3T3-E1细胞维持在含有地塞米松(10 μmol/L)和圣草素(0.5，1，2.5，5和10 μmol/L)的成骨培养基中培养。 

1.4.2 分组及药物处理
(1)圣草素对成骨细胞的毒理学测定：将细胞分为6组，分别为空白对照组、0.5，1，2.5，5和10 μmol/L圣草素处理组。分别采用含有0.5，1，2.5，5和10 μmol/L圣草素的成骨培养基培养MC3T3-E1细胞48 h，空白对照组直接采用成骨培养基培养。观察不同浓度圣草素对成骨细胞活力的影响，筛选合适浓度的圣草素用于后续实验。
(2)圣草素对地塞米松诱导的成骨细胞活力的影响：将细胞分为7组，分别为空白对照组、地塞米松处理组和地塞米松+不同浓度圣草素(0.5，1，2.5，5和10 μmol/L)处理组。分别采用含有10 μmol/L地塞米松的成骨培养基和含有10 μmol/L地塞米松，以及0，0.5，1，2.5，5和10 μmol/L圣草素的成骨培养基培养MC3T3-E1细胞48 h，空白对照组直接采用成骨培养基培养。观察细胞活力，分析圣草素对地塞米松诱导的成骨细胞增殖的影响。
(3)圣草素对成骨细胞自噬、凋亡和HMOX1表达的调节作用：将细胞分为4组，分别为空白对照组、地塞米松处理组、地塞米松+2.5 μmol/L圣草素处理组和地塞米松+5 μmol/L圣草素处理组。分别采用含有10 μmol/L地塞米松的成骨培养基和含有10 μmol/L地塞米松，以及2.5和5 μmol/L圣草素的成骨培养基培养MC3T3-E1细胞48 h，空白对照组直接采用成骨培养基培养。观察不同组中细胞自噬相关蛋白的表达水平、凋亡细胞百分比和HMOX1的水平表达，探究圣草素对地塞米松诱导的成骨细胞自噬和凋亡的影响。
(4)圣草素对成骨细胞凋亡的自噬依赖性调节作用：将细胞分为3组，分别为地塞米松处理组、地塞米松+圣草素处理组和地塞米松+圣草素+3-MA处理组。分别采用含有10 μmol/L地塞米松的成骨培养基，含有10 μmol/L地塞米松和5 μmol/L圣草素的成骨培养基，以及含有10 μmol/L地塞米松、5 μmol/L圣草素和5 μmol/L自噬抑制剂3-MA的成骨培养基培养MC3T3-E1细胞48 h，空白对照组直接采用成骨培养基培养。观察不同组中凋亡细胞百分比和Caspase-3活性水平，探究圣草素对成骨细胞凋亡的抑制作用是否依赖于自噬激活。
(5)过表达HMOX1对成骨细胞凋亡的调节作用：将细胞分为4组，分别为空白对照组、地塞米松处理组、地塞米松+pcDNA vector组、地塞米松+pcDNA-HMOX1组。地塞米松+pcDNA vector组和地塞米松+pcDNA-HMOX1组分别采用pcDNA vector和pcDNA-HMOX1转染MC3T3-E1细胞48 h，然后采用含有10 μmol/L地塞米松的成骨培养基培养48 h，空白对照组直接采用成骨培养基培养。观察不同组中凋亡细胞百分比、凋亡相关蛋白表达水平和AMPK通路蛋白表达水平，探究过表达HMOX1对AMPK通路的调节作用和对成骨细胞凋亡的调节作用。
(6)HMOX1对成骨细胞凋亡的自噬依赖性调节作用：将细胞分为4组，分别为地塞米松处理组、地塞米松+pcDNA vector组、地塞米松+pcDNA-HMOX1组、地塞米松+pcDNA-HMOX1+3-MA组。地塞米松+pcDNA vector组和地塞米松+pcDNA-HMOX1组分别采用pcDNA vector和pcDNA-HMOX1转染MC3T3-E1细胞48 h，然后采用含有10 μmol/L地塞米松的成骨培养基培养48 h；地塞米松+pcDNA-HMOX1+3-MA组细胞在pcDNA-HMOX1转染48 h后，采用含有10 μmol/L地塞米松和5 μmol/L自噬抑制剂3-MA的成骨培养基培养48 h；空白对照组直接采用成骨培养基培养。观察不同组中自噬相关蛋白表达水平、凋亡细胞百分比和凋亡相关蛋白表达水平，探究HMOX1对成骨细胞凋亡的抑制作用是否依赖于自噬途径。
1.4.3   载体构建   用PCR扩增人血红素加氧酶1(heme oxygenase 1，HMOX1)CDS序列，提取总RNA，克隆到pmdtm19-T载体上，并进行全序列测定，然后将HMOX1片段亚克隆到pcDNA3.1载体(赛默飞世尔科技有限公司，上海)的多克隆位点中，并通过DNA测序对其进行鉴定。

1.4.4   RT-qPCR   使用TRIzol试剂提取成骨细胞中的总RNA。运用反转试剂盒将总RNA反转录成cDNA。利用miScript SYBR Green 荧光定量PCR试剂盒进行实时定量PCR。RT-qPCR循环条件为95 ℃ 3 min，之后进行35个循环(95 ℃ 35 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s)，72 ℃ 10 min。引物序列如表1所示，GAPDH作为内参基因，并通过2-ΔΔCt方法分析基因的相对表达。

1.4.5   蛋白印迹分析   利用RIPA裂解缓冲液提取成骨细胞中的总蛋白，然后利用BCA蛋白测定试剂盒评估蛋白浓度。将30 μg的总蛋白在12%的SDS-PAGE上分离并转移到PVDF膜上。在室温下用体积分数5%牛血清白蛋白封闭1 h，用Anti-Bax抗体(1∶1 000，ab32503)、Anti-Bcl-2抗体(1∶1 000，ab32124)、Anti-LC3B抗体(1∶1 000，ab192890)、Anti-SQSTM1/p62抗体(1∶1 000，ab109012)、Anti-AMPK抗体(1∶1 000，ab32047)、Anti-p-AMPK抗体(1∶1 000，ab133448)和Anti-GAPDH抗体(1∶1 000，ab8245)在4 ℃孵育过夜。然后与特异性山羊抗鼠IgG(1∶1 000，ab150113)在室温下孵育2 h。采用ECL化学发光试剂盒使条带可视化，并通过化学发光成像系统拍照，Image J软件用于量化条带灰度值。
1.4.6   CCK-8分析   将处于对数生长期的细胞接种到96孔板中(1×103个/孔)，然后向每个孔中加入10 μL的CCK-8溶液，在37 ℃孵育4 h，然后使用酶标仪检测450 nm处的吸光度(A)，计算活细胞的数目。细胞活性(%) = (实验组A值 / 对照组A值) × 100%。
1.4.7   流式细胞术分析   收集细胞并用PBS洗涤2次，将100 μL的细胞悬液(1×109 L-1)转移到培养管中，然后在黑暗中与5 μL膜联蛋白V-FITC和5 μL碘化丙啶一起室温孵育20 min。最后，加入400 μL结合缓冲液，通过流式细胞仪测定凋亡细胞数。
1.4.8   ELISA检测   根据制造商的说明，采用ELISA试剂盒检测Caspase-3的活性，所有步骤均严格按照制造商的说明进行。
1.5   主要观察指标   ①细胞活力；②细胞凋亡率；③HMOX1 mRNA表达水平；④Bax、Bcl-2、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62、Atg5、Atg12、HMOX1、p-AMPK和AMPK蛋白表达水平；⑤Caspase-3活性。
1.6   统计学分析   采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，所有数据均表示为x±s。采用t检验进行两组之间的比较，单因素方差分析(ANOVA)进行多组之间比较。P < 0.05被认为差异有显著性意义。此文统计学方法已经河南中医药大学生物统计学专家审核。

骨稳态是由成骨细胞相关的骨形成和破骨细胞相关的骨吸收之间的平衡维持的[16]。最近，大量研究表明骨质疏松症是一种严重的退行性骨病，与成骨细胞凋亡增加有关[6]。糖皮质激素一般用于治疗免疫介导的疾病和过敏性疾病，但其使用也与骨密度减少对骨的不良影响密切相关[8]。有报道显示糖皮质类固醇给药后患者的臀部和脊柱出现骨折的风险增加[17]。HUANG等[18]的报道显示，50 mg/kg地塞米松处理SD大鼠4个月显著降低了大鼠的骨密度，诱导成骨细胞凋亡，导致骨质疏松的发生。随着医疗的技术不断发展和医疗体系的完善，糖皮质激素治疗带来的不良作用被明显降低，但迄今为止糖皮质激素导致的骨质疏松症在临床上依旧是一个值得关注的问题。因而，此次研究通过黄酮类化合物圣草素干预地塞米松诱导的成骨细胞，探究圣草素对糖皮质激素诱导的骨质疏松的影响。
圣草素是黄烷酮亚类中的类黄酮，广泛存在于柑橘类水果的果皮和一些中草药中。圣草素具有相当大的药用特性，预计可阐明各种细胞和分子途径中的作用模式[19]。现有研究表明圣草素具有多种生物活性，例如抗氧化、抗炎、抗癌、神经保护、心脏保护、抗糖尿病、抗肥胖、保肝等[13-14]。LI等[20]的研究显示圣草素通过调节维生素D受体介导的Nrf-2激活抑制铁死亡，改善APP/PS1小鼠的认知功能障碍。SHAN等[21]的研究显示圣草素通过抑制PI3K/AKT通路活化抑制胃癌进展。NISAR等[22]的研究显示圣草素通过抑制MAPK信号通路保护皮肤细胞免受长波紫外线辐射引起的光损伤。此外，SONG等[15]的报道显示圣草素通过抑制NFATc1活性抑制核因子ΚB受体激活因子诱导的破骨细胞形成和功能。在此次研究中，发现低浓度的圣草素对成骨细胞无毒性，且促进成骨细胞增殖；与此同时，还发现圣草素显著抑制地塞米松诱导的细胞凋亡，这一发现与已有报道相一致。
自噬参与调节骨代谢。例如，自噬负责去除成骨细胞中受损或过多的细胞器，并有助于细胞内营养物质的重新分配以满足生存所需的物质和能量[23-24]。因此，成骨细胞中有缺陷的自噬会导致显著的骨丢失，表现为成骨细胞凋亡增加、基质矿化减少和破骨细胞数量增加[24]。此外，研究发现成骨细胞自噬激活促进骨形成并缓解骨质疏松症。自噬激活剂可显著改善骨密度，阻止成骨细胞凋亡[12, 25]。CAO等[26]的研究发现海藻糖能够通过激活SIRT3介导的自噬，改善棕榈酸诱导的成骨细胞凋亡。VIDONI等[27]的研究发现自噬激活能够促进人牙龈间充质干细胞成骨分化。成骨细胞是骨重塑的基础，在骨代谢中起着至关重要的作用[4]。糖皮质激素引起的骨质疏松中成骨细胞凋亡与自噬的串扰已成为骨骼研究的热点问题。现有报道表明，糖皮质激素显著降低MC3T3-E1细胞中自噬相关标记蛋白的活性[28]。HUANG等[25]的研究显示，熊果苷通过激活MC3T3-E1细胞中的自噬来改善地塞米松诱导的细胞凋亡。ZHANG等[29]的研究显示，自噬抑制剂(3-MA)可显著抑制高糖诱导的MC3T3-E1细胞凋亡。因此，自噬和细胞凋亡之间微妙的相互作用对于调节成骨细胞稳态至关重要。此次研究表明，圣草素促进成骨细胞中自噬激活，抑制细胞凋亡，而自噬抑制剂3-MA通过抑制自噬促进地塞米松诱导的MC3T3-E1细胞凋亡，这一发现与现有关于自噬在成骨细胞凋亡中的报道相一致。
HMOX1是一种参与血管疾病、移植和炎症的重要酶，可催化血红素降解为一氧化碳和胆绿素。据报道，HMOX1的过表达会抑制破骨细胞生成[30]。LIN等[31]的报道显示HMOX1的上调抑制成骨细胞的成熟和矿化。在此次研究中发现圣草素促进成骨细胞中HMOX1的表达，而过表达HMOX1促进自噬，抑制地塞米松诱导的成骨细胞凋亡，这与LIN等[31]的报道相一致。AMPK是自噬调节中的一种关键激酶[32]。GUO等[33]的报道显示，二甲双胍可以显著增加成骨细胞中AMPK的磷酸化，通过AMPK/mTOR/p70S6K信号通路调控成骨细胞自噬减轻地塞米松诱导的细胞凋亡。在此次研究中发现，过表达HMOX1显著促进成骨细胞中AMPK的磷酸化，激活AMPK信号通路，抑制地塞米松诱导的成骨细胞凋亡。
总之，此次研究证明了圣草素可以通过上调HMOX1的表达激活AMPK信号通路，从而促进自噬，抑制地塞米松诱导的成骨细胞凋亡，圣草素具有治疗糖皮质激素诱导的骨质疏松症的巨大潜力。然而，此次实验仅在体外研究了圣草素对地塞米松诱导成骨细胞凋亡的作用，而骨质疏松症的发病机制涉及多个信号通路的调节和多个生物学过程的参与，而且体内是一个极其复杂的大环境，因此，圣草素是否真的能够在体内调节骨质疏松症的进展，还有待后续进一步研究。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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文题释义：

糖皮质激素诱导的骨质疏松症：是继发性骨质疏松症最常见的形式，主要特征是快速刺激骨吸收，持久抑制成骨细胞。
自噬：是真核生物中的一个基本细胞过程，涉及胞质成分在双膜结合自噬体内的螯合，随后与内溶酶体囊泡融合，导致螯合底物的降解和回收。自噬是一种高度保守的细胞内降解过程，用于消除真核生物中受损的细胞器、蛋白质聚集体和入侵病原体。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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